Многие ритмические биологические процессы контролируются с помощью молекулярных "часов", в которых один или несколько генов экспрессируются осцилляторным способом с определенным периодом (Oates et al., 2012; Zhang et al., 2014). Такие биологические часы участвуют в периодическом ветвлении корешков у Arabidopsis (Moreno-Risueno et al., 2010), в цикле линьки у Caenorhabditis elegans (Kim et al., 2013), в циркадных ритмах у всех дневных и ночных видов (Patke et al., 2020), в предопределении времени митозов, чтобы в точности регулировать пролиферацию и морфогенез тканей (Evans et al., 1983; Murray, 2004), и формирование паттерна во время сомитогенеза, фундаментального процесса развития позвоночных (Kageyama et al., 2012). В то время как некоторые осцилляторные сети, подобные Kai cyanobacterial циркадным часам и циркадным redox часам, управляются исключительно динамическими пост-трансляционными модификациями (Milev et al., 2018; Snijder & Axmann, 2019), др. генетические осцилляторы часто регулируются с помощью негативной петли обратной связи, в которой ген основного осциллятора кодирует репрессор транскрипции, который подавляет экспрессию нижестоящих осцилляторов, включая свой собственный ген; это в конечном итоге обеспечивает клеточно-автономный контроль генетических осцилляций (Bessho, Miyoshi, et al., 2001; Brend & Holley, 2009; Patke et al., 2020; Shimojo et al., 2008; Webb et al., 2016). В начале цикла экспрессии каждого гена промотор гена основного осциллятора активируется и продуцирует мРНК и белок с осцилляторного гена. Когда уровни осцилляторного белка увеличиваются и достигают критического порога, транскрипция осцилляторного гена подавляется, предупреждая дальнейшую продукцию мРНК и белка. Когда со временем осцилляторные мРНК и белок деградируют, репрессия транскрипции снимается, позволяя начинать следующий цикл экспрессии. В целом такая форма ауторегуляции может генерировать самоподдерживающуюся негативную петлю обратной связи (Bessho, Miyoshi, et al., 2001; Brend & Holley, 2009; Patke et al., 2020; Shimojo et al., 2008; Figure 1a). В то время как циркадные часы осциллируют с периодом в 24 ч, чтобы регулировать дневные ритмы большинства организмов и их систем органов (Patke et al., 2020; Reinke & Asher, 2019), ultradian часы с периодом менее 24 ч, подобно часам сегментации у позвоночных, могут регулировать цикл порядка минут и нуждаются в быстрой и мощной регуляции генов.



FIGURE 1 Negative feedback loops and somitogenesis. (a) Negative feedback loop autoregulation. Core oscillators, often encoding transcriptional repressors, participate in negative feedback loops to sustain autoregulatory genetic oscillations. Within each gene expression cycle, segmentation clock mRNA and protein are produced in increasing amounts, and increased protein levels correspond to decreased transcriptional activation as segmentation clock protein inhibits its own expression. As segmentation clock mRNA and protein are both degraded, repression of segmentation clock gene expression is released, allowing for another cycle of expression to begin. Collectively, this forms a self-sustained negative feedback loop. (b) Species-specific segmentation clock periods. Clock periodicity varies widely across vertebrates. However, the tempo of oscillations corresponds to the timing of somite formation in all species. The examples shown are classic hairy enhancer of split orthologs, but other genes also oscillate. The tempo of oscillations is determined by species-specific biochemical rates of gene expression. (c) Oscillating PSM cells receive positional information from anterior-posterior gradients. Core segmentation clock oscillators, like zebrafish her1, are expressed in the PSM and tailbud. As cells in the tailbud proliferate, the tailbud extends and cells become displaced into the posterior PSM. Once in the posterior PSM, cells initiate robust oscillatory gene expression. These cell-autonomous oscillations appear as traveling waves across the PSM from posterior to anterior (shown in blue), and are coordinated by Notch-mediated cell-cell communication. At the determination front, which is established by opposing Fgf/Wnt and retinoic acid signaling gradients, cells transition from a presomitic to a somitic cell state, and a new somite boundary is formed. Although negligible over just one oscillation, PSM size changes over developmental time, gradually shrinking as the tailbud ceases to proliferate and somite formation continues. Image created using Biorender.com

Сегментация или сомитогенез у позвоночных является критическим процессом развития, в результате которого эмбриональная мезодерма постепенно подразделяется на сегменты или сомиты вдоль оси голова-хвост у всех развивающихся эмбрионов позвоночных. Соматические клетки организуются, чтобы сформировать дермомиотом и склеротом, которые вместе формируют для зрелого ствола дерму, мышцы осевого скелета и позвоночный столб (Christ et al., 1978, 1986; Keynes & Stern, 1988). Последовательное образование сомитов управляется с помощью генетического осциллятора, наз. часы сегментации, который является сетью генов, которые iteratively продуцируют волны экспрессии в пресомитной мезодерме (PSM) для установления границ между соседними сомитами. Период сегментационных часов зависит от вида и варьируют среди позвоночных (рыбки данио, ~30 мин; цыплята, ~90 мин; мыши, ~2 ч; человек, ~4-5 ч; Matsuda, Hayashi, et al., 2020; Matsuda, Yamanaka, et al., 2020; Palmeirim et al., 1997), а основа сегментации, часы, являются репрессорами транскрипции, кодируемыми семейством генов Hes/her, чья экспрессия является осциллирующей у всех исследованных позвоночных (Bessho, Sakata, et al., 2001; Oates & Ho, 2002; Palmeirim et al., 1997) (Figure 1b). Hes/her гены обеспечивают клеточно-автономные часы осцилляции посредством ауторегуляторной петли негативной обратной связи, которая всеми рассматривается как эволюционно закрепленная единица, задающая ритм часам сегментации (Bessho, Sakata, et al., 2001; Oates & Ho, 2002; Palmeirim et al., 1997). Кроме того, др. канонические пути генов Notch, Wnt и Fgf также осциллируют в PSM и участвуют в инициации и синхронизации осцилляций часов сегментации, чтобы распространять волны экспрессии генов часов по PSM (Ay et al., 2014; Krol et al., 2011; Webb et al., 2016). Аналогично волнам экспрессии генов часов выступают "stadium wave", где "зрители", представленные индивидуальными клетками, генерируют скоординированные ритмические волны за счет кратких standing up (активация транскрипции), увеличения их продукции (продукции транскриптов и белков), подавления (репрессия транскрипции), и снижения их продукции (распад транскриптов/белков) с определенной периодичностью. У эмбрионов рыбок данио передача сигналов Notch и осцилляции генов, кодирующих лиганд Notch, подобно deltaC, помогают координировать фазы осцилляции соседних клеток (Delaune et al., 2012; Mara et al., 2007; Soza-Ried et al., 2014). Сходным образом, у кур и мышей в пути Notch ген Lunatic Fringe (LFNG/Lfng) осциллирует в PSM и является важным для синхронизации динамики часов сегментации и формирования паттерна передней части скелета (Okubo et al., 2012; Shifley et al., 2008). Подобно генам Notch пути, некоторые гены пути Fgf и Wnt экспрессируются периодически, посредством специфических генов, которые осциллируют в каждом из путей, варьируя между видами (Hubaud & Pourquie, 2014; Krol et al., 2011; Mara & Holley, 2007). У эмбрионов во время сегментации клетки пролиферируют в хвостовой почке и в конечном счете оказываются расположенными впереди задней части PSM (Kanki & Ho, 1997; Mara et al., 2007; Mara & Holley, 2007). Как только клетки оказываются в задней части PSM, то инициируется мощная, клеточно-автономная осцилляторная экспрессия генов часов сегментации. По мере увеличения хвостовой почки и формирования сомитов, клетки PSM клетки интерпретируют свой сдвиг в осевом положении относительно этих передних и задних меток (landmarks), используя противоположные сигнальные градиенты или "wavefronts": передача сигналов Fgf/Wnt, которая возникает кзади от хвостовой почки и передача сигналов ретиноевой кислоты, которая возникает впереди формирующихся сомитов. Вместе эти градиенты предоставляют динамичную позиционную информацию в клетки PSM (Aulehla & Pourquie, 2010; Hubaud & Pourquie, 2014). Пока недостаточно ясно, как контролируются периоды продолжительности молекулярных осцилляций в передней части PSM (Shih et al., 2015; Soroldoni et al., 2014). В области впереди от PSM, наз. "determination front", где уровни передачи сигналов как Fgf/Wnt, как и ретиноевой кислоты низки, клетки PSM переходят из пресомитного в сомитное состояние, молекулярные осцилляции прекращаются и зрелые сомиты отшнуровываются от PSM за счет образования границы сомита (Aulehla & Pourquie, 2010; Hubaud & Pourquie, 2014; Figure 1c).

Чтобы и молекулярные осцилляции могли регулировать время формирования сомитов, скорость каждой ступени осцилляции, от инициальной транскрипции и трансляции до распада, должно точно регулироваться Э чтобы гарантировать правильный размер и количества сомитов, продуцируемых в соотв. организме (Gomez et al., 2008; Holley et al., 2000; Keynes & Stern, 1988; Lewis, 2003; Matsuda, Hayashi, et al., 2020; Palmeirim et al., 1997; Schroter & Oates, 2010). Темп генетических осцилляций, необходимый для устойчивой периодичности часов д. быть исследован вычислительно и экспериментально, при этом скорости разных ступеней пути экспрессии генов, от транскрипции до сплайсинга, до трансляции и распада, как оказалось могут быть математически смеделированы и/или экспериментально изменены для определения относительного вклада каждой ступени периодичности часов (Ay et al., 2014; Giudicelli et al., 2007; Lewis, 2003). Вычислительные и моделирующие исследования предсказывают, что время задержки транскрипции и трансляции (количество времени от транскрипции или инициации трансляции до появления зрелых мРНК для белка, соотв.) а скорости деградации как транскриптов, так и белков являются параметрами, которые оказывают огромное влияние на периодичность часов (Ay et al., 2014; Giudicelli et al., 2007). Экспериментальные доказательства по оценке в исследованиях in vivo воздействия времени продукции мРНК, сплайсинга и синтеза белка и деградации белка в точности соответствуют in silico предсказаниям (Hirata et al., 2004; Hoyle & Ish-Horowicz, 2013; Palmeirim et al., 1997; Takashima et al., 2011). Считается, что регуляции только транскрипции недостаточно для возникновения генетических осцилляций. В реальном времени in vivo репортеры часов сегментации, предназначенные для воспроизведения динамики часов, должны не только содержать критические транскрипционные регуляторные регионы, которые управляют экспрессией осцилляции, но и должны также содержать признаки, обычно 3'UTR последовательность и белковые мотивы, которые дестабилизируют репортерные mRNAs и белки, соотв. (Aulehla et al., 2008; Delaune et al., 2012; Masamizu et al., 2006; Yoshioka-Kobayashi et al., 2020). Эти наблюдения подчеркнули, что множественные пост-транскрипционные регуляторные механизмы способствуют собственно осцилляторной экспрессии.

Дефекты в экспрессии генов часов сегментации, достаточные для нарушения периодичности часов на уровне тканей, могут привести к дефектам в формировании сомитов, что является фенотипическим показателем, обычно используемым в генетических и репортерных исследованиях, характеризующих молекулярные механизмы, регулирующие период часов. Потеря функции генов часов сегментации у многих видов позвоночных приводит к тяжелым дефектам сегментации, характеризующимся неровными границами сомитов и сросшимися позвонками и ребрами у молодых и взрослых животных (Bessho, Sakata, et al., 2001; Choorapoikayil et al., 2012; Henry et al., 2002). Врожденные дефекты скелета у человека, такие как спондилокостальный дизостоз, были связаны с мутациями в генах часов сегментации человека HES7, DLL3 и LFNG; таким образом, колебания часов сегментации являются критическими для организации мышц и осевого скелета (Bulman et al., 2000; Sparrow et al., 2006, 2008). В ранее опубликованных обзорах были всесторонне рассмотрены клеточные сигнальные пути и транскрипционная регуляция, участвующие в координации колебаний сегментационных часов (Hubaud & Pourquie, 2014; Kageyama et al., 2012; Oates, 2020; Oates et al., 2012). В данном обзоре мы представим текущее понимание пост-транскрипционных механизмов, регулирующих часы сегментации и выделим те из них, которые могут быть общими с другими процессами определения времени развития и осцилляторной экспрессии генов.

Стабильность, локализация и трансляция мРНК обычно регулируются цис-регуляторными элементами или структурными мотивами, присутствующими в не-транслируемых областях (UTR) мРНК (Jambor et al., 2015; Lau et al., 2010; Lecuyer et al., 2007; Sandberg et al., 2008; Vejnar et al., 2019; Wu & Bartel, 2017). Важно отметить, что транс-действующие факторы, связывающие элементы 3'UTR, могут влиять на судьбу мРНК в зависимости от сродства транс-фактора к мРНК и доступности других взаимодействующих факторов, входящих в большие, мультивалентные комплексы, которые работают согласованно для деградации, стабилизации, транслокации и/или регуляции трансляции мРНК (Arvola et al., 2020; Atasoy et al., 1998; Azuma-Mukai et al., 2008; Bulbrook et al., 2018; Chou et al., 2006; Enwerem et al., 2021; Landthaler et al., 2008; Moraes et al., 2006; Park-Lee et al., 2003; Pullmann et al., 2007). Многочисленные исследования, посвященные пост-транскрипционному контролю осциллирующих генов, продемонстрировали важность регуляции, опосредованной 3' UTR, выявив специфические цис-элементы и потенциальные транс-факторы, которые модулируют стабильность транскрипта осциллирующих генов. Быстрый клиренс мРНК имеет решающее значение для сохранения генетических осцилляций, а изучение роли специфических регуляторных мотивов в 3'UTRs мРНК осциллирующих генов помогает определить пост-транскрипционные механизмы, способствующие молекулярным осцилляциям.

Для анализа динамики экспрессии мРНК сегментационных часов в нескольких генетических модельных системах позвоночных (Davis et al., 2001; Gallagher et al., 2017; Hilgers et al., 2005; Nitanda et al., 2013; Riley et al., 2013; Tietz et al., 2020; Wahi et al., 2017) были проведены репортерные исследования 3'UTRs транскриптов сегментационных часов. Впервые это было продемонстрировано на эмбрионах Xenopus laevis для гена часов сегментации hairy2a, когда экспрессионные паттерны, создаваемые репортерными конструкциями, содержащими различные регионы гена hairy2a, были проанализированы для выявления минимальных регионов, необходимых для рекапитуляции эндогенного полосатого паттерна экспрессии hairy2 (Davis et al., 2001). Результаты этих экспериментов показали, что 3'UTR гена hairy2a необходим для восстановления эндогенной экспрессии и быстрого распада репортерных транскриптов. Аналогичные результаты были получены у эмбрионов рыбок данио, мышей и цыплят (Kawamura et al., 2016; Riley et al., 2013; Tietz et al., 2020; Wahi et al., 2017), а более поздние исследования выявили специфические цис-регуляторные элементы в 3'UTR генов сегментационных часов, которые влияют на стабильность транскрипта (Riley et al., 2013; Tietz et al., 2020; Wahi et al., 2017). Эти исследования мотивируют будущие эксперименты, направленные на оценку роли конкретных регуляторных факторов мРНК на распад и трансляцию мРНК сегментационных часов и, таким образом, на темп генетических осцилляций.

миРНК - это хорошо описанные малые не-кодирующие молекулы РНК, которые негативно регулируют экспрессию генов, способствуя распаду мРНК и/или подавляя трансляцию целевого транскрипта (Behm-Ansmant et al., 2006; Naeli et al., 2022; Pillai et al., миРНК-опосредованная регуляция была вовлечена в широкий спектр процессов развития, включая переход от матери к зиготе у эмбрионов рыбок данио и Xenopus (Giraldez et al., 2006; Lund et al., 2009), дифференцировку мышц (Goljanek-Whysall et al., 2011) и развитие многочисленных систем органов (Ason et al., 2006; Bhaskaran et al., 2009; Zhao et al., 2007). В предыдущих исследованиях изучалась роль регуляции сегментационных часов, опосредованной миРНК, путем выявления миРНК, экспрессирующихся в PSM развивающихся эмбрионов, и анализа экспрессии репортерных генов, содержащих гены сегментационных часов, в присутствии и отсутствии определенных миРНК (Riley et al, 2013; Wahi et al., 2017). miR-125a-5p экспрессируется в PSM эмбрионов цыпленка и мыши, а сайты связывания для seed-последовательности miR-125a-5p присутствуют в 3'UTR гена осцилляторных часов Lunatic fringe (Lfng; Riley et al., 2013; Wahi et al., 2017). Экспрессия репортерного гена, содержащего 3'UTR Lfng цыпленка или мыши, сильно снижалась после экзогенной избыточной экспрессии miR-125a-5p, и этот эффект исчезал при мутации предполагаемых сайтов связывания miR-125 в обоих 3'UTR (Riley et al., 2013). У эмбрионов цыплят морфолино-опосредованная интерференция взаимодействия miR-125a-5p:LFNG 3'UTR (Choi et al., 2007) привела к дефектам в формировании сомитов и осцилляторной экспрессии эндогенных генов часов сегментации (Riley et al., 2013). Удивительно, но CRISPR/Cas9-мутагенез miR-125a-5p в эмбрионах мыши не оказал никакого влияния на осцилляторную экспрессию эндогенных генов сегментационных часов, а гомозиготные мутантные эмбрионы были морфологически дикого типа (Wahi et al., 2017). В совокупности эти данные позволяют предположить, что, хотя miR-125a-5p способна регулировать стабильность мРНК Lfng, близкородственные миРНК или другие транс-действующие факторы могут компенсировать потерю функции miR-125a-5p и связывать Lfng 3'UTR для регулирования распада транскрипта. Хотя точная роль miR-опосредованной регуляции не до конца понятна, вычислительные модели предполагают, что miR-125a-5p-зависимый распад важен для минимизации колебаний и точной настройки осциллирующей экспрессии Lfng (Jing et al., 2015). Будущая экспериментальная работа по оценке влияния мутирования последовательностей затравки миРНК в эндогенном 3 UTR Lfng позволит выяснить влияние регуляции, опосредованной миРНК, на экспрессию Lfng и сегментацию позвоночных.

Осцилляторная экспрессия Hes/her также вовлечена в регуляцию нейрогенеза, при этом осцилляторная экспрессия гена Hes1 млекопитающих поддерживает мультипотентную судьбу нейронных предшественников и способствует пролиферации нейрональных стволовых клеток (Shimojo et al., 2008). Во время дифференцировки нейронов колебания Hes1 прекращаются путем снижения экспрессии Hes1, что способствует экспрессии пронейральных генов (Hatakeyama et al., 2004; Ohtsuka et al., 1999), а анализ 3'UTR показал, что миРНК-опосредованный распад мРНК важен для регуляции экспрессии Hes1 в различных моделях животных. В частности, делеция последовательности, комплементарной последовательности miR-9, в 3'UTR-содержащем репортерном гене люциферазы мыши Hes1, который соответствует эндогенной осцилляторной экспрессии Hes1, значительно увеличила экспрессию белка люциферазы и уменьшила количество осцилляций репортерного гена по сравнению с репортерами, несущими последовательность 3'UTR Hes1 дикого типа (Bonev et al., 2012). Кроме того, прямое вмешательство между miR-9 и эндогенной последовательностью затравки Hes1 3'UTR miR-9 с помощью олигонуклеотидов, связывающих 3'UTR, увеличивало уровень эндогенной мРНК Hes1, в то время как экспрессия miR-9 не затрагивалась (Bonev et al., 2012). Более того, избыточная экспрессия miR-9 оказала ослабляющее действие на эндогенную осцилляторную экспрессию Hes1 в мышиных нейрональных клетках предшественниках. Затухание осцилляторной экспрессии Hes1 в конечном итоге приводит к усилению экспрессии пронейральных генов, вызывая преждевременную дифференцировку нейронов (Ishibashi et al., 1995; Tan et al., 2012). Было показано, что избыточная экспрессия и подавление экспрессии miR-9 нарушает осцилляторную экспрессию her6 рыбок данио и hairy1 Xenopus (гены, связанные с волосами) в нейрональных клетках предшественниках каждого вида (Bonev et al., 2011; Soto et al., 2020), это указывает на то, что регуляция, опосредованная miR-9, является высоко консервативной и важной для устойчивой осцилляторной экспрессии генов поддержания нейрональных стволовых клеток.

Для обеспечения автономной осцилляторной экспрессии белок HES1, помимо репрессии собственной экспрессии, также репрессирует транскрипцию pri-miR-9, образуя двойную отрицательную петлю обратной связи (Bonev et al., 2012). В результате пиковые уровни белка HES1 соответствуют низкой транскрипции pri-miR-9, и наоборот, экспрессия pri-miR-9 высока, когда уровень белка HES1 самый низкий, это приводит к противофазной осцилляторной экспрессии между транскриптами белка HES1 и pri-miR-9. Таким образом, Hes1 и pri-miR-9 осциллируют вне фазы, что, в свою очередь, поддерживает судьбу нейронных предшественников. В PSM мыши и цыпленка зрелая miR-125a-5p экспрессируется равномерно по всей PSM, это позволяет предположить, что эта miR не экспрессируется осциллирующим образом (Riley et al., 2013). Однако известно, что многие зрелые миРНК обладают относительно высокой стабильностью, тогда как первичные миРНК считаются короткоживущими промежуточными продуктами (Gantier et al., 2011). Это наблюдается для зрелой miR-9, которая постепенно накапливается в течение нескольких циклов транскрипционной активации pri-mir-9 и, как предполагается, достигает критического порога, чтобы обеспечить точное ингибирование экспрессии Hes1 во время дифференцировки нейронов (Bonev et al., 2012). Таким образом, было бы интересно определить, действительно ли pri-miR-125a транскрибируется осцилляторным образом, что позволит прояснить механизм осцилляторной экспрессии Lfng, опосредованной miR-125a-5p.

Несмотря на влияние избыточной экспрессии и истощения миРНК на Lfng и другие транскрипты осциллирующих генов, регуляция, опосредованная миРНК, не является универсальной ни для всех мРНК сегментационных часов, ни для всех видов позвоночных. В клетках, экспрессирующих репортерный ген люциферазы, содержащий 3'UTR мышиного Hes7, избыточная экспрессия mir-125a-5p не влияет на уровни мРНК или белка люциферазы, по сравнению с изменениями экспрессии, наблюдаемыми при использовании 3'UTR Lfng (Riley et al., 2013). Это указывает на то, что различные мРНК генов сегментационных часов подвержены различным механизмам посттранскрипционной регуляции. Более того, несмотря на наличие предсказанных сайтов-мишеней миРНК в 3'UTR гена her1 рыбок данио, эмбрионы с дефицитом Dicer-зависимого процессинга миРНК имеют нормальный паттерн экспрессии her1 (Gallagher et al., 2017). Более широкое исследование дополнительных пост-транскрипционных регуляторных факторов, таких как РНК-связывающие белки, о которых пойдет речь ниже, позволит еще больше прояснить молекулярные механизмы, участвующие в поддержании генетических осцилляций во время развития.

Экспрессия транскриптов осциллирующих генов динамична. Поскольку транскрипты многократно и быстро транскрибируются и деградируют, различение вновь транскрибированных мРНК от мРНК, которые активно транслируются или были помечены для распада, становится серьезной проблемой, особенно в лизатах целых эмбрионов. Таким образом, анализ стабильных уровней мРНК сегментационных часов может запутать интерпретацию осциллирующей динамики транскриптов генов. Появление методов культивирования клеток PSM позвоночных, при которых стволовые клетки дифференцируются в клетки PSM или эксплантов PSM, которые культивируются in vitro, может позволить в будущем использовать такие методы, как ядерный или транскрипционный run-on assays в сочетании с транскрипционными ингибиторами для измерения скорости распада мРНК сегментационных часов (Diaz-Cuadros et al., 2020; Hubaud et al., 2017; Matsuda, Yamanaka, et al., 2020; Webb et al., 2014). Однако анализ динамики транскриптов генов часов сегментации в целых эмбрионах с помощью химических ингибиторов может быть затруднен (1) плохим проникновением или трудной доставкой транскрипционных ингибиторов в сегментированные эмбрионы и (2) быстрым характером осцилляторной экспрессии, особенно у рыбок данио, в масштабе времени, не поддающемся обработке ингибиторами, которые могут потребовать 24 часа обработки для эффективного ингибирования транскрипции. Таким образом, использование индуцибельных репортерных анализов оказалось полезным для изучения механизмов, регулирующих распад транскрипта часов сегментации, поскольку быстрая и специфическая индукция и ингибирование репортерной мРНК в целых эмбрионах позволяет преодолеть потенциальные вторичные эффекты, возникающие при глобальном ингибировании транскрипции (рис. 2а).



FIGURE 2 In vivo reporter assays and 3?UTR deletion analysis. (a) Inducible reporter systems and measuring mRNA decay rates. Inducible reporter assays are utilized to measure and compare reporter transcript stability in the context of varied 3?UTR sequences. Depending on the promoter sequence used, these constructs can be chemically or heat shock-induced in segmenting embryos, when the appropriate segmentation clock transcript regulatory factors are expressed. To calculate reporter transcript decay rates, RNA is extracted from embryos collected at regular intervals post-induction and reporter mRNA is subsequently quantified across time points using real-time PCR. (b) 3'UTR fragmentation and reporter transcript decay analysis. Because 3'UTR sequences are rich in motifs that may or may not influence stability, the generation of a set of reporters containing varying portions of a 3'UTR can help to identify smaller regions that influence reporter stability. Upon identification of minimal regions that influence reporter stability, motif analysis followed by mutagenesis of potential regulatory elements can uncover miRNA and/or RBP binding sites that are the primary regulators of mRNA stability. Image created using Biorender.com

Индуцибельные репортеры часов сегментации впервые были введены в эмбрионы цыплят с помощью системы Tet-Off (Gossen et al., 1995; Hilgers et al., 2005). С помощью этого метода было замечено, что 3'UTR LFNG цыпленка обеспечивает быструю деградацию транскрипта, это наблюдается и для Lfng мыши (Nitanda et al., 2013). Ранние исследования динамики репортеров часов сегментации in vivo основывались на электропорации индуцибельных репортерных конструкций Tet-Off в сегментированные эмбрионы с последующим количественным определением репортеров после индукции. Переходное введение репортерных конструкций подвержено изменчивости из-за мозаицизма, поэтому недавно были разработаны трансгенные линии, несущие стабильно интегрированные репортерные конструкции у рыбок данио для более точной количественной оценки времени полураспада мРНК, обеспечиваемого 3'UTRs her1 и dlc рыбок данио в сегментирующихся эмбрионах (Tietz et al., 2020). Эти эксперименты показали, что оба 3'UTR транскрипта вызывают быструю деградацию репортерных транскриптов, что согласуется с результатами анализа 3'UTR, проведенного у других позвоночных (Davis et al., 2001; Nitanda et al., 2013; Riley et al., 2013), и позволяет предположить, что в 3'UTR транскрипта часов сегментации находятся сильные дестабилизирующие цис-регуляторные элементы.

РНК-связывающие белки (RBPs), которые связываются со своими когнитивными связывающими элементами в 3'UTRs, могут рекрутировать белковые комплексы, которые модулируют стабильность и трансляцию мРНК (Casolaro et al., 2008; Chou et al., 2006; Pullmann et al., 2007; Shyu et al., 1991; Vasudevan & Steitz, 2007). Мотивы РНК-связывающих белков широко распространены в последовательностях 3'UTR, поэтому разделение полноразмерного 3'UTR на более мелкие регионы для функционального репортерного анализа позволяет выявить критические элементы, необходимые и достаточные для содействия распаду мРНК (рис. 2b).

Используя эту стратегию делеции her1 3'UTR для создания линий, несущих стабильно интегрированные индуцибельные репортерные конструкции, было обнаружено, что последние 179 нт полноразмерного 725 нт her1 3'UTR необходимы и достаточны для быстрой дестабилизации репортерских транскриптов (Tietz et al., 2020). Сравнение последних 179 нт 3'UTR her1 и полноразмерных 3'UTR dlc и her7 на наличие мотивов РНК-связывающих белков-кандидатов показало, что AU-богатые элементы (AREs) и элементы ответа Pumilio (PREs) были общими для всех трех 3'UTR транскриптов. Важно отметить, что эти элементы отсутствуют в тех областях 3'UTR her1, которые не обладают активностью, способствующей распаду, в репортерных анализах. Оба мотива связаны с хорошо описанными негативными регуляторами экспрессии мРНК, которые часто способствуют распаду и подавляют трансляцию своих целевых транскриптов (Arvola et al., 2020; Bulbrook et al., 2018; Enwerem et al., 2021). AU-богатые связывающие белки (ARE-BPs) представляют собой большое семейство RBPs, которые могут как стабилизировать, так и способствовать распаду мРНК-мишеней (Chou et al., 2006; Vasudevan & Steitz, 2007), а в случае распада, как было показано, ARE-BPs рекрутируют специфических членов комплекса CCR4-Not (CNOT) для инициирования деаденилирования своих целевых транскриптов (Lai et al., 2003). Хорошо изученные дестабилизирующие ARE-BPs включают ARE/poly (U)-связывающие/деградирующие факторы 1 (AUF1), тристетрапролин (TTP) и регуляторный белок сплайсинга KH-типа (KSRP; Briata et al., 2005; Gratacos & Brewer, 2010; Lykke-Andersen & Wagner, 2005; Sanduja et al., 2011). Подобно ARE-связывающим белкам, белки Pumilio также регулируют стабильность мРНК путем рекрутирования комплекса CNOT на 3'UTRs целевого транскрипта (Arvola et al., 2020; Enwerem et al., 2021; Goldstrohm et al., 2006; Joly et al., 2013; Van Etten et al., 2012; Weidmann et al., 2014). Одиночная мутация ARE или PRE в репортере her1 3'UTR умеренно стабилизировала транскрипты репортера, тогда как мутация обоих элементов резко стабилизировала транскрипты репортера и привела к более, чем 8-кратному увеличению периода полураспада по сравнению с не-модифицированным полноразмерным репортером her1 3'UTR (Tietz et al., 2020). Результаты репортерных анализов показывают, что ARE и PRE кооперативно способствуют распаду и что как ARE, так и PRE-опосредованный распад имеет решающее значение для нормальной пост-транскрипционной регуляции her1.

RBP-опосредованная пост-транскрипционная регуляция вовлечена в несколько процессов развития, а неправильная регуляция функции RBP может привести к резким дефектам развития (Brinegar & Cooper, 2016; Colegrove-Otero et al., 2005; Dash et al., 2016; Giudice & Cooper, 2014; Prashad & Gopal, 2021). Функция Pumilio является критической во время эмбрионального развития мыши, и потеря функции Pum1 или Pum2 приводит к дефектам нейрогенеза (Siemen et al., 2011; Zhang et al., 2017), а двойной нокаут Pum1/Pum2 приводит к эмбриональной летальности во время гаструляции (Lin et al., 2018), что исключает анализ потребности в PUM во время сегментации. Поскольку домен связывания РНК, или гомологичный домен Pumilio, высоко консервативен среди многих видов, проанализированных на сегодняшний день, от дрозофилы, до рыб и млекопитающих, и связывается со специфической, четко определенной последовательностью PRE, кандидаты PUM-регулируемые мРНК могут быть биоинформационно предсказаны по наличию мотивов PRE (Goldstrohm et al., 2018). В отличие от этого, ARE-BP могут распознавать различные AU-богатые последовательности, отличные от определенной канонической ARE, и поэтому их труднее предсказать биоинформационно. Многие гены суперсемейства ARE-BP экспрессируются во время эмбриогенеза у всех позвоночных (Briggs et al., 2018; Collins et al., 2019; White et al., 2017), а исследования потери функции у мышиных эмбрионов продемонстрировали необходимость множества ARE-BP для правильного развития нескольких тканей и систем органов (Beck et al., 1998; Bell et al., 2006; Katsanou et al., 2009; Stumpo et al., 2009). Более того, ортологи многих ARE-BP-кодирующих генов экспрессируются в PSM у многих видов позвоночных, что позволяет предположить, что ARE-BP могут играть консервативную регуляторную роль в экспрессии генов сегментарных часов (табл. 1). Интересно отметить, что в 3'UTR LFNG цыпленка, мыши и человека присутствует по крайней мере один канонический ARE (UAUUUAU), причем 3'UTR LFNG цыпленка содержит два ARE (Hilgers et al., 2005). Хотя это сходство может указывать на потенциальные общие механизмы контроля распада мРНК сегментационными часами, различия в силе и количестве мотивов в 3'UTR часовых транскриптов разных видов могут способствовать наблюдаемым различиям в скорости распада мРНК. В соответствии с этой идеей, недавние массовые параллельные анализы репортеров показали, что присутствие и количество ARE и PRE часто ассоциируется с быстрым распадом транскрипта в других контекстах (Rabani et al., 2017; Siegel et al., 2022). Интересно рассмотреть, вносят ли присутствие и сила дестабилизирующих 3'UTR-элементов в транскриптах генов сегментационных часов вклад в видоспецифические периоды осцилляций.

TABLE 1. ARE-BP expression in vertebrate PSMs or cultured PSM cells

Репортерные исследования позволили углубить наше понимание молекулярных механизмов, важных для 3'UTR-зависимой регуляции мРНК. Однако не до конца понятно, влияет ли нарушение 3'UTR-опосредованной пост-транскрипционной регуляции транскриптов часов сегментации в отношении периодичности часов и сомитогенеза. Этот вопрос был случайно решен в одном исследовании с использованием мышиных эмбрионов, первоначально проведенном для изучения эффекта увеличения транскрипционной задержки Hes7 путем удлинения гена (Fujimuro et al., 2014). Knock-in экзогенного фрагмента ДНК размером 10 kb из интрона человека в локусе, расположенном чуть ниже по течению от эндогенного стоп-кодона Hes7 и непосредственно перед 3'UTR Hes7, нарушил осцилляторную экспрессию мРНК Hes7 и сильно снизил уровень белка Hes7 в мышиных эмбрионах, гомозиготных по данной инсерции. У гомозиготных мутантных новорожденных также наблюдались сегментарные дефекты позвонков и ребер, аналогичные фенотипам, наблюдаемым у мышей с нулевым Hes7 (Bessho, Sakata, et al., 2001). Однако при дальнейшем изучении аллеля knock-in было обнаружено, что вставленный человеческий интрон сохраняется в зрелых транскриптах Hes7 и приводит к преждевременному полиаденилированию внутри сохраненного человеческого интрона, в результате чего образуется транскрипт Hes7, лишенный эндогенного 3'UTR. Замена эндогенного 3'UTR Hes7 на экзогенную человеческую последовательность привела к снижению мРНК Hes7 на 30% и почти не-обнаружимому уровню белка HES7 (Fujimuro et al., 2014), что позволяет предположить, что потеря критических регуляторных элементов в 3'UTR Hes7 препятствует правильной осцилляторной экспрессии Hes7 и формированию сомитов. Более конкретно, миРНК и/или RBPs, необходимые для уточнения осцилляторной экспрессии мРНК, не могли бы способствовать распаду или регулировать трансляцию, что привело бы к нарушению контура отрицательной обратной связи. Внесение мотив-специфических мутаций в эндогенные последовательности 3'UTR и анализ экспрессии мРНК и белков сегментационных часов позволит более непосредственно определить роль цис-регуляторного элемента, зависящего от регуляции мРНК, в темпе осцилляций часов.

На последних этапах жизни мРНК в эукариотических клетках трансляция прекращается, и происходит деградация транскрипта путем эндонуклеолитического расщепления (направляемого малыми РНК, такими как миРНК и siRNAs; Gu et al., 2018) или процессинга 3' и 5' концов, за которым следует экзонуклеолитическая деградация. Деаденилирование широко рассматривается как лимитирующий по скорости и первый шаг в зависимом от деаденилирования распаде мРНК, за которым вскоре следует либо 3'-5'-экзонуклеолитический распад экзосомой, либо, что более распространено, удаление 5'm⁷G-cap и 5'-3'-экзонуклеолитическая деградация. Xrn1-опосредованный экзонуклеолитический распад (Muhlrad et al., 1994; Yamashita et al., 2005; Zheng et al., 2008). Оба эти процесса, если бы они протекали беспрепятственно и без посторонней помощи, происходили бы со скоростью, определяемой только длиной поли (А) хвоста и относительной силой взаимодействия белков комплекса decapping и деаденилирования с мРНК (Steiger et al., 2003). Однако для транскриптов, нацеленных на быстрый распад, специфические активаторы и РНК-связывающие белки способствуют быстрому обороту транскрипта путем рекрутирования или повышения активности комплексов декапирования и деаденилирования (Fenger-Gron et al., 2005; Muhlrad et al., 1994; Nissan et al., 2010; Shyu et al., 1991). Действительно, избыточная экспрессия доминантно-отрицательной формы Cnot7, члена комплекса деаденилазы CCR4-NOT, в эмбрионах рыбок данио нарушает осцилляторную экспрессию транскрипта сегментационных часов и формирование сомитов (Fujino et al., 2018). В связи с динамической экспрессией транскриптов сегментационных часов можно предположить, что активаторы распада мРНК или факторы, изолирующие мРНК от механизмов трансляции, вероятно, важны для поддержания нормальной периодичности часов. Несколько таких факторов, описанных ниже, были идентифицированы и охарактеризованы с точки зрения их роли в пост-транскрипционной регуляции часов сегментации.

РНК-связывающий белок Celf1 (CUGBP [CUG binding protein] Elav-like Family Member 1), также известный как Embryo Deadenylation ElemeNt Binding Protein (EDEN-BP), является активатором деаденилирования и, как известно, способствует быстрому распаду мРНК целевых транскриптов (Рисунок 3; Cibois et al., 2010, 2013; Gautier-Courteille et al., 2004; Moraes et al., 2006; Rattenbacher et al., 2010). Он преимущественно связывается с GU-богатыми элементами, но было показано, что он также может связывать AU-богатые элементы (Moraes et al., 2006; Paillard et al., 2002; Vlasova et al., 2008). Потеря активности Celf1 резко увеличивает обилие полиаденилированных ARE-содержащих Celf1-мишеней мРНК in vitro, вероятно, из-за прямого взаимодействия между Celf1 и деаденилазой поли (A)-специфической рибонуклеазой (PARN; Moraes et al., 2006). У эмбрионов Xenopus Celf1-зависимое деаденилирование активно во время раннего эмбриогенеза, а экспрессия Celf1 обогащена в параксиальной мезодерме и PSM во время сомитогенеза (Gautier-Courteille et al., 2004). Эксперименты по УФ-сшивке in vitro и in vivo показали, что белок Celf1 напрямую связывает 3'UTR rbpj [рекомбинационный сигнальный связывающий белок для области иммуноглобулина каппа J, также известный как супрессор безволосости, su (H)] (Gautier-Courteille et al, 2004). rbpj, который не осциллирует, является важным модулятором экспрессии генов часов сегментации у Xenopus, а сегментация нарушается при прямой интерференции взаимодействия мРНК Celf1:rbpj (Cibois et al., 2010). 3'UTR rbpj обеспечивает быстрое Celf1-зависимое деаденилирование репортерных транскриптов, а морфолино-опосредованный нокдаун celf1 у эмбрионов Xenopus повышает стабильность эндогенной мРНК rbpj (Gautier-Courteille et al., 2004). В отличие от этого, осциллирующие гены ксенопуса hairy2a и esr9 не являются прямыми мишенями для Celf1, это позволяет предположить существование других механизмов распада транскриптов с помощью сегментационных часов для коллективного продвижения осцилляций мРНК сегментационных часов.



FIGURE 3 Activators of deadenylation promote rapid mRNA decay. Both CELF1/EDEN-BP and ZFP36 proteins promote deadenylation-dependent decay by binding 3?UTRs of target transcripts and recruiting deadenylation factors. CELF1/EDEN-BP has been shown to directly bind transcript 3?UTRs and recruit the polyA ribonuclease (PARN) to promote rapid transcript deadenylation in Xenopus embryos. Additionally, ZFP36 proteins bind AU-rich elements within transcript 3?UTRs and promote deadenylation through recruitment of PARN or the CCR4-NOT complex via CNOT9. Both RNA binding proteins have been shown to regulate segmentation clock transcript stability, and further biochemical evidence will determine whether these precise interactions are also important in the context of segmentation clock transcript deadenylation and decay. Image created using Biorender.com

Один из классов ARE-связывающих белков, кодируемых семейством генов zfp36 (факторы, также известные как TTP или Tis-11), как было установлено, негативно влияет на экспрессию осцилляторных генов esr5 и hairy2a и нарушает формирование сомитов при избыточной экспрессии в эмбрионах Xenopus (Treguer et al., 2013). Известно, что человеческий ZFP36 и родственные ему белки ZFP36L1 и ZFP36L2 непосредственно связывают мРНК и подавляют трансляцию, способствуя от деаденилирования зависимому распаду мРНК (Carballo et al., 2000; Moore et al., 2018; Mukherjee et al., 2014). ZFP36 может способствовать деаденилированию через рекрутирование комплекса деаденилазы CNOT, через прямое взаимодействие с CNOT9 или рекрутирование и активацию PARN (рис. 3; Bulbrook et al., 2018; Lai et al., 2003). Прямое взаимодействие также наблюдалось между ZFP36 человека и факторами декапирования DCP1A и DCP2, и это взаимодействие усиливает декапирование ARE-содержащих мРНК in vitro (Fenger-Gron et al., 2005). Важно отметить, что в отличие от дефектов сегментации, возникающих при избыточной экспрессии zfp36, нокдаун экспрессии zfp36 у эмбрионов Xenopus с помощью морфолино не вызывает явных дефектов сегментации (Treguer et al., 2013), и это может быть связано с избыточными функциями других RBP и/или неполным нокдауном zfp36. Тем не менее, интересно рассмотреть влияние Zpf36-опосредованного оборота транскриптов часов сегментации, и могут ли другие РНК-связывающие белки действовать параллельно, чтобы усилить деаденилирование и способствовать распаду мРНК.

У эмбрионов дикого типа в PSM в определенный момент времени наблюдается паттерн в виде полос экспрессии мРНК часов сегментации, который возникает из-за скоординированных колебаний соседних клеток вдоль передне-задней оси. В ходе прямого генетического скрининга, проведенного у рыбок данио для выявления регуляторов экспрессии генов сегментационных часов, был обнаружен аллель дефицита tortuga, который в гомозиготном состоянии проявляет дефекты в экспрессии транскриптов сегментационных часов her1, her7, dlc и других транскриптов, связанных с сегментационными часами (Dill & Amacher, 2005). Вместо типичной полосатой экспрессии у эмбрионов мутанта tortuga наблюдается равномерная экспрессия мРНК her1 и dlc по всему PSM. Этот фенотип аномальной экспрессии возникает из-за дефекта в клиренсе транскриптов часов сегментации, который происходит при потере функции пролин-богатого коактиватора ядерного рецептора 2 (pnrc2), гена, удаленного при дефиците tortuga (Gallagher et al., 2017). В культивируемых клетках человека PNRC2 был описан как посредник между комплексами нонсенс-опосредованного распада мРНК (NMD) и расщепления мРНК, в частности, через взаимодействие с фактором NMD UPF1 и белком комплекса расщепления DCP1A (Cho et al., 2009, 2013, 2015; Lai et al., 2012; Mugridge et al., 2016). Области белка PNRC2 человека, важные для взаимодействия PNRC2:DCP1A и PNRC2:UPF1, демонстрируют высокую консервацию последовательности с Pnrc2 рыбок данио (Gallagher et al., 2017). В культуре клеток человека специфические мутации в областях, кодирующих консервативный домен SRC-гомологии (SH3) и NR-box человеческого PNRC2, нарушают связывание с DCP1A и UPF1, соответственно, что, в свою очередь, приводит к стабилизации репортерной мРНК (Lai et al., 2012). Аналогично, эксперименты по спасению показали, что экспрессия Pnrc2 рыбок данио, содержащего ортологичные мутации в домене SH3 и NR-box, не устраняет дефекты экспрессии her1 при введении в мутантные эмбрионы pnrc2, в отличие от Pnrc2 дикого типа, который полностью восстанавливает экспрессию her1 дикого типа в мутантных эмбрионах pnrc2 (Tietz et al., 2020). Морфолино-опосредованное истощение upf1 усиливает эффект истощения pnrc2 на экспрессию her1, предполагая, что Upf1 облегчает Pnrc2-опосредованный распад (Gallagher et al., 2017). Однако необходимы дополнительные биохимические данные, чтобы подтвердить, требуется ли прямое взаимодействие между Pnrc2 и другими факторами процессинга и распада мРНК для распада транскрипта с помощью часов сегментации.

Хотя потеря Pnrc2-зависимого распада мРНК сегментационных часов у эмбрионов рыбок данио повышает стабильность и численность транскрипта, соответствующие уровни белка, по-видимому, не увеличиваются по сравнению с эмбрионами дикого типа (Gallagher et al., 2017; Tietz et al., 2020). В соответствии с нормальной экспрессией белка часов сегментации, мутантные эмбрионы pnrc2 формируют нормальные сегменты, несмотря на избыток мРНК her1, в отличие от более ранних исследований избыточной экспрессии her1, которые приводили к дефектам формирования сомитов (Giudicelli et al., 2007; Takke & Campos-Ortega, 1999). Экзогенная избыточная экспрессия мРНК her1 посредством микроинъекции или индукции теплового шока (Giudicelli et al., 2007; Takke & Campos-Ortega, 1999) может перегрузить механизм распада мРНК и/или трансляционной репрессии, что приведет к увеличению трансляции белка часов сегментации и нарушению периодичности часов. Кроме того, неясно, содержат ли экзогенно экспрессированные транскрипты her1 полный набор цис-элементов, необходимых для полной рекапитуляции пост-транскрипционной регуляции эндогенного her1. Напротив, накопление эндогенных транскриптов her1 в результате потери Pnrc2-опосредованного распада мРНК указывает на важность трансляционной регуляции транскриптов часов сегментации. Выяснение статуса трансляции и состояния полиаденилирования накопленных транскриптов в мутантных эмбрионах pnrc2 позволит определить, существуют ли стабилизированные транскрипты как промежуточные продукты распада или активно трансляционно репрессируются еще не идентифицированными трансляционными регуляторными факторами.

Для того чтобы осцилляции сегментационных часов поддерживались, белки, кодируемые основными генами сегментационных часов, должны быстро деградировать, чтобы поддерживалась осцилляторная экспрессия, опосредованная петлей отрицательной обратной связи (Hirata et al., 2004). Важность нестабильности белка HES7 в часах сегментации мыши была продемонстрирована на мышиных эмбрионах, экспрессирующих мутантный белок HES7, который имеет увеличенный период полураспада, но в остальном функционирует как белок HES7 дикого типа (Hirata et al., 2004). Мышиные эмбрионы, экспрессирующие мутант Hes7, демонстрировали нормальные колебания во время раннего сомитогенеза; однако после формирования 3-4 нормальных сомитов у мутантных эмбрионов происходило слияние сомитов, что совпадало с дефектами экспрессии мРНК и белков генов сегментационных часов. На молекулярном уровне можно было бы предсказать, что стабилизация белка сегментационных часов продлит транскрипционную репрессию транскрипции гена сегментационных часов. Это эффективно гасит осцилляции с каждым последующим периодом и в конечном итоге нарушает периодичность сегментационных часов, что приводит к дефектам формирования сомитов. Появление морфологических фенотипов, наблюдаемых у эмбрионов мыши-мутанта Hes7, демонстрирует прямую связь между стабильностью белка и периодичностью часов сегментации. Напротив, увеличение стабильности эндогенных мРНК часов сегментации, наблюдаемое при потере Pnrc2-опосредованного распада в эмбрионах рыбок данио, не приводит к явным дефектам сегментации. Эти наблюдения указывают на существование надежного пост-транскрипционного механизма регуляции мРНК для точной настройки экспрессии осциллирующих генных транскриптов.

Важность трансляционной регуляции экспрессии генов, особенно на стыке трансляционной репрессии и распада мРНК, хорошо известна (Decker & Parker, 2012). Хорошо описанная модель трансляционной регуляции предполагает, что RBPs и/или миРНК, подавляющие экспрессию целевых мРНК, могут ингибировать их трансляцию и перемещать транскрипты в цитоплазматические локусы, такие как тельца процессинга (P-тела), состоящие из нескольких рибонуклеопротеиновых компонентов, включая белки комплекса процессинга и распада мРНК (Decker & Parker, 2012; Hubstenberger et al., 2017). Транскриптомный анализ очищенных Р-тел показал, что мРНК, обогащенные в Р-телах, коллективно кодируют белки, которые действуют как регуляторные переключатели между различными биологическими процессами, включая процессинг РНК, деление клеток, дифференциацию и развитие (Hubstenberger et al., 2017). мРНК, обогащенные Р-телами, также коррелируют с низкой эффективностью трансляции по сравнению с мРНК, не обогащенными Р-тельцами (Hubstenberger et al., 2017). Интуитивно эти результаты неудивительны, поскольку динамика процессов клеточного деления и определения судьбы, таких как сомитогенез и нейрогенез, характеризуется быстрыми и высоко регулируемыми переходами экспрессии генов. Трансляционная репрессия была описана как метод регуляции циркадных часов растений (Juntawong & Bailey-Serres, 2012; Missra et al., 2015), и может также быть эффективным методом, способствующим быстрому подавлению экспрессии генов сегментационных часов. Вычислительные исследования, направленные на понимание критических параметров, необходимых для поддержания автоингибиторных транскрипционных контуров обратной связи, таких как сеть Hes/Her, показали, что временная задержка трансляции особенно важна для модуляции периода осцилляции (Ay et al., 2014; Murray et al., 2021). В частности, математическая модель, включающая трансляционные временные задержки для точного моделирования динамики осцилляций, согласуется с идеей о существовании трансляционных репрессивных факторов, которые помогают уточнить контур отрицательной обратной связи, чтобы осцилляции поддерживались должным образом (Murray et al., 2021). Важно отметить, что экспериментальные данные, полученные в ходе исследований цис-регуляторных элементов, способствующих распаду транскриптов осциллирующих генов, указывают на предполагаемые трансляционные регуляторные факторы (Bonev et al., 2012; Riley et al., 2013; Tietz et al., 2020).

Помимо связи с распадом мРНК, RBPs, такие как Pumilio и ARE-BPs, и миРНК также имеют хорошо описанные роли в регуляции трансляции. Было показано, что миРНК регулируют трансляцию на многих этапах, включая инициацию и элонгацию при трансляции (Fabian et al., 2010). Известно, что белки Pumilio регулируют трансляцию путем прямого ингибирования связывания PABP (поли (A)-связывающего белка) с целевой мРНК (Chritton & Wickens, 2011; Van Etten et al., 2012; Weidmann et al., 2014). Кроме того, было обнаружено, что ARE-BPs, включая TIA1 (Tia1 Cytotoxic Granule-associated RNA Binding Protein) и TIAR [кодируемый TIAL1 (Tia1 Cytotoxic Granule-associated RNA Binding Protein-like 1)], подавляют инициацию трансляции мРНК, связанных с иммунным ответом и раком (Dixon et al., 2003; Gueydan et al., 1999; Piecyk et al., 2000). Анализ экспрессии мРНК и уровня белка генов сегментационных часов при неправильной регуляции миРНК у эмбрионов мыши (Riley et al., 2013; Wahi et al., 2017), а также потеря Pnrc2-опосредованного распада у эмбрионов рыбок данио (Gallagher et al., 2017; Tietz et al., 2020) позволяют предположить, что трансляция мРНК сегментационных часов жестко регулируется. Дальнейшее изучение механизмов трансляционного регуляторного контроля транскриптов сегментационных часов заполнит существующий пробел в нашем понимании пост-транскрипционной регуляции экспрессии осцилляторных генов.

Быстрые изменения в экспрессии генов являются отличительной чертой многих процессов развития, некоторые из которых наблюдаются уже через несколько часов после оплодотворения, например, переход от матери к зиготе (MZT; Vastenhouw et al., 2019). До начала зиготической транскрипции развитие эмбрионов метазоа, особенно животных, развивающихся внешне, зависит от материнских генных продуктов. По мере развития активация зиготического генома требует быстрого удаления материнских транскриптов, что знаменует начало MZT (Vastenhouw et al., 2019). В ооцитах Xenopus Celf1/EDEN-BP подавляет экспрессию материнских транскриптов, способствуя быстрому деаденилированию (Ezzeddine et al., 2002). Последовательность белка CELF1/CUGBP1 человека на 88% идентична EDEN-BP Xenopus, а рекомбинантный CELF1/CUGBP1 человека может непосредственно связывать и быстро деаденилировать материнские транскрипты Xenopus в экстрактах яиц Xenopus (Ezzeddine et al., 2002; Paillard et al., 2003). Пост-транскрипционные механизмы распада материнской мРНК также были изучены в глобальном масштабе в эмбрионах рыбок данио, где в ходе массового параллельного репортерного исследования элементов 3' UTR, способствующих быстрой деградации материнских транскриптов, были выявлены три доминирующих мотива, приводящих к распаду подкласса транскриптов: последовательности подкласса miR-430, AREs и PREs (Rabani et al., 2017). Интересно предположить, что эти крупномасштабные программы распада мРНК были использованы в других процессах развития, требующих надежной и быстрой модуляции экспрессии мРНК, как в случае с часами сегментации, и что функции ключевых регуляторных белков мРНК высококонсервативны. Посттранскрипционная регуляция является ключевым механизмом для обеспечения правильного перехода развития, и критические регуляторные факторы могут повторно использоваться на протяжении всего эмбриогенеза для быстрой очистки связанных с предками генных продуктов и облегчения перехода в более дифференцированное состояние. Будущие исследования позволят более точно определить пост-транскрипционную регуляторную программу, которая обеспечивает это.

Генетические осцилляции используются на протяжении всего развития для обеспечения правильной координации времени роста и формирования тканей. В этом обзоре мы обобщили данные о пост-транскрипционном контроле экспрессии генов сегментационных часов, полученные в ходе исследований, проведенных среди позвоночных, и выявили надежную регуляцию экспрессии мРНК. Сочетание 3'UTR-взаимодействующих факторов, активаторов деаденилирования и усилителей декапирования способствует точной регуляции осцилляций мРНК, что, в свою очередь, способствует осцилляторной экспрессии, критически важной для поддержания судьбы стволовых клеток. У сегментирующихся эмбрионов осцилляции Hes/her начинаются в задней части PSM и продолжаются по мере перемещения клеток в переднем направлении. Как только клетки располагаются на фронте детерминации в передней части PSM, осцилляторная экспрессия прекращается, что совпадает с дифференцировкой клеток пресомитов в сомиты и формированием границы сомита (Gomez et al., 2008; Shih et al., 2015). Динамическая экспрессия Hes1 также связана с судьбой предшественников в нейрональных стволовых клетках, а прекращение осцилляторной экспрессии Hes1 способствует дифференцировке нейронов (Shimojo et al., 2008). Вопрос о том, является ли прекращение генетических осцилляций следствием или причиной дифференцировки клеток, и какую роль в этом переходе играют пост-транскрипционные регуляторы, является предметом интереса исследователей, изучающих процессы детерминации стволовых клеток (Hatakeyama et al., 2004; Momiji & Monk, 2009; Ohtsuka et al., 1999; Shimojo et al., 2008, 2016; Van Norman et al., 2013). Будущие исследования, направленные на раскрытие пост-транскрипционных механизмов, участвующих в регуляции генетических осцилляций, позволят получить дальнейшее представление о регуляции спецификации клеточной судьбы в ходе развития.