Мышечное сокращение требует укорочения саркомера - основной сократительной единицы мышцы, которое происходит за счет раздвижения взаимопересекающихся толстых и тонких филаментов. Толстые филаменты представляют собой биполярные структуры, содержащие миозин II, MyBP-C и титин, а также ряд других белков вблизи "голой" зоны, которая обозначает ось симметрии толстого филамента и центр саркомера³. Условно эта область включает в себя зону P (P - proximal), где расположены так называемые короны (верхушки) миозина P1, P2 и P3, и полосу M - голую зону, лишенную головок миозина, где переплетаются хвосты миозина, принадлежащие смежным полусаркомерам⁴. Миозин представляет собой комплекс из димера миозина II массой 530 кДа, состоящий из двух отдельных участков: головки и хвоста. Каждая головка включает в себя моторный домен, связанный с основной легкой цепью и регуляторную легкую цепь. Два хвоста образуют спираль и вставляются в толстый филаментный каркас. В расслабленном состоянии мышцы головки миозина расположены в виде квазигелической решетки с трехкратной вращательной симметрией^5-7. Пары головок трех молекул миозина выступают из основы через равные промежутки времени, образуя "корону" головок, причем последовательные короны разнесены по оси примерно на 143 A. Взаимодействие моторных доменов миозина с тонкой нитью отвечает за генерацию силы и сокращение мышцы.

MyBP-C локализуется в центральной области А-полосы - в С-зоне, которая также содержит все миозиновые моторы, ответственные за обеспечение пиковой силы при сокращении⁸. Сердечная изоформа MyBP-C (cMyBP-C) представляет собой белок массой 140 кДа с тремя фибронектиноподобными доменами типа 3 (FN3) и восемью иммуноглобулиноподобными доменами, которые могут образовывать связи между толстыми и тонкими филаментами⁹. Биохимические исследования подтверждают модель, в которой аминоконцевая область может связываться с головками миозина или актином фосфорилированно¹⁰ , а С-концевая область прикрепляется к толстому филаменту через взаимодействие с титином и хвостами миозина^11,12. Связи MyBP-C могут выступать в качестве механических сенсоров мышечного напряжения и оказывать как активирующее, так и ингибирующее действие на миозиновые моторы, регулируя силу и кинетику мышечного сокращения^13,14.

Титин - белок массой до 4,25 МДа, состоящий из 169 иммуноглобулиноподобных и 132 FN3-подобных доменов, образующих цепь от М-полосы до Z-диска, где актиновые филаменты противоположной полярности сшиваются α-актинином, обозначая латеральные границы саркомеров^15,16. Титин действует как молекулярная пружина, которая предотвращает чрезмерное растяжение саркомера, разматывает саркомер после снятия растяжения¹⁷ и, как предполагается, выполняет роль молекулярной линейки для сборки миозина в полосе А (область саркомера, где тонкие и толстые филаменты перекрываются)^18,19. Точная стехиометрия титина в полосе А остается загадкой: по разным оценкам, на один толстый филамент приходится от 2 до 10 молекул²⁰. Благодаря многочисленным сайтам посттрансляционной модификации, разбросанным по его длине, и предсказанным взаимодействиям с миозином и MyBP-C, титин, как предполагается, также является посредником в передаче регуляторных сигналов от клетки к миозиновым моторам²¹.

Существуют модели общего расположения миозиновых головок в толстом филаменте сердца²² , и с помощью компонентов, восстановленных in vitro, удалось получить замечательные сведения о регуляции их кинетики²³. Однако до сих пор неизвестно, как эти наблюдения отражаются на структуре полностью комплементарного, нативного саркомера и молекулярных взаимодействиях, которые происходят в толстом филаменте в его естественной среде. В частности, полностью отсутствуют сведения о ключевых молекулярных игроках, участвующих в развитии заболеваний, - миозине, титине и MyBP-C, что демонстрирует ключевой пробел в понимании того, как они выполняют свои высокорегулируемые функции в ограниченном пространстве толстого филамента. Здесь мы представляем структуру толстого филамента in situ в голой зоне, Р-зоне и С-зоне в расслабленных миофибриллах сердца мыши, полученную с помощью разработанного нами технологического процесса фрезерования сфокусированным ионным пучком и криоэлектронной томографии (крио-ЭТ)^16,24,25. Структура раскрывает архитектуру толстого филамента, визуализируя критические взаимодействия между миозином, титином и MyBP-C, а также связи MyBP-C между тонкими и толстыми филаментами.

Для получения практически нативного образца, пригодного для проведения фокусированного ионно-лучевого фрезерования и крио-ЭТ анализа, мы расслабили лишенные мембран миофибриллы сердца мыши в присутствии EGTA, декстрана и мавакамтена (Методика). Мавакамтен, препарат, одобренный Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США для лечения гипертрофической кардиомиопатии, стабилизирует OFF (расслабленное) состояние миозина²⁶.

Томограммы показали, что толстые филаменты действительно находятся в выключенном состоянии, что определяется отсутствием связывания миозина с тонкими филаментами (рис. 1а). Используя усреднение субтомограмм, мы смогли определить структуру тонкой нити сердца с тропомиозином в заблокированном состоянии (миозин-связывающий сайт окклюдирован) с разрешением 8,2 Е (рис. 1б,г, рис. 1а, 2а,б и 3а,б) и структуру расслабленной толстой нити (рис. 1в,г, рис. 1бж и 2вк, методы и расширенные данные). Для более детального анализа толстой нити мы разделили ее на перекрывающиеся сегменты и определяли их структуру независимо друг от друга, получая тонкие структурные различия между разными сегментами. Разрешение полученных реконструкций варьировалось от 19,3 до 23,6 Е (расширенные данные рис. 2c-i).



Fig. 1: Thick filament structure in the relaxed cardiac sarcomere.

a, Tomographic slice of a cardiac sarcomere, centred on the M band, depicting thick and thin filaments. Scale bar, 50 nm. b, Reconstructed thick and thin filaments mapped into a tomogram. Thin filaments obstructing the view on the thick filament were removed for clarity. Scale bar, 50 nm c, Structure of the thick filament from the M band to the C zone. For clarity, only the first four cMyBP-C stripes are shown. d, Illustration of the various sarcomere components and their colour code, which is maintained throughout the manuscript, unless otherwise indicated. For abbreviations and colour codes for the structural elements of the thick filament, see Extended Data Fig. 2k.

Отображение структур в определенные X-Y-Z позиции на реконструированных томограммах позволило охарактеризовать трехмерное расположение тонких и толстых филаментов (рис. 1б и Дополнительное видео 1). В соответствии с предыдущими структурными исследованиями сердечной мышцы позвоночных, головки миозина в нашей комбинированной реконструкции расположены в виде квазихелической решетки с трехкратной вращательной симметрией^5-7 (рис. 1в и расширенные данные рис. 4а-д). Объединенные реконструкции включают в себя М-полосу, Р-зону и С-зону и показывают положение белков М-полосы вместе с первым 31 слоем миозина, включающим 6 молекул титина и 9 полос cMyBP-C (27 молекул cMyBP-C; рис. 1b,c и расширенные данные рис. 1b-j и 4a). Такая структура толстого филамента имеет диаметр 32 нм, длину 510 нм и молекулярную массу около 67 МДа и позволяет описать толстый филамент от М-полосы до С-зоны в региональном разрезе.

Сегменты, содержащие номера (№№) полос cMyBP-C 4-9 и суперповторы титина С-типа 3-8, имеют сходную структуру и поэтому были усреднены, что позволило получить улучшенное разрешение 18 Е (рис. 2а, Методы и расширенные данные рис. 2ж). Затем мы подогнали атомные модели белков толстого филамента (полученные либо из экспериментальных структур, либо из предсказаний AlphaFold227,28) к полученной реконструкции, что позволило отнести все плотности к соответствующим компонентам толстого филамента (рис. 2б и Дополнительное видео 2).



Fig. 2: Structural model of the C zone.

a,b, The 3D reconstruction (a) and atomic model (b) of the C zone, from cMyBP-C stripe no. 4 to stripe no. 9. The volume is coloured according to its atomic model (b). c, Model of the myosin double heads in the conformational OFF state (Protein Data Bank: 5TBY)27, the IHM, with the blocked head and the free head binding to each other. d–i, Z-ward views of cross-sections of the map (d–f) and model (g–i) at the level of crown 3 (d,g), crown 1 (e,h) and crown 2 (f,i), providing a more detailed view of the arrangement within the core of the thick filament.

Реконструкция выявила три различных расположения короны миозина (определяемые как короны 1, 2 и 3 в направлении от М-полосы к Z-диску), которые образуют внешний слой толстого филамента (рис. 2d-i). Их двойные головки взаимодействуют друг с другом внутри димеров миозина в конформации, известной как мотив взаимодействующих головок²⁹ (IHM; рис. 2в). В этом выключенном состоянии одна из головок ("блокированная головка") сложена таким образом, что ее актин-связывающий участок блокируется другой головкой ("свободная головка"). Предполагается, что такая конфигурация коррелирует с состоянием суперрелаксации^30,31 , в котором оба мотора имеют сильно заторможенную АТФазную активность²⁹.

Хвосты миозина, связанные с коронами, образуют большой пучок витков в центре филамента (рис. 2d-i). На пучке хвостов располагаются три пары молекул титина, которые идут параллельно друг другу, но при этом каждая молекула (или цепь) в паре имеет уникальную конформацию. Чтобы однозначно идентифицировать эти две цепи, мы назвали их титин-α и титин-β (рис. 2а,б). Если головки корон 1 и 3 не взаимодействуют с титином, то свободная головка короны 2 связывается с шестым доменом суперповтора титина С-типа (рис. 2f,i), что также наблюдается на полоске cMyBP-C № 1 (расширенные данные рис. 5b,g-j).

Fig. 3: cMyBP-C forms links between the thick and thin filaments.

a, Domain map of cMyBP-C (1,270 amino acids). The C-terminal domains from C7 to C10 bind to the thick filament, the central domains C3 to C6 form the bridge, and the N-terminal domains bind to the thin filament. b, Structural model depicting the three binding regions of cMyBP-C on the tail of crown 2. c, The epitope for the binding of the C-terminal domain of cMyBP-C to the thick filament is formed by an array of crown 2 tails and places C10 and C8 in contact with crowns 3 and 1, respectively. d, Schematic representation of the bridging region of cMyBP-C. Flexibility is shown together with a plot of the angular distribution of the bridge measured in the tomographic volumes. e, Tomographic slice (0.94 nm thickness) of the C zone in the relaxed state. f, Tomogram segmentation of a 9.4-nm slab from the same region as in e, depicting the thin filament (light green), the thick filament core (blue), the myosin heads (light blue) and cMyBP-C (yellow). g, A 3D model of the sarcomere organization in the same slab as in e, showing the flexible cMyBP-C links, spanning 3–4 globular domains, linking thick and thin filaments. h, Close-up view of the connection of two consecutive cMyBP-C proteins to the same thin filament. Scale bars, 20 nm.

Структура также показывает, что cMyBP-C связывается своими С-концевыми доменами С7-С10 с массивом хвостов миозина (рис. 3a-d и расширенные данные рис. 5b,d,f и 6b), тем самым обеспечивая визуальное подтверждение биохимических данных, которые начали накапливаться полвека назад^32,33.

Неожиданно оказалось, что С-концевая область cMyBP-C также напрямую взаимодействует с IHMs. В частности, домен С10 связывается с моторным доменом свободной головки короны 3, а домен С8 образует широкие электростатические взаимодействия с моторным доменом свободной головки короны 1 (рис. 3б,в и расширенные данные рис. 5б,в,е). Эти взаимодействия cMyBP-C с моторами миозина свидетельствуют о прямом участии cMyBP-C в стабилизации состояния миозина OFF в С-зоне и объясняют, почему cMyBP-C может стабилизировать состояние суперрелаксации³⁴. Это открывает новую парадигму в отношении роли cMyBP-C в регуляции саркомера и представляет собой интерфейс, на котором может быть исследовано фармацевтическое вмешательство для пациентов с гипертрофической кардиомиопатией.

Хотя организация миозиновых хвостов была определена у насекомых и пауков^35-37 , до сих пор мы не располагаем структурной информацией, позволяющей выяснить их организацию в поперечно-полосатой мышце млекопитающих, что представляет собой пробел в нашем понимании молекулярной механики сердечного сокращения. На реконструкции С-зоны, состоящей из 43 нм повторов, видны только части хвостов, поэтому для полной визуализации их по всей протяженности мы рассчитали удлинение спирали на 200 нм, начиная с этой реконструкции (Методы). Полученная 3D-карта позволила уточнить расположение хвостов, связанных с каждой из трех корон (рис. 4а,б). Хвосты трех корон переплетаются, взаимодействуя друг с другом, и образуют компактный стержень. Хвосты короны 3 образуют сердцевину стержня и взаимодействуют друг с другом в С-концевой части, что позволяет предположить, что хвосты миозина, связанные с короной 3, являются возможным ядром для сборки филаментов.



Рис. 4: Пространственное расположение миозина в С-зоне толстого филамента.

a,b, Side (a) and Z-ward (b) views of a combined map and atomic models of a section of the thick filament depicting only myosins. The myosins follow a three-fold rotational symmetry and a pseudohelical symmetry with a 43-nm rise and 0° twist. The asymmetric unit comprises three myosin crowns, each composed of three myosin double heads. The tails form the backbone of the thick filament. The tails of crown 2 represent the outermost layer, followed by those of crown 1 and crown 3. Whereas the tails of crown 3 run relatively straight, the tails of crowns 1 and 2 exhibit increased degrees of undulation. The arrowheads indicate an inflection point, common to the tails of crowns 1 and 2, which could also be directly observed from the AlphaFold2 predictions of the myosin tails at the phenylalanine residue in position 1449.

Для количественной оценки и сравнения характера искривления хвостов мы рассчитали процент сжатия синусоиды (Methods), который положительно коррелирует с увеличением кривизны хвоста и составил 3,05%, 4,44% и 2,53% для хвостов из коронок 1, 2 и 3, соответственно. Примечательно, что хотя хвосты имеют уникальные точки перегиба в разных местах, короны 1 и 2 имеют общую ярко выраженную кривую, которая коррелирует с перегибом, предсказанным AlphaFold2 на остатке фенилаланина в положении 1449 (рис. 4а). Этот остаток не соответствует ни одному из пропущенных остатков, предсказанных в последовательности coiled-coil, и не присутствует в миозине II38 не млекопитающих, что, возможно, свидетельствует о своеобразной характеристике хвоста миозина II млекопитающих.

В пределах С-зоны хвосты миозина имеют разную степень взаимодействия с титином. Хвосты, связанные с короной 3, имеют лишь минимальное взаимодействие, в то время как хвосты короны 1 связываются с титином-α, титином-β или обоими по всей своей длине (расширенные данные рис. 6а,в). Хвосты, связанные с короной 2, связываются только с титином-β, в основном через свой домен S2 (расширенные данные рис. 6б). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что каждая корона в толстом филаменте сердца имеет своеобразное расположение хвостов и характер их взаимодействия, которые, вероятно, оркеструются и регулируются титиновыми цепями, хотя возможен и обратный процесс. Это позволяет предположить наличие специализированных ролей миозинов каждой короны в активации и сокращении в зависимости от длины. Изогнутый характер хвостов корон 1 и 2 и их прямое взаимодействие с титином подтверждают предположение о том, что обе титиновые цепи не только выполняют роль счетчиков молекул миозина (как молекулярная линейка), но и могут ощущать и передавать нагрузку на мышцу, передавая сигнал, который может способствовать переходу из сверхрасслабленного в неупорядоченное расслабленное состояние вышележащих корон в направлении М-диапазона.

Чтобы лучше понять, существуют ли различия между миозиновыми головками вдоль филамента, мы проанализировали нашу комбинированную реконструкцию, в которой было разрешено 93 миозиновых двойных головок, охватывающих слои от Р-зоны (Р1, Р2 и Р3) до С-зоны (от А1 до А28), что соответствует области титина от М-полосы до С-типа суперповтора 2 (рис. 5а-и). Мы наблюдали, что все головки миозина находятся в состоянии IHM, это подтверждает, что все 31 слой находится в состоянии OFF. Псевдохелическое расположение "короны 1, 2, 3", которое мы наблюдали от полоски cMyBP-C № 4 до полоски № 9, сохраняется во всей С-зоне. Однако в областях, расположенных ближе к М-полосе, наблюдаются заметные структурные отличия (рис. 5c-f и расширенные данные рис. 7b-d).



Fig. 5: Arrangement of myosin heads, cMyBP-C and titin from the M band to the C zone.

a, Domain map of titin, showing its highly modular organization. The distal region of the A band comprises six 7Ч D-type super-repeats, and the central region contains eleven 11Ч C-type super-repeats (CSRs). The proximal region (P zone) contains the TK domain, and the M-band region presents ten immunoglobulin-like domains connected by seven disordered interspacing regions, m1–10 and is1–7, respectively. b, Cryo-ET map of the thick filament, spanning from the M4' line to the C zone. c, Cryo-ET map of the thick filament in which myosin tails have been removed for visual clarity. d, ‘Unrolled’ depiction of the filament, revealing the spatial organization of the myosin heads. Position and arrangement of myosin heads from the P zone (crowns P1, P2 and P3) to stripe no. 9 of cMyBP-C (from crown A1 to A28). e, Designation of the crowns. f, Side view of the ‘unrolled’ filament with the centre of the thick filament to the right side. g, ‘Unrolled’ depiction of the filament, revealing the spatial organization of the 6 titin and 27 cMyBP-C molecules. h, The structural arrangement reveals the nine stripes of the C-terminal domain of cMyBP-C, anchored on the thick filament in proximity to the interface of different C-type super-repeats. The numbering and the positions of the cMyBP-C stripes are indicated. i, Atomic models of a single asymmetric unit, depicting titin-a and titin-Я together with the nine cMyBP-C stripes. j, Domain map of titin showing the blueprint of titin from the M band to C-type super-repeat 2 and its correlation to our reconstructions.

Для количественной оценки этих вариаций мы рассчитали ориентацию (углы Эйлера), азимутный угол, осевое расположение и радиальное расстояние IHMs для каждой коронки (расширенные данные рис. 7а-д). Неоднородность в подъеме, повороте и угловой ориентации миозина особенно ярко выражена в коронах от P1 до A9, тогда как в короне A10 появляется более регулярная картина (расширенные данные рис. 7б,г). Примером тому служат короны A5 и A8: хотя они локализуются в канонических слоях "короны 2", эти IHMs имеют гораздо большее радиальное расстояние, что делает их наиболее близкими к тонким филаментам после P1 (расширенные данные рис. 7d). Более того, их свободные головки проецируются дальше наружу (рис. 5b-f), что подтверждается сильно отрицательным углом β (расширенные данные рис. 7b,c). Такая вариабельность свидетельствует о том, что эти короны могут обладать уникальными возможностями в плане восприимчивости к деформациям скорости активации. В частности, поскольку они стабилизированы только слабым взаимодействием с титином, корона 2, по-видимому, может быть первым ответчиком в активации, зависящей от длины, а исключительные слои, такие как A5 и A8, являются наиболее показательными случаями.

Хотя все миозины в нашей реконструкции находятся в состоянии IHM, их стабилизация варьирует и зависит от различных взаимодействий, зависящих от конкретного молекулярного контекста и включающих сайты связывания на миозине S2, титине и cMyBP-C (см. также ниже). Можно предположить, что такая организация вдоль филамента свидетельствует о способности миозиновых головок в толстом филаменте к тонкой настройке регуляторных механизмов мышечного сокращения в толстом филаменте при адаптации к конкретным физиологическим условиям³⁹.

Несмотря на важную роль титина в сборке и функционировании саркомера, его детальная структурная организация до сих пор оставалась неизвестной1. Для построения атомной модели титина мы использовали комбинированную реконструкцию, охватывающую слои Р-зоны (Р1, Р2 и Р3) и С-зоны (от А1 до А28). Для этого мы использовали предсказания титина с помощью AlphaFold2, которые однозначно диктовали регистр и положение доменов титина. Это позволило описать молекулярную организацию титина от зоны С (в частности, от суперповтора 2) до полосы М (рис. 5а-в,f,g,i,j) и выявить его взаимодействие с другими компонентами толстого филамента, что позволило получить молекулярную информацию, полезную для понимания как функции саркомера, так и причинно-следственных связей при заболеваниях.

Примечательно, что если три цепи титина-α идут по всей длине толстого филамента и доходят до Р-зоны противоположного полусаркомера, то титин-β резко прерывается на миозиновой короне А1 (рис. 5c,f,g,i,j и расширенные данные рис. 8). Таким образом, в зоне С имеется шесть цепей, а в зоне Р - только три. Предыдущие исследования по маркировке антител показали, что С-концевые домены титина охватывают всю полосу М, причем m9-10 локализуются проксимальнее P1' (см. рис. 40). Следовательно, только три цепи входят в полосу М с каждой стороны толстого филамента, в результате чего в полосе М вместо двенадцати цепей титина находится только шесть.

В суперповторах С-типа титин-α и титин-β идут рядом друг с другом с редкими и, предположительно, слабыми взаимодействиями, обусловленными молекулярными контактами титина с хвостами миозина. В P'- и С-зонах титиновые цепи имеют пружиноподобное расположение с повторяющимися изогнутыми углублениями по схеме 3-4-4, что соответствует чередованию FN3 и иммуноглобулиноподобных последовательностей в суперповторах титина⁴¹ (рис. 5а,в,f,g,i,j). Помимо этого общего мотива, мы наблюдали определенную степень вариабельности между различными суперповторами С-типа. Эти вариации в основном обусловлены неорганизованными линкерами, разбросанными между доменами по всей структуре, и в большей степени выражены у титина-β. Наибольшей конформационной изменчивостью в титине-β обладают домены суперповторов 4-8. Эти домены взаимодействуют с доменом S2 короны 2 (расширенные данные рис. 5б,г-ж), и их изменчивость отражается в гетерогенной конфигурации IHMs короны 2 (расширенные данные рис. 7б,г), о чем уже говорилось.

В зоне Р, являющейся переходной между полосами А и М, паттерн суперповторов титина С-типа заменен семью доменами (от А164 до А170), которые ведут к домену титин-киназы (ТК) (рис. 5а-г,i,j и расширенные данные рис. 8б,в). Следуя за цепью титина-α в нашей реконструкции, мы выявили более объемную область за короной P1, которая соответствует размеру и форме, но не ожидаемому положению домена TK (расширенные данные рис. 8б,в). Поскольку это положение не совпадает с тем, которое было определено ранее на расстоянии около 52 нм от линии М1 с помощью иммуноэлектронной микроскопии с использованием моноклонального иммуноглобулина М (IgM) против домена ТК40 , мы создали новое аффинно очищенное антитело против домена ТК и использовали его для определения положения домена ТК с помощью микроскопии сверхразрешения в миофибриллах сердца мыши и миофибриллах грудной клетки мыши и кролика (расширенные данные рис. 8f). Определенное таким образом положение домена TK находилось на расстоянии 78 нм ± 8 нм от линии M1. Это наиболее соответствует плотности расположения домена ТК на короне Р1, но, учитывая ожидаемые пределы разрешения микроскопии с обеднением стимулированного излучения, не исключает локализации домена ТК на обеих коронах А1 (см. ниже) и Р1 (расстояние между ними 43 нм).

Домен TK тесно связан через свой С-концевой регуляторный хвост с соседним доменом m1, как было предположено ранее^42,43. Примечательно, что домены m1 титина взаимодействуют с доменами S2 миозинов в короне P2, а последующие домены m2 и m3 титина обвиваются вокруг хвостов миозинов, связанных с короной P1 (Extended Data Fig. 8b,c).

В зоне С цепь титина-β повторяет регистр титина-α, однако после домена А154, вблизи короны А2, ее организация меняется на bow-tie-образную структуру, а после короны А1 ее цепь отсутствует (расширенные данные рис. 8д,е). На вершине короны А1 мы выявили еще одну громоздкую плотность, напоминающую конфигурацию ТК-m1. Однако ограниченное разрешение не позволяет четко идентифицировать домены. Мы предполагаем, что эта структура в форме бантика может соответствовать 13 титиновым доменам (от A158 до A170), соединяющим остальную часть титина-β с доменами β-ТК-m1 (расширенные данные рис. 8d,e), и что титин-β заканчивает свой путь по толстой нити на моторных доменах A1, возможно, после протеолитического расщепления кальпаином 3 (CAPN3) ниже по течению от титина m1 (см. 44). Таким образом, ТК-домены титина-α и, возможно, титина-β локализуются на расстоянии 77 и 105 нм от центра М-полосы (в контакте с коронами Р1 и А1, соответственно), взаимодействуя со своими S1- и S2-доменами в привилегированных позициях, которые могут связывать активацию головки миозина с механосенсорными функциями ТК-домена.

М-полоса, состоящая из шести поперечных "линий" (М1-М6), представляет собой сложную сеть структурных белков, метаболических ферментов и компонентов протеостатического механизма^1,3. Сообщается, что белки этой сети крепят М-область к сарколемме, стабилизируют гексагональную решетку миозиновых филаментов и служат сигнальным каркасом, интегрирующим механические силы, энергетический баланс и оборот белков^1,3. Наша реконструкция области толстого филамента М показывает двукратную зеркальную ось, центрированную вокруг линии М1, перпендикулярную трехкратной оси вращения. Мы четко идентифицировали миозиновые короны в зоне Р, а также проследили хвосты от четырех самых внутренних корон, которые идут антипараллельно друг другу, что подтверждает предыдущие данные4 о том, что хвосты Р1 заканчиваются вблизи короны Р1 с противоположной полярностью (Р1'; рис. 6а,в).



Fig. 6: The layout of the M band.

a, Density of the thick filament in the M-band region. The overall structure shows a two-fold rotational axis perpendicular to a three-fold rotational axis (D3 symmetry). b, Ruler, providing markers for the expected high-density M lines in the cardiac sarcomere (M1, M4, M6 and M9). M1 is absent in our reconstruction, probably owing to the lattice organization being averaged out during the refinement process. c, The most clearly identifiable densities from the M-band map are the tails of the first two myosin crowns, P1 and P2, together with an unresolved cluster of M-band-associated proteins. d, Domain map of the C-terminal region of titin, which consists of the TK domain, the ten m domains (m1–10) and seven interspacing regions (is1–7). The length of the interspacing regions roughly reflects the length of the extended polypeptide chains predicted from AlphaFold2 in those regions.

Помимо миозина, мы наблюдали несколько плотностей, выступающих из сердцевины хвостов, отражающих белки и домены, специфичные для полосы М, такие как миомезин 1 и 2 (см. 3), обскурин-подобный-1 (OBSL1)⁴⁵ , С-концевые домены титина⁴⁰ и вспомогательные белки, такие как креатинкиназа мышечного типа (М-КК). Мы выявили плотность, простирающуюся от М-линий М4' до М4, которая связывается с ядром толстого филамента при 85 Е и 230 Е и проецируется наружу с трехкратной симметрией в гексагональную решетку. Учитывая его локализацию, расположение и состав из доменов длиной около 4 нм, мы предполагаем, что эта плотность представляет собой комплекс из миомезина 1, OBSL1 и, возможно, миомезина 2 (рис. 6а-в). Неожиданно в нашей реконструкции М-диапазона расслабленного сердца мы наблюдаем плотности на расстоянии 118 Е от М1, выступающие в сторону соседних толстых филаментов в решетке (рис. 6в). Однако ожидаемые перекрестные М-мосты, как это следует из структуры димерного миомезина 146 , в процессе уточнения усредняются из-за их гибкости.

Мы не смогли определить местоположение обскурина. Вероятно, это связано с гибкостью структуры и локализацией обскурина на периферии миофибрилл, в отличие от центральной саркомерной локализации OBSL1 (см. 45). Как было описано выше, только титин-α своим С-концом достигает области М-полосы. Он состоит из ТК-домена, десяти m-доменов (m1-10) и семи междоузелковых областей (is1-7)40. Внутри каждой асимметричной единицы оголенной зоны, на расстоянии 427 Е от линии M1 с высокой плотностью, мы наблюдали плотность, соответствующую размеру и форме двух иммуноглобулиноподобных доменов, возможно, соседних доменов титина m8 и m9. Кроме того, имеются другие небольшие плотности, которые могут соответствовать m1, m2, m3 и m10. Эти промежуточные области очень тонкие и не содержат предсказанных элементов вторичной структуры, поэтому не видны в нашей реконструкции. В соответствии с предыдущими предположениями40 , эти наблюдения подтверждают идею о том, что М-область титина-α охватывает всю М-полосу. Идентификация плотностей М-линий в их почти нативном состоянии дает представление о локализации М-домена титина и структурном обосновании описанных биохимических взаимодействий^{3,40,45,47,48}. Детальное определение плотностей потребует в будущем комбинации сайт-направленного мечения доменов и крио-ЭТ.

Тем не менее, представленная здесь структура нативной М-полосы сердца in situ представляет собой начальную модель М-полосы в молекулярном масштабе. Сшивки, образуемые белками М-полосы, диктуются трехкратной вращательной симметрией толстого филамента. Однако взаимодействие титина с OBSL1 и OBSL1 с миомезином 1 происходит в комплексе 1:148 , что создает несоответствие симметрии этих составляющих и ожидаемых ранее шести титинов из каждого полусаркомера, входящих в М-полосу. Наш анализ позволил разрешить этот парадокс, показав, что полный участок М-полосы титина присутствует только в трех копиях в каждом полусаркомере, направляя сборку шести наблюдаемых М-связей (по три в каждом полусаркомере).

При реконструкции толстого филамента мы обнаружили, что домены C7-C10 cMyBP-C связываются с массивом из трех последовательных хвостов (рис. 3б,в), связанных с короной 2 в девяти областях С-зоны^18,49 (рис. 5ф-ж). С7-С10 идут продольно вдоль филамента: для каждого cMyBP-C С10 находится в направлении М-полосы, а С7 ориентирован в сторону Z-диска, охватывая 16-нм область на стыке между суперповторами титина С-типа (рис. 5f-j). Первые биохимические данные позволили предположить, что прикрепление cMyBP-C к зоне C может зависеть от прямого взаимодействия между C7-C10 cMyBP-C и суперповторами титина C-типа¹¹. В расслабленном состоянии мы не наблюдаем прямых взаимодействий между этими двумя белками. Вместо этого мы выяснили, что С-концевые домены связываются со специфической конфигурацией хвостов миозина, которая возникает в С-зоне в результате сложного взаимодействия хвостов миозина и суперповторов титина С-типа (рис. 3b-d и расширенные данные рис. 5b-d,f). В частности, С7-С10 связываются с участками, которые возникают из массива хвостов, связанных с короной 2, принадлежащей трем последовательным С-зонам (рис. 3б,в), посредством сильных электростатических взаимодействий (расширенные данные рис. 5в,е). Такая конфигурация позволяет также объяснить отсутствие cMyBP-C в области титина С-типа суперповтора 1, поскольку участок, где мог бы связываться cMyBP-C, в этом случае состоит из хвостов D-типа суперповтора 6, которые мы не выявили в нашей структуре, но которые, вероятно, имеют другую конформацию.

В С-концевой области cMyBP-C последним четко разрешенным доменом является C7, который, по-видимому, служит точкой опоры для остальных доменов, отходящих от толстого филамента (рис. 2а,б,е). Мостиковая область белка действительно демонстрирует большую гибкость и имеет лишь слабую плотность (рис. 3д и расширенные данные рис. 9а). Хотя полосы № 1 и 2 демонстрируют смещение в сторону определенной организации решетки, анализ поперечного сечения различных полос показал, что N-концевая область cMyBP-C может связываться с любым из двух соседних тонких филаментов (расширенные данные рис. 9а). Примечательно, что полоска cMyBP-C № 2 демонстрирует некоторые уникальные особенности (расширенные данные рис. 10б,в): свободная головка короны A7 не стабилизируется взаимодействием с cMyBP-C C8, как это наблюдается во всех остальных полосках; вместо этого ее IHM стабилизируется взаимодействием с легкими цепями миозина соседних корон.

Для подтверждения такой податливости связей cMyBP-C мы нанесли структуры на реконструкцию томографического объема и вручную проследили гибкие глобулярные домены, соединяющие толстые и тонкие филаменты (рис. 3e-h, Методы и Дополнительное видео 3). Мы наблюдали наличие нескольких связей cMyBP-C в зоне С, что свидетельствует о том, что N-концевая область действительно может взаимодействовать с тонким филаментом. Несмотря на наши усилия, усреднение субтомограмм не позволило выявить четкого расположения N-концевой области на тонкой нити, что свидетельствует о высокой гетерогенности этих взаимодействий, что согласуется с предыдущими реконструкциями на основе изолированных компонентов⁵⁰. Наша сегментация показала наличие троса, образованного 3-4 доменами, которые вписываются в сигнал тонкой нити с интервалом 43 нм и высокой степенью гибкости (рис. 3е-ж). Таким образом, гибкость связей, вероятно, позволяет компенсировать несоответствие 37-нм повтора актина в тонких филаментах и 43-нм повтора cMyBP-C в толстых филаментах. Следует отметить, что тонкий филамент со связанными N-концевыми доменами cMyBP-C находится в выключенном состоянии, что позволяет предположить, что cMyBP-C при физиологическом уровне фосфорилирования и в отсутствие миозиновых поперечных мостиков не является активатором тонкого филамента.

cMyBP-C представляет собой важнейший участок кардиомиопатий и до сих пор остается загадочным компонентом саркомера, его функция в модуляции активации миозина предполагается, но не вполне понятна. В совокупности проведенный нами анализ cMyBP-C позволяет предположить его множественную роль в саркомерной механосигнализации. С одной стороны, можно предположить, что при деформации толстого филамента синусоидальная траектория хвостов короны 2 может испытывать минимальное, но значительное растяжение, что приводит к изменению мест связывания С-концевого участка cMyBP-C и нарушению его взаимодействия со свободными головками. Таким образом, взаимодействие С-концевых доменов с IHMs короны 3 и 1 может представлять собой преобразователь растяжения и напряжения, не зависящий от расположения тонких филаментов. С другой стороны, сшивки с тонкой нитью могут воспринимать растяжение и скольжение тонкой нити и передавать напряжение как на С-концевой, так и на N-концевой домены cMyBP-C, а домен С1 и С0 может распространяться дальше и связывать легкие цепи миозина на поверхности толстой нити, как в цис-, так и в транс-положении.

Наше исследование позволяет понять фундаментальную организацию и регуляцию толстых филаментов сердца у позвоночных. Полученная нами крио-ЭТ структура саркомера в расслабленном состоянии в сочетании с ранее определенными структурами саркомера в состоянии покоя^16,25 дает представление об архитектуре мышцы, ее молекулярной сложности, запутанности и изощренности регуляции. Структура нативного толстого филамента дает трехмерное представление о том, как головки и хвосты миозина, MyBP-C и титин организованы в различных областях филамента, объясняя, как эти компоненты могут взаимодействовать во время мышечного сокращения. При этом выявляются явные различия в организации определенных доменов саркомера по сравнению с результатами, полученными с помощью традиционных восстановительных подходов и классических методов электронной микроскопии.

Проведенный нами анализ выявил множество конформаций и механизмов стабилизации IHM, которые зависят от региона и опираются на различные взаимодействия с доменом m1 титина, С-концевой областью cMyBP-C, суперповторами титина, другими хвостами миозина и легкими цепями миозина. Полученные данные подтверждают модель толстого филамента, способного воспринимать, интегрировать и модулировать ответы на многочисленные сигналы, такие как β-адренергически-зависимое фосфорилирование, концентрация Са2+, длина и механическая нагрузка. Кроме того, мы выявили организацию титина вдоль толстого филамента и истинное положение его ТК-домена не в М-полосе, а на границе между М-полосой и А-полосой. Такая локализация указывает на то, что роль ТК в регуляции саркомера может быть более тесно связана с состоянием миозиновых головок, чем считалось ранее.

Шесть титиновых цепей, вероятно, влияют на расположение и характер взаимодействия каждого миозинового хвоста. Таким образом, становится понятным, как титин действует в качестве каркаса и молекулярной линейки для сборки миозинов в процессе саркомерогенеза, как было предположено ранее⁵¹. Это интересное отражение белка небулина, обнаруженного в тонком филаменте²⁵. Кроме того, тесное взаимодействие и пружиноподобный вид титина и хвостов миозина, а также их связь с головками миозина убедительно доказывают наличие зависящего от нагрузки механизма активации толстого филамента, способствующего переходу из сверхрасслабленного в неупорядоченное расслабленное состояние.

Нам удалось наблюдать биологически важную структурную изменчивость вдоль толстого филамента, что является важнейшим аспектом, необходимым для понимания функции и регуляции саркомера. Статические структуры сами по себе мало что говорят нам о взаимодействии и динамике множества высокорегулируемых головок миозина, связанных друг с другом. Эти важные детали были бы упущены при использовании большинства методов структурной биологии и демонстрируют достоинства крио-ЭТ в визуализации этой изменчивости в нативном состоянии. Связи cMyBP-C, соединяющие тонкие и толстые филаменты, являются еще одним примером возможностей крио-ЭТ. И, наконец, понимание структуры толстых филаментов позволяет понять развитие, функционирование и заболевания мышц.