Стрессовые гранулы представляют собой конденсаты не-транслируемых мессенджер рибонуклеопротеидов (мРНП), которые образуются из мРНК, застопорившихся на этапе инициации трансляции благодаря сети взаимодействий с участием РНК-связывающего белка G3BP1 и его гомолога G3BP28,^9,10 (далее G3BP). Помимо мРНК, эти цитоплазматические конденсаты содержат обширную и гетерогенную группу белков, идентичность которых варьируется в зависимости от контекста и типа клеток^11,12. Несмотря на многочисленные успехи в понимании молекулярных механизмов формирования стрессовых гранул, биологическая функция этих биомолекулярных конденсатов остается в значительной степени неизвестной¹². Сообщалось, что взаимодействие мембран-связанных органелл и биомолекулярных конденсатов играет определенную роль в клеточной организации^13,14. Стрессовые гранулы и другие биомолекулярные конденсаты считаются безмембранными органеллами, но они также ассоциируются с липидными мембранами. Поэтому безмембранные и мембран-связанные конденсаты, вероятно, соответствуют разным функциональным состояниям^15-17. Тем не менее, наше понимание механизмов и функциональных последствий биомолекулярных взаимодействий конденсатов с мембранами все еще ограничено¹⁸.

Повреждение лизосом является общей чертой многих заболеваний и представляет собой серьезную проблему для поддержания клеточного здоровья. Несмотря на его важность, идентификация механизма, который может быстро стабилизировать разорванную лизосомную мембрану, предотвращая утечку и обеспечивая эффективное восстановление, остается неизвестной. Появившиеся данные свидетельствуют о том, что белки G3BP могут связываться с лизосомной мембраной в гомеостатических условиях^19,20. Помимо широкого спектра стимулов, вызывающих образование стрессовых гранул, повреждение лизосом также индуцирует образование стрессовых гранул^21,22. Однако остается неясным, вызван ли этот ответ в первую очередь самой поврежденной мембраной или образование стрессовых гранул пространственно ограничено местом повреждения. Следует отметить, что биологическая функция стрессовых гранул в контексте повреждения эндолизосомальной мембраны (то есть потери целостности мембраны в результате разрыва или пор) остается неизвестной.

Физиологическая роль ограниченного эндолизосомального повреждения была описана в контексте сегрегации хромосом, презентации антигенов и взаимодействия хозяина и патогена^23-25. При повреждении мембраны образуются поры, которые делают везикулы нестабильными и склонными к коллапсу, если не удается загерметизировать место разрыва²⁶. Учитывая, что этот процесс смертельно опасен, механизмы клеточной репарации быстро восстанавливают целостность мембраны, что позволяет избежать обширного повреждения мембраны, утечки цитозольных протеаз и гибели клетки. Ограниченные эндолизосомальные повреждения могут быть восстановлены с помощью ESCRT-зависимых и независимых путей^3,4,6,7, но механизмы, которые сначала стабилизируют поврежденную мембрану, чтобы обеспечить привлечение механизмов восстановления, плохо изучены.

Здесь мы изучили роль биомолекулярных конденсатов и стрессовых гранул в ответ на повреждение эндомембраны, вызванное химическими и физическими агентами, а также инфекцией M. tuberculosis (Mtb) в макрофагах человека. Наши результаты показали, что стрессовые гранулы зарождаются вблизи поврежденных эндолизосом, образуя защитную пробку, которая стабилизирует разорванную мембрану и способствует ее эффективному восстановлению. Примечательно, что этот процесс критически важен для восстановления фагосом Mtb и способствует сдерживанию этого патогена человека, вызывающего повреждение эндомембраны. Наше исследование раскрывает биофизический механизм, лежащий в основе стабилизации поврежденных мембран, и выявляет биологическую функцию стрессовых гранул в контексте эндолизосомальных повреждений.

Сначала мы исследовали динамику взаимодействия стресс-гранул и эндомембранных повреждений в макрофагах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSDMs), с помощью сверхразрешающей визуализации живых клеток. После индукции повреждения эндолизосом с помощью L-лейцил-L-лейцин метилового эфира (LLOMe), широко распространенного лизосомотропного соединения, образующего мембранолитический полимер^27,28, мы наблюдали заметное увеличение количества G3BP1-позитивных гранул, которые локализовались вблизи лизосом, позитивных для галектина-3 (GAL-3), цитозольного лектина, связывающегося с лизосомными гликанами, которые раскрываются только после повреждения мембраны²⁸ (рис. 1a). 1a и дополнительные видео 1 и 2). Мы обнаружили, что примерно 90 % GAL-3-позитивных событий были связаны с G3BP1-позитивными структурами и быстро формировались после добавления LLOMe, достигая максимума через 20 мин обработки (рис. 1b-d и дополнительные видео 1 и 2). Кроме того, мы подтвердили, что образование стрессовых гранул в местах лизосомных повреждений происходило с большей скоростью, чем ожидалось по случайному стечению обстоятельств, проведя анализ пространственного точечного паттерна (рис. 1е). Анализ 3D-изображений показал, что в более чем 70 % G3BP1- и GAL-3-позитивных событий гранулы формировали пробку, тесно связанную с поврежденной эндолизосомой, откуда впоследствии продолжал расти конденсат (рис. 1f,g и дополнительные видео 3-8). При более высоком временном разрешении (около 1 с) мы определили, что G3BP1-позитивные структуры и их накопление предшествовали обнаружению повреждения эндомембраны с помощью GAL-3 (рис. 1h,i и Дополнительное видео 8).

Fig. 1: Stress granules form in the proximity of endomembrane damage sites.

a, Live-cell imaging sequence of iPSDMs expressing G3BP1–GFP and GAL-3–RFP after 2 min of LLOMe treatment (1 mM). Outlined regions in the top row are magnified in the bottom two rows. Arrowheads highlight the time frame before and after a G3BP1/GAL-3 event is detected. b,c, Quantification of area of G3BP1 (b) and GAL-3 (c) puncta normalized to cell area from live-cell imaging experiments as described in a. n = 30 cells examined over 3 independent experiments; two-tailed t-test. d, Scheme summarizing the different type of events observed in the first 20 min after inducing lysosomal damage. Graph shows the percentage of single G3BP1+ events, GAL-3+ events or combined GAL-3+G3BP1+ events observed by live-cell imaging. e, Spatial point pattern analysis applied to G3BP1+ and GAL-3+ events. In box plots, the centre line is the median, boxes delineate the interquartile range (IQR), and whiskers represent the data range within 1.5 times the IQR. n = 40 events examined over 3 independent experiments; P value by Monte Carlo simulation-based approach. f, G3BP1 polarized ‘plug pattern’ on GAL-3+ damaged vesicles and the corresponding 3D z-stack reconstruction. g, Quantification and schematic of plugging events shown in f. n = 40 events examined over 3 independent experiments. SG, stress granule. h, Image sequence (1 s frame rate, shown at 5s intervals) of iPSDMs expressing G3BP1–GFP (magenta) and GAL-3–RFP (green) after 2 min of LLOMe treatment. i, Mean fluorescence intensity (MFI) over time of G3BP1+ and GAL-3+ events as shown in h. Graphs show traces over time and standard error. n = 30 events examined over 3 independent experiments. AU, arbitrary units. j, Live-cell imaging sequence of iPSDMs expressing LAMP1–RFP and G3BP1–GFP. Arrowhead indicates membrane rupture site. The panel on the far right shows a 3D reconstruction. k, MFI of G3BP1–GFP over time for sequence shown in j. Bar plots indicate mean ± s.e.m. of at least three independent experiments. Scale bars: 10 µm (a, top), 2 µm (a, middle, bottom, f,h,j).

G3BP1-позитивные гранулы, вызванные обработкой LLOMe, были позитивны в отношении настоящих маркеров стрессовых гранул²⁹ , таких как поли(A)-РНК, EIF3B, EIF4G, G3BP2, TIA1 и PABPC1^8-11 (расширенные данные рис. 1a-g). Ответ на LLOMe отличался от ответа на индуктор стрессовых гранул - арсенит натрия³⁰ (NaAsO2), поскольку NaAsO2 не вызывал повреждения эндомембраны (расширенные данные рис. 2a,b). Более того, обработка LLOMe быстро увеличивала фосфорилирование субъединицы 2a эукариотического фактора инициации трансляции (eIF2a) (Extended Data Fig. 2c,d), которая регулирует образование канонических стрессовых гранул^21,31. В соответствии с этими результатами ингибиторы синтеза белка циклогексимид и эметин³² блокировали индуцированное LLOMe образование стрессовых гранул, не влияя на индукцию лизосомных повреждений (расширенные данные рис. 2e,f).

Затем мы исследовали эффект блокирования закисления лизосом с помощью бафиломицина A1 (BAFA1), ингибитора вакуолярной АТФазы. Учитывая, что BAFA1 может вмешиваться в лизосомную переработку LLOMe²⁷ , мы проверили его влияние на образование стрессовых гранул, индуцированное кристаллами кремнезема (Extended Data Fig. 2g), еще одного агента, разрушающего эндомембраны^28,33. BAFA1 значительно снижал образование стрессовых гранул после индукции лизосомного повреждения кристаллами кремнезема (Extended Data Fig. 2g,h), предполагая, что быстрые и локализованные изменения цитозольного рН после ограниченной лизосомной утечки могут запускать образование конденсатов, как это ранее сообщалось в отношении конденсатов G3BP1 in vitro¹⁰ и в других системах³⁴. Различные типы взаимодействия между G3BP1-положительными стресс-гранулами и LAMP1-положительными эндолизосомальными мембранами наблюдались после повреждения эндомембраны, когда стресс-гранулы обнаруживались как вблизи везикулярной мембраны, так и в просвете или ассоциированными с интралюминальными везикулами (Extended Data Fig. 2i-k). В соответствии с этими результатами, визуализация живых клеток и анализ трехмерного рендеринга поверхности iPSDMs, экспрессирующих LAMP1-eGFP, показали наличие очагов G3BP1 рядом с местами разрушения мембраны, где он далее накапливался в LAMP1-позитивных везикулах (рис. 1j,k). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что стрессовые гранулы формируются быстро и закупоривают места эндолизосомальных повреждений.

Чтобы подтвердить, что конденсация белков может происходить непосредственно в месте повреждения, мы использовали гигантские униламеллярные везикулы ( GUVs) и конденсаты G3BP1-РНК в качестве модельной системы. Сначала мы восстановили гранулы G3BP1-РНК in vitro, как было описано ранее¹⁰ (расширенные данные рис. 3a-d). Затем мы создали GUVs, инкапсулирующие G3BP1, в виде гомогенного раствора (50 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, pH 7,5) и использовали микрофлюидное устройство для быстрого и полного обмена с внешней средой (Extended Data Fig. 3e,f). Чтобы имитировать разницу в pH между цитозольным и эндолизосомальным компартментами в клетке, мы изменили pH внешнего раствора с 7,5 до 5 (Методика). Повреждение мембраны вызывали гипотоническим шоком, в результате чего в GUVs образовывались нано- и микропоры, позволяющие локально смешивать внешний и внутренний растворы (рис. 2a-d, Extended Data Fig. 3g-i и Supplementary Video 9). Поризация мембраны и фазовое разделение G3BP1 были вызваны заменой внешнего раствора на раствор с более низкой осмолярностью и pH, содержащий поли(A)-РНК (20 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 200 нг мкл-1 поли(A)-РНК, pH 5). Примечательно, что в местах повреждения мембраны образовывались конденсаты G3BP1-РНК, что приводило к смачиванию и стабилизации обода поры и предотвращало разрушение мембраны и дальнейшую утечку содержимого (рис. 2a-g, расширенные данные рис. 3g-i и дополнительные видео 9 и 10). Эти наблюдения соответствовали картине, наблюдаемой в клетках (рис. 1), где сохранялась целостность везикул. Напротив, если образование пор происходило при отсутствии возможности формирования конденсатов, везикулы разрушались (рис. 2е-г). Наблюдалось смачивание мембраны^15-17 конденсатом (рис. 2b,c и расширенные данные рис. 3h,n), что обеспечивало локальное распространение капель и стабилизацию пор, эффективно иммобилизуя разорванную мембрану. Более того, процент GUVs, переживших гипотонический шок, был выше при образовании конденсата, чем при отсутствии фазового разделения (рис. 2g).



Fig. 2: Localized condensate formation stabilizes damaged membranes.

a, Experimental design. Lipid vesicles (green) encapsulating G3BP1 (magenta) are exposed to a hypotonic shock and pH decrease in the presence of poly-(A) RNA in the external medium. GUV, giant unilamellar vesicles. b, Confocal time-lapse. A damaged vesicle (green) stabilized by G3BP1–RNA condensate. White arrowhead marks condensate formation and growth. Scale bars: 5 µm (top) and 2 µm (bottom). c, Left, final state of GUV condensate from b (scale bar, 5 µm). Middle, magnified view showing membrane discontinuity and G3BP1–RNA condensate at the pore (scale bar, 2 µm). Right, intensity profile shows that the condensate wets the pore rim. d, 3D projection of pore region from c. Scale bar, 2 µm. e, Without the triggering of condensation, membrane damage causes bursting and content loss. f, Vesicle destabilization sequence. Bursting upon poration is followed in the absence of RNA. White arrowhead indicates pore and content loss. Scale bar, 10 µm. g, GUV survival under hypotonic shock. GUVs without encapsulated protein (-G3BP1), with protein (+G3BP1/-cond), and with protein and triggering of condensate formation with poly(A)-RNA (+G3BP1/+cond). Data are mean ± s.e.m. n = 3 independent experiments. One-way ANOVA. h, Simulated damaged model vesicle (green) with condensation-prone protein solution outside and solute particles inside, resulting in different outcomes based on the interactions between these three components. i, Droplet plug formation. Exchanged solution (particles) between vesicle inside and outside (top) and pore lifetime (bottom) with different pore radii, for three interaction scenarios. No interactions, increased solution exchange with pore size and no droplets; Upon condensation (liquid-liquid phase separation (LLPS) interactions), droplets plug exchange and pores are long-lived; Condensate-membrane (LLPS–membrane attraction), droplet wets vesicle, efficient plug and accelerated pore closure. Data are mean ± s.d. n = 10 replicas. j, Droplet formation sequence. Mixing two solutions leads to rapid small-droplet formation near the pore. Over time, these merge into one large condensate, plugging the pore and inducing sealing with wetting interactions. *P < 0.05, ***P < 0.001.

Учитывая, что мы предполагаем функцию биомолекулярных конденсатов как стабилизаторов повреждений мембран, мы проверили, можно ли распространить эти результаты на другие белки, образующие конденсаты. Мы использовали глицинин, растительный белок хранения, который представляет собой надежную модельную систему для образования конденсатов и взаимодействие которого с мембранами было описано недавно¹⁷. Мы вызывали конденсацию внешним снижением pH или увеличением солености и пористости везикул (Extended Data Fig. 3j-o и Supplementary Video 11). Эксперименты с глицинином дополнительно подтвердили, что образование конденсата может происходить избирательно в местах разрыва мембраны, закупоривая мембранные поры.

Далее мы проанализировали физический механизм закупорки с помощью крупнозернистой модели молекулярной динамики и обнаружили, что конденсаты спонтанно образуются в месте повреждения мембраны вследствие смешивания растворов во внутреннем (отражающем просвет эндосомы) и внешнем (отражающем цитозольную сторону) компартментах (рис. 2h-j). Быстрое образование этих конденсатов приводило к заметному падению потока через пору и препятствовало дальнейшему смешиванию двух растворов (рис. 2i и расширенные данные рис. 4a,b). Аналогично картине, наблюдаемой в клетках (Дополнительные видео 3-8), настраивая взаимодействие белка с мембраной, мы обнаружили, что смачивание мембраны конденсатом необходимо для ее стабилизации. Как и наблюдалось in vitro, смачивание обеспечивало благоприятную энергию взаимодействия, необходимую для пассивного закрытия пор (рис. 2h-j) и захвата капли после обертывания мембраны (Дополнительное видео 12). В отсутствие смачивания капли разрушали поры, поскольку могли расти до насыщения (Дополнительное видео 13), но большая часть эффекта закупоривания сохранялась, а конденсат выступал в качестве поглотителя растворителей, которые в противном случае смешивались бы. Наконец, удаление из системы всех конденсатообразующих взаимодействий приводило к интенсивному смешиванию двух растворов и длительному повреждению мембраны (Дополнительное видео 14). Кроме того, мы обнаружили, что для эффективного закупоривания (максимального подавления потоков смешивания) требуется быстрое зарождение капель в месте повреждения, которое определяется концентрацией его компонентов (Extended Data Fig. 4a,b). Далее мы оценили пространственное распределение зарождения и роста капель во времени. В соответствии с результатами in cellulo, мы наблюдали, что капли конденсата первоначально образуются вблизи поры и что большая часть конденсата остается в этой области по мере роста пробки (расширенные данные рис. 5a,b). В совокупности эти результаты показывают, что при образовании мембранной поры взаимодействие растворов внутри и снаружи просвета запускает локальное образование биомолекулярного конденсата, который, в свою очередь, стабилизирует поврежденную мембрану и способствует выживанию везикул.

Чтобы выяснить, связана ли стрессовая стабилизация мембраны, опосредованная стрессовыми гранулами, с восстановлением эндомембраны, мы нацелились на G3BP1 и G3BP2 в iPSDMs с помощью CRISPR-Cas9, доставленного в виде комплекса рибонуклеопротеинов (RNP) путем нуклеофекции³⁵ , и добились генетического нокаута почти на уровне популяции (Extended Data Fig. 6a,b). Учитывая, что LLOMe перерабатывается в мембранолитический полимер, в первую очередь зависящий от активности лизосомных протеаз²⁷, мы сначала оценили объем лизосом и протеолитическую активность в iPSDMs, подвергшихся нуклеофекции RNP (G3BPnf iPSDMs). Не было обнаружено различий в объеме лизосом и протеолитической активности G3BPnf iPSDMs по сравнению с iPSDMs дикого типа (расширенные данные рис. 6c-e). В соответствии с предыдущими сообщениями о том, что G3BP является центральным узлом в регуляции формирования стрессовых гранул^8-10,36,37, мы наблюдали, что G3BPnf iPSDMs не формировали стрессовые гранулы после индуцирования лизосомного повреждения (рис. 3a,b и расширенные данные рис. 6f). В качестве зонда для мониторинга динамики целостности лизосом использовали одноклеточное высококонтентное изображение лизосомотропного красителя LysoTracker после повреждения лизосом38. Различий в интенсивности флуоресценции LysoTracker между необработанными G3BPnf iPSDMs и контрольными iPSDMs не было, что указывает на то, что отсутствие G3BP не влияет на лизосомный pH в базовых условиях (расширенные данные рис. 6g). Кроме того, поврежденные эндолизосомы в G3BPnf iPSDMs и контрольных iPSDMs демонстрировали сходную утечку LysoTracker после 2 мин обработки LLOMe, это говорит об отсутствии различий в степени индукции повреждения лизосом после LLOMe (рис. 3c-g). Однако G3BPnf iPSDMs не восстанавливали популяцию лизосом после удаления LLOMe (рис. 3c-g). Аналогичные результаты наблюдались при G3BP1 и G3BP2 (G3BP1/2)-нуклеофицированных человеческих моноцитарных макрофагах (HMDM G3BPnf) и в клетках HeLa, трансфицированных короткой интерферирующей РНК (siRNA), направленной против G3BP1/2 (Extended Data Fig. 6h-p). Чтобы визуализировать стрессовые гранулы в клетках на ультраструктурном уровне, мы провели исследования с помощью корреляционной светоэлектронной микроскопии (CLEM). Анализируя серийные срезы трансмиссионной электронной микроскопии восстановленных G3BP1-позитивных и LysoTracker-позитивных везикул после повреждения лизосом, мы обнаружили, что в рассматриваемый период времени большая часть G3BP1-позитивного сигнала была связана с агрегатами, локализованными в LysoTracker-позитивных везикулах, и с G3BP1-позитивными участками, обогащенными в областях нарушения эндомембраны (рис. 3h). Эти результаты согласуются с нашими наблюдениями, полученными при визуализации живых клеток, и моделью "пробка-энгульф" (plug-engulfment), полученной в результате вычислительного моделирования.

Fig. 3: Stress granules facilitate endomembrane repair.

a, G3BP1 and G3BP2 staining in wild-type and G3BPnf iPSDMs left untreated or treated with LLOMe (1 mM, 30 min). n = 3 independent experiments. Scale bars: 10 µm (main images), 2 µm (enlarged area). b, Stress granule quantification in iPSDMs treated as described in a. n = 30 cells examined over 3 independent experiments. Two-way ANOVA with Љнdбk’s multiple comparisons test. c, Schematic illustrating the lysosomal recovery assay using LysoTracker (LTR). d, Image sequence of wild-type and G3BPnf iPSDMs incubated with LysoTracker (black puncta) before adding LLOMe (left), and 2 min (middle) or 10 min after (right) washout. Scale bar, 10 µm. e,f, Intensity of LysoTracker puncta relative (rel.) to basal values (pre-LLOMe) for the indicated conditions in wild-type (e) and G3BPnf (f) iPSDMs. n = 3 independent experiments. Two-tailed t-test. g, LysoTracker intensity at 10 min after washout in wild-type iPSDMs compared with G3BPnf iPSDMs. Data are mean ± s.e.m. n = 3 independent experiments. Two-tailed t-test. h, Schematic of the CLEM experiment on recovered lysosomes. mEGFP–G3BP1 (magenta) iPSDMs were treated with LLOMe (1 mM) for 15 min. After a washout step, cells were incubated with LysoTracker (green) before fixation and CLEM processing. Bottom right, percentage of G3BP1+ puncta localizing to LysoTracker+ and LysoTracker- areas, quantified by electron microscopy. n = 10 fields of view over 3 independent experiments. The image sequence shows the G3BP1+LysoTracker+ regions of interest (1 and 2) analysed by CLEM and the corresponding fluorescence–electron microscopy image overlap across three different regions in z (serial stack). Arrowheads indicate G3BP1+ areas surrounding membrane disruption sites. NS, not significant.

Для дальнейшего подтверждения того, что блокирование образования стрессовых гранул нарушает восстановление лизосом, мы использовали ранее охарактеризованные клетки U2OS с двойным нокаутом G3BP1 и G3BP2 (G3BP-DKO)37 (Extended Data Fig. 7a-c). Во-первых, мы наблюдали аналогичную динамику G3BP1-GAL-3 после индукции лизосомного повреждения в клетках U2OS дикого типа (Extended Data Fig. 7d-f) и не обнаружили различий в лизосомной протеолитической активности или базовых уровнях интенсивности LysoTracker по сравнению с клетками G3BP-DKO (Extended Data Fig. 7g). Примечательно, что лизосомная популяция в клетках G3BP-DKO U2OS не восстанавливалась после удаления LLOMe (расширенные данные рис. 7h-l и дополнительное видео 15). Мы подтвердили эти результаты, используя частицы 10K-декстрана, которые, в отличие от LysoTracker, накапливаются в лизосомах независимым от рН образом³ (расширенные данные рис. 7m-q).

Было показано, что лизосомные повреждения восстанавливаются с помощью ESCRT-зависимых^7,38 , а также ESCRT-независимых путей⁴ , таких как PI4K2A5,6 и аннексин A1 и A23 (ANXA1/A2)-опосредованных механизмов. Однако в случае обширных повреждений скоординированная система, опосредованная GAL-3 и адаптерами аутофагии^1,39, такими как TBK1 и p62, направляет поврежденные лизосомы на путь аутофагии^1,40,41. В соответствии с предполагаемой мембраностабилизирующей ролью стрессовых гранул мы наблюдали быстрое накопление компонентов ESCRT-III CHMP2A, CHMP4B и CHMP4A-взаимодействующего белка ALIX в клетках G3BP-DKO U2OS после индукции лизосомного повреждения (расширенные данные рис. 8a,b). Примечательно, что если в клетках U2OS дикого типа⁷ и других клеточных линиях³⁹ участие GAL-3 и адаптеров аутофагии отмечалось в более поздние сроки (30 мин и более) после обработки LLOMe, то в клетках G3BP-DKO U2OS эти белки накапливались уже через 5 мин после лизосомного повреждения (расширенные данные рис. 8c-f). Аналогичные результаты наблюдались при рекрутировании ESCRT-независимых компонентов, таких как ANXA1/A23 (расширенные данные рис. 9a-d) и PIK42A-ORP95,6 (расширенные данные рис. 10a-d). В соответствии с нашими наблюдениями in vitro и in silico, наши результаты показывают, что неспособность сформировать пробку после повреждения лизосом увеличивает степень повреждения и нестабильность лизосомной мембраны. Несмотря на то, что рекрутирование механизма восстановления усиливается, отсутствие стабилизированной стрессовыми гранулами мембраны делает этот процесс неэффективным. Следовательно, поврежденные лизосомы накапливаются и становятся мишенью для деградации по пути аутофагии². В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что стрессовые гранулы стабилизируют поврежденную эндомембрану и способствуют эффективному восстановлению эндомембраны в целлюлозе.

Mtb индуцирует повреждение мембраны в макрофагах под действием системы секреции ESX-1 типа VII и других факторов⁴². В ходе исследования РНК-секвенирования iPSDM⁴², инфицированных Mtb, мы выявили значительное увеличение уровней транскриптов нескольких маркеров стрессовых гранул после инфицирования Mtb дикого типа, но не ESX-1-дефицитным мутантом Mtb ΔRD1, который сильно ограничен в своей способности индуцировать эндомембранные повреждения^33,42,43 (рис. 4а). Примечательно, что ген ZNFX1 - ген, связанный с менделевской предрасположенностью к микобактериальным заболеваниям или туберкулезу с интермиттирующим моноцитозом, который ранее был идентифицирован в стрессовых гранулах⁴⁴ , - также повышался в зависимости от RD1 (рис. 4а). В соответствии с фенотипом, зависящим от повреждения мембраны, инфицирование Mtb дикого типа, но не Mtb ΔRD1, повышало уровень фосфорилированного eIF2a (p-eIF2a) (рис. 4б,в). В макрофагах человека Mtb дикого типа вызывали образование стрессовых гранул вблизи бактерий, индуцирующих повреждение мембраны, что было продемонстрировано с помощью иммуноокрашивания GAL-3 (рис. 4d-g). Более того, мы обнаружили, что ZNFX1 имеет высокую степень ко-локализации с G3BP1 и локализуется в местах повреждения мембраны в непосредственной близости от Mtb дикого типа (рис. 4f-h). Примечательно, что когда мы исследовали, образуются ли стрессовые гранулы во время Mtb-инфекции в мышиной модели Mtb-инфекции, мы обнаружили, что стрессовые гранулы и GAL-3-позитивные структуры присутствовали в легких мышей C3H/HeJ, инфицированных Mtb дикого типа, но не инфицированных Mtb ΔRD1 (рис. 4i-k). Чтобы определить функциональные последствия образования стрессовых гранул после Mtb-инфекции, мы проанализировали репликацию Mtb в контрольных и G3BPnf iPSDMs. Мы обнаружили увеличение репликации Mtb дикого типа после 48 ч инфекции, а репликация как Mtb дикого типа, так и Mtb ΔRD1 в G3BPnf iPSDMs увеличивалась после 72 ч инфекции (рис. 4l,m). Разница в кинетике, наблюдаемая между Mtb дикого типа и Mtb ΔRD1, согласуется с данными, показывающими, что хотя Mtb ΔRD1 обладает значительно меньшей способностью локализоваться в цитозоле, определенная степень повреждения эндомембраны все еще может происходить через бактериальный липид фтиоцерол димикоцерозат⁴³. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что нарушение стабилизации и восстановления эндолизосомальной мембраны, вызванное блокадой образования стрессовых гранул, оказывает решающее влияние на исход Mtb-инфекции в макрофагах.



Fig. 4: Stress granules are required for Mtb restriction in human macrophages.

a, Heat map of z-scores for transcripts associated with stress granules in iPSDMs infected with wild-type Mtb or Mtb ?RD1 (multiplicity of infection (MOI) 2, 48 h). P value was calculated using Wald statistic and adjusted for false discovery rate (a = 0.05, ***P < 0.001). b, Immunoblot for phosphorylated and total eIF2a in iPSDMs that are uninfected (UI) or infected with wild-type Mtb or Mtb ΔRD1 for 24 or 48 h (MOI, 2). Beta actin (ACTB) was used as a loading control. c, eIF2a protein levels relative to ACTB. Data are mean ± s.e.m. n = 3 independent experiments. d–f, Area of G3BP1 (d), GAL-3 (e) and ZNFX1 (f) puncta normalized to cell area of iPSDMs infected with wild-type Mtb and MtbΔRD1 (MOI 2, 48 h). Data are mean ± s.e.m. of at least 10 cells from one out of 3 independent experiments (n = 3). Two-tailed t-test. g, Representative images of iPSDMs infected with Mtb (MOI 2, 48 h) and stained for G3BP1 and GAL-3. h, Left, representative images of iPSDMs infected with Mtb (MOI 2, 48 h) and stained for G3BP1, ZNFX1 and GAL-3. Right, z-stack images of the outlined area. i, Immunofluorescence images Mtb, G3BP1 and GAL-3 in lung from mice infected with wild-type Mtb and Mtb ΔRD1. j,k, Area of G3BP1 (j) and GAL-3 (k) puncta normalized to tissue area. Data are mean ± s.e.m. n = 10 areas analysed from at least 3 tissue sections. Two-tailed t-test. Images shown are z-stack projections. l, Images of wild-type and G3BPnf iPSDMs infected with wild-type Mtb and Mtb ΔRD1 for 72 h (MOI, 1). m, Quantification of Mtb replication (bacteria area per cell) in wild-type and G3BPnf iPSDMs at 24, 48 and 72 h after infection. n = 3 independent experiments. Two-way ANOVA with Љнdбk’s multiple comparisons test.

Объединив исследования in vitro, in silico и in cellulo, мы выявили функцию биомолекулярных конденсатов, при которой стрессовые гранулы избирательно формируются вблизи поврежденной мембраны в виде пробки, способствующей стабилизации и выживанию везикул. Стрессовые гранулы быстро конденсируются вблизи мест повреждения эндолизосом, обеспечивая стабилизацию и восстановление эндомембраны, что имеет ключевое значение для защиты макрофагов-хозяев от внутриклеточных патогенов, повреждающих эндомембраны. Наши результаты in vitro, показывающие, что другие биомолекулярные конденсаты также могут стабилизировать и закупоривать разорванные мембраны, позволяют предположить, что это может быть эволюционно сохраненным механизмом, учитывая аналогичные наблюдения для грибковых белков, закупоривающих септальные поры, которые агрегируют во время заживления ран у Neurospora crassa⁴⁵.

Мы предлагаем модель, в которой стрессовые гранулы зарождаются в месте расположения поры после локального изменения условий среды (например, снижения pH¹⁰) и смешивания эндолизосомального и цитозольного содержимого. Разделенные по фазе капли быстро растут и охватывают всю пору, препятствуя смешиванию потоков, поэтому они имеют разные размеры в зависимости от размера поры (рис. 2h,j и расширенные данные рис. 4). Кроме того, смачивающие взаимодействия между конденсатом и мембраной стабилизируют как поры, так и капли, усиливая эффект пробки. С биофизической точки зрения, благоприятный энергетический вклад от этого смачивающего взаимодействия противодействует дестабилизирующим силам, действующим на везикулу, и может способствовать уплотнению поры и захвату конденсата путем обертывания мембраны вокруг капли. Это более вероятно для мембран, которые подвергаются небольшому боковому напряжению или обладают некоторым резервуаром площади, тогда как при растяжении мембраны можно ожидать только частичного поглощения. Таким образом, поглощение конденсата может быть опосредовано добавлением липидов к мембране - как было описано ранее⁶ - хотя вклад этого пути еще предстоит изучить. Наконец, полное поглощение капли может привести к отпочкованию обернутого мембраной конденсата, что приведет к полному восстановлению мембраны. Это может произойти спонтанно (как наблюдается при моделировании сильных взаимодействий конденсата с мембраной; Extended Data Fig. 4) или может быть опосредовано специализированным механизмом, таким как механизм ESCRT, на следующем этапе. Считается, что стрессовые гранулы играют роль в защите клеток от стресса, но они также могут способствовать агрегации неправильно сформованных белков⁴⁶. Полученные нами данные о роли стрессовых гранул в стабилизации поврежденных мембран могут способствовать выявлению молекулярных мишеней для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как синуклеинопатии и тауопатии⁴⁷, при которых лизосомальные повреждения, как было показано, запускаются аномальными белковыми агрегатами^40,48,49.

G3BP1-зависимое формирование стрессовых гранул, по-видимому, имеет решающее значение для восстановления фагосом Mtb и контроля инфекции и обеспечивает механистическое объяснение клинических данных, показывающих, что у пациентов с наследственным дефицитом белка стрессовых гранул ZNFX1 наблюдается ослабление иммунитета к микобактериям⁴⁴. В совокупности наши результаты раскрывают физический механизм, с помощью которого спонтанная конденсация стрессовых гранул в месте повреждения мембраны опосредует стабилизацию везикул и их последующее восстановление. Наши наблюдения могут иметь значение для заболеваний, связанных с повреждением лизосомальных мембран, таких как нейродегенеративные заболевания, инфекции и рак¹.