Эмбриональное развитие требует уникальной регуляции экспрессии Х-сцепленных генов из-за разного количества Х-хромосом у самцов и самок. У плацентарных млекопитающих компенсация дозировки Х-хромосом происходит путем инактивации Х-хромосомы (XCI) у самок, которая транскрипционно глушит большинство генов на одной из двух Х-хромосом, уравнивая экспрессию Х-сцепленных генов с мужскими.^1-8 Длинная не кодирующая РНК (lncRNA) Xist необходима и достаточна для индукции XCI^9-15 и, следовательно, критична для установления баланса экспрессии генов между полами.

Xist распространяется от своего активного транскрипционного локуса на Х-хромосоме по всей Х, чтобы опосредовать замалчивание генов и формирование гетерохроматина.^16-20 Цис-ограниченное распространение и сайленсинг также происходят, когда Xist экспрессируется эктопически с аутосом.^21-26 Поэтому преобладает мнение, что Xist локализуется и действует исключительно на хромосоме, с которой она экспрессируется.

На неактивной Х-хромосоме (Xi) Xist локализована в ~50 очагах, каждый из которых содержит две молекулы РНК.^27-29 Скопление очагов Xist известно как облако Xist.³⁰ В недавних сообщениях описана нетипичная, рассеянная конфигурация XIST в предимплантационных эмбрионах самки человека и обезьяны циномолгус,^31-33 в нативных человеческих плюрипотентных стволовых клетках (hPSCs),34,35 человеческих примордиальных зародышевых клетках (hPGCs),³⁶ иммунных клетках мыши и человека,^37-39 и раковых клетках,⁴⁰ где очаги XIST обнаруживаются по всей большой части ядра. Значение этой дисперсной конфигурации в настоящее время неизвестно. Рассеянное распределение XIST в предимплантационных эмбрионах человека, нативных hPSCs и hPSCs сопровождается характерной формой компенсации дозы Х-хромосомы, получившей название "затухание Х-хромосомы" (XCD).^33-41 Активность генов на затухающей Х-хромосоме (Xd) снижены, но не полностью заглушена. Таким образом, экспрессия XIST, которая обычно сопровождается XCI,^1-8, не связана с полным замалчиванием генов в клетках с XCD. Механизмы, лежащие в основе XCD, и то, играет ли XIST какую-либо регуляторную роль в XCD, неизвестны. Распространение XIST может представлять собой диссоциацию РНК из хроматина, которая обычно происходит только во время митоза³⁰ , ассоциацию РНК с Х-хромосомой в расширенной конформации или распространение за пределы Х-территории в аутосомные регионы. Последнее было бы интригующим, поскольку, в принципе, Xist способна регулировать аутосомные гены.^16,21-26

В этом исследовании мы изучили значение рассеянной конфигурации XIST и роль XIST в XCD, исследовав локализацию и функцию XIST в женских нативных hPSCs. Мы обнаружили, что, несмотря на широкое распространение, XIST локализуется по всей Х-хромосоме и опосредует подавление экспрессии генов и изменения хроматина на Xd, что позволяет утверждать, что XIST является регулятором XCD. Кроме того, мы обнаружили удивительное распространение XIST в определенных аутосомных регионах, где XIST изменяет состояние хроматина и подавляет экспрессию целевых генов, вызывая дисбаланс экспрессии аутосомных генов между женскими и мужскими клетками. Рассеянное распределение Xist и аутосомное нацеливание также происходят транзиторно во время инициации XCI в мышиных PSCs. В целом наше исследование смещает парадигму с XIST/Xist как цис-ограниченного регулятора и показывает, что он может действовать и транс-регулярно, это может быть связано с его дисперсной конфигурацией.

Ограниченность Х-хромосомы цис-положением - отличительная черта действия XIST/Xist. Мы обнаружили распространение XIST/Xist и на определенные аутосомные регионы, что добавляет неожиданное "транс-" измерение к действиям XIST (рис. 7M). Наша работа также показывает, что XIST изменяет состояние хроматина своих аутосомных мишеней и вызывает подавление их активности (рис. 7М).

(A) 3D-structured illumination microscopy (SIM) projections of RNA-FISH staining for Xist and chrX paint (mmX) at days 2 (pre-Xi) and 4 (Xi) of mESC differentiation (left). Middle images show only the Xist and chrX signals and right image a magnification of the Xi with chrX and XIST masks. (B) Percentage of genomic reads aligned to chrX for input genomic DNA and Xist RAP-seq pull-down in indicated samples. Each bar represents the mean percentage from replicate data sets and error bars the SD. D2 = day 2, D4 = day 4. (C) Number of Xist peaks per autosome labeled according to sample specificity (D2 and D4 = day 2 peaks maintained at day 4) (D) Xist enrichment and peaks at three autosomal regions from indicated samples. (E) Location of Xist peaks from (C). (F) Number of Xist peaks from (C). (G) Average significance (-log10(q)) of autosomal Xist peaks for day 2 RAP-seq replicates; classified into background, day 2 specific peaks (D2), and day 2 peaks maintained at day 4 (D2 and D4) (STAR Methods). Wilcoxon p value: ***p < 0.001. (H) Overlap of genes associated with conserved autosomal XIST peaks in naive hPSCs and genes associated with Xist peaks at day 2 of mESC differentiation. Fisher’s exact p value is given. (I) Most highly enriched ontologies and their significance (Fisher’s exact test -log10(p)) for the 115 genes associated with autosomal XIST/Xist binding in both human and mouse cells from (H), colored by log2(observed/expected). (J) Linear regression line comparing RAP-seq-based Xist enrichment along autosomes (1 Mb every 250 kb) and the density of L2 and MIR elements, for day 2 and day 4. Pearson correlation (R) and p values are given. (K) Inter-chromosomal interaction scores between the Xist locus and 1 Mb autosomal windows overlapping (+) or not (-) with Xist peaks from day 2. Wilcoxon p value: ***p < 0.001. (L) Inter-chromosomal interactions between the Xist locus and all 1 Mb autosomal regions vs. day 2 Xist enrichment. Pearson correlation (R) and p value are given. (M) Summary of XIST localization and function. Top: nuclear area containing chrX and neighboring autosomes in female somatic cells with an Xi (left) and female naive hPSCs with an Xd (right). Bottom left: On the Xi, XIST only spreads in cis, silencing gene expression. Autosomal genes are not targeted and regulated by XIST. Bottom right: In naive hPSCs, XIST spreads in cis across the Xd and in trans to specific autosomal regions and induces gene dampening and chromatin changes at these sites. (N) Model of the dosage compensation function of XIST. On the Xi/Xd in female somatic cells or naive hPSCs, XIST acts to normalize gene expression dosage between male and female cells. Additionally, XIST disrupts autosomal dosage equality between the sexes in naive hPSCs.

Аутосомные мишени находятся в непосредственной пространственной близости от геномного локуса XIST/Xist, что позволяет предположить, что аутосомная локализация определяется ядерной организацией, подобно распространению Xist по Xi.¹⁶ Хотя хорошо известно, что XIST/Xist может понижать активность аутосомных генов в контексте X/A транслокаций или in cis при трансгенной экспрессии из аутосомного сайта,^{14,21,23-26,76} наше исследование показывает, что XIST, эндогенно экспрессируемый с Х-хромосомы, может понижать регуляцию аутосомных генов in trans-положении.

Наше исследование выявило связь между рассеиванием Xist/XIST и аутосомной локализацией как в нативных hPSCs, так и в клетках мыши, инициирующих XCI. Клетки эпибласта женских предимплантационных эмбрионов человека демонстрируют дисперсную конфигурацию XIST^32,33 и экспрессию аутосомных мишеней XIST с мужским перевесом (рис. 4L-4N), что позволяет предположить, что XIST также регулирует аутосомные гены во время раннего эмбрионального развития человека. Интригующе, но дисперсная конфигурация XIST/Xist также была описана для предимплантационных эмбрионов cynomolgus обезьяны,³¹ hPGCs,³⁶ различных иммунных клеток, включая естественные киллеры, дендритные, T и B клетки,^37-39 альвеолярные клетки легких 2 типа,⁷⁷ и раковые клетки.⁴⁰ Поэтому можно предположить, что аутосомное распространение XIST происходит во всех этих типах клеток и может иметь широкую роль в развитии, в регуляции специфических клеточных функций и прогрессировании заболеваний. Интересно, что у плодовой мушки комплекс roX RNA/MSL, компенсирующий дозу Х-хромосомы, также нацелен и на аутосомные гены и регулирует их экспрессию, что необходимо для правильного развития мух.⁷⁸ Необходимы дальнейшие исследования для определения биологических последствий аутосомной регуляции с помощью XIST/Xist; однако есть предположение, что мужские эмбрионы развиваются быстрее, чем женские.^79-81

Мы показали, что XIST опосредует XCD в женских нативных hPSCs и что Х-сцепленные гены имеют разную восприимчивость к XIST-опосредованному затуханию. Х-сцепленные гены, в меньшей степени регулируемые XIST, демонстрируют экспрессию, ориентированную на женщин, а те, которые регулируются сильнее, имеют схожие уровни транскрипции в женских и мужских нативных hPSCs и предимплантационных эмбрионах человека. Наши данные позволяют предположить, что различные регуляторные особенности и регуляция хроматина лежат в основе различной восприимчивости к XIST-опосредованному затуханию. XCD также наблюдается у женских предимплантационных эмбрионов человека и не-человекообразных приматов^31-33 и в hPGCs,³⁶ что позволяет предположить, что XIST также опосредует XCD в этих случаях.

Наше исследование показывает, что XIST может генерировать два функционально различных результата - демпфирование (XCD) и замалчивание (XCI) - и выявляется множество сходных черт между ними: Изоформы XIST (Рисунок S5A), локализация по всему X, белки-эффекторы (CIZ1 и SPEN), последующее осаждение H3K27me3 и H2AK119ub, а также различная степень регуляции X-сцепленных генов. Одно из заметных отличий - хромосома Xd менее компактна, чем Xi. То же самое верно и для пре-Xi на 2-й день дифференцировки mESC.²⁷ Во время инициации XCI у мыши уплотнение происходит только на 4-й день, когда завершается сайленсинг генов и Xist становится ограниченной территорией Xi, что требует действия polycomb комплексов и SMCHD1.^27,65-67,82 Интересно, что для достижения нацеливания SMCHD1 на Xi и максимального сайленсинга для неё необходима дифференцировка.⁶³ Основываясь на этих наблюдениях, мы предполагаем, что отсутствие индуцированного дифференцировкой уплотнения на Xd в нативных hPSCs и пре-Xi на 2-й день может быть причиной неспособности XIST/Xist опосредовать полное замалчивание генов в этих состояниях. Кроме того, более низкие уровни XIST на Xd могут способствовать менее эффективной репрессии генов. Выяснение механистических различий между XCD и XCI представляет собой важную задачу для будущих исследований.

Являясь главным регулятором XCI и XCD, XIST уравновешивает дозировку сцепленных с Х генов между самками и самцами. И наоборот, XIST-опосредованная репрессия аутосомных генов приводит к их экспрессии с перекосом в мужскую сторону (рис. 7N). Таким образом, XIST выполняет противоположные функции, выравнивая экспрессию сцепленных с Х генами и нарушая баланс экспрессии аутосомных генов. Еще один интригующий факт - XIST индуцирует половой диморфизм профилей H3K27me3 в подмножестве своих аутосомных мишеней (рис. 6K). Специфическое для женщин аутосомное отложение H3K27me3 может нести эпигенетическую память и оказывать длительное влияние на развитие, подобно роли H3K27me3 в неканоническом импринтинге и наследовании между поколениями⁸³.

Одним из ограничений данного исследования является то, что меж- и внутрихромосомные взаимодействия не были получены из нативных hPSCs из-за необходимости получения карт контактов высокого разрешения. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы непосредственно изучить роль 3D-структуры в распространении XIST на аутосомы. Кроме того, хотя культивируемые 5iLAF женские hPSCs моделируют предимплантационное плюрипотентное состояние, заметным отличием является то, что женские нативные hPSCs экспрессируют XIST только с одной Х-хромосомы, в отличие от эмбриона с двумя экспрессирующими XIST Х-хромосомами. Тем не менее, моноаллельная экспрессия XIST в hPSCs позволила нам изучить, регулируется ли XIST-ассоциированная хромосома особым образом. Кроме того, несмотря на то, что наша работа выявила опосредованное XIST затухание сцепленных с Х-хромосомой генов, мы не можем исключить возможность того, что регуляция Х-хромосомы^4,84 происходит также на XIST-отрицательной Х-хромосоме.