Появление головы давно признано одним из наиболее важных и примечательных событий в эволюции позвоночных.^1,2 Она является самой сложной структурой тела и действует как первичными воротами для сенсорных стимулов, включая звуки, свет, вкусы и запахи. Голова защищена мышцами и кожей. В ней располагается мозг в нейрокраниуме. Кроме того, она состоит из разнообразных тканей, происходящих из трех зародышевых слоев, точно организованных в эндокринные и экзокринные железы, органы чувств (такие как глаза/сетчатка, внутреннее ухо, вкусовые рецепторы и обоняние), мышцы и др.

Пороки развития головы встречаются примерно у одной трети новорожденных вместе с врожденными пороками развития (около 1/700 живорожденных), это является примером сложного и точного взаимодействия клеток, участвующих в развитии головы человека.³

Клетки нервного гребня (NCCs), в частности, сыграли решающую роль в в формировании головы^2,4 , поскольку они вносят значительный вклад в развитие черепа/черепно-лицевого скелета, хрящей, соединительной ткани, гладких мышц и черепных ганглиев. NCCs вместе с краниальными нейрогенными плакодами также влияют на дифференцировку и миграцию других типов клеток головы.

Клеточные и морфогенетические события, сопровождающие развитие головы были тщательно описаны у большинства позвоночных.^5-7 Эти сравнительные evo-devo исследования выходят за пределы, не ограничиваются современными позвоночными и охватывают ископаемые, в частности. Однако наше понимание ранних стадий развития головы у человеческих эмбрионов остается рудиментарным. Наши нынешние знания о развитии головы человека в значительной степени опираются на анатомические данные, собранные в первой половине XX века с использованием традиционных гистологических методов.^9,10 Однако лишь в нескольких исследованиях для изучения развития органов головы человека использовались клеточно-специфические антитела, что привело к ограниченному и неполному представлению о развитии головы, ограниченному и неполному пониманию основных клеточных процессов.

Цефалический онтогенез, развитие головы, является важнейшим аспектом hominin эволюции, отражающий морфогенное воздействие двуногости и энцефализации.¹¹ Несмотря на обширные исследования по формированию и эволюции мозга,¹² наше понимание развития цефалического скелета у человека отстает от других позвоночных. Современные исследования цефалического развития человека скелетного развития человека в основном опираются на гистологические¹³ или рентгенологические^14,15 методы, которым не хватает разрешения и клеточной специфичности. В результате мы не располагаем всеобъемлющим и динамичным клеточным атласом онтогенеза головы человека.

В последнее десятилетие были разработаны методы очистки тканей для изучения клеточной организации интактных человеческих органов.¹⁶ Эти методы позволяют визуализировать конкретные клетки с помощью иммуногистохимии и их картирование в 3D с помощью light-sheet fluorescent microscopy (LSFM).^17,18 Мы применили эту комбинацию иммуномечения в цельной массе и 3D для анализа эмбриологии человека.^19,20 Здесь мы использовали эту стратегию для описания развития головы человека между пятой и тринадцатой неделями после оплодотворения (PCW5-PCW13).

Для изучения развития головы человека мы использовали эмбрионы и плоды (табл. S1A и STAR Methods) из Французского биобанка Hudeca https://hudeca.genouest.org. Всего было использовано 76 образцов (как целых, так и препарированных), в том числе 27 эмбрионов (PCW5.5-PCW7.9, из них: 18 самцы, 4 самки, 5 неизвестны) и 49 плодов (PCW8.0-PCW13, из них: 20 самцов, 22 самки, 7 неизвестны). Все изображения получены из отдельных образцов и не являются усредненными реконструкциями нескольких образцов. Соответствие между образцами и рисунками или фильмами представлено в таблице S1D. Все антитела прошли первичную оптимизацию разведения с использованием криостатных срезов фрагментов тканей человеческих эмбрионов. Всего для данного исследования было отобрано 70 антител, из которых из которых 36 показали положительное и воспроизводимое окрашивание в 3D (Таблица S1B). Для обеспечения специфичности антител мы опирались на результаты предыдущих исследований, проведенных на эмбрионах мыши, и учитывали известное субклеточное расположение распознанных эпитопов. Мозг не был включен в нашу работу, поскольку он был широко изучен и создание клеточного атласа развивающегося человеческого мозга выходит за рамки данного анализа.

Предыдущие исследования, сочетающие иммуноокрашивание и очистку тканей основывались на классическом двухэтапном методе, когда сначала проводилась инкубация с первичными антителами и последующей инкубацией со вторичными антителами, конъюгированными с флуорофорами, что приводит к усилению сигнала. Однако такой подход ограничивает количество одновременно используемых антител, поскольку они должны быть получены из разных видов, чтобы избежать перекрестного взаимодействия. Это ограничение может быть преодолено путем мультиплексирования с использованием конъюгированных антител, и были разработаны процедуры циклического иммуноокрашивания для срезов тканей.²¹

Стремясь расширить спектр комбинаций антител, cначала мы оценили эффективность прямых конъюгированных антител для маркировки крупных образцов эмбрионов и плодов человека и очистки iDISCO/iDISCO+. Благодаря этому подходу мы добились надежного пассивного окрашивания с использованием нескольких конъюгированных антител (табл.S1B). Кроме того, для некоторых образцов мы провели второй раунд окрашивания. После первого раунда иммуноокрашивания образцы обрабатывали перекисью водорода (H₂O₂), которая, как было показано ранее, обесцвечивает флуорофоры, такие как красители Alexa²¹. Образцы регидратировали и подвергали второму раунду иммуноокрашивания с конъюгированными антителами, после чего проводили второй раунд очистки и визуализации. Всего было обработано 76 образцов (целые и препарированные части), в результате чего было получено 400 LSFM-сканов при различных увеличениях. На каждый образец приходилось до 4 отдельных каналов. Это составляет более полумиллиарда отдельных цифровых срезов (файлы OME.TIFF) размером менее 4 мм и около 70 TB данных изображений.

Недавние исследования²² вызвали новый интерес к эмбриологии черепа человека, особенно к пониманию формирования паттерна и роста базального хондрокраниума.^23-26 Хотя анатомические детали основания черепа человека были задокументированы еще в работах His²⁷ и Sutton²⁸ , происхождение и сборка отдельных его компонентов оставались неуловимыми²⁹.

Гистологический анализ³⁰ и методы радиовизуализации¹³ выявили последовательное формирование клиновидной кости из слияния семи различных элементов. Однако отсутствие специфических маркеров для мезенхимных, хондрогенных и остеогенных тканей препятствует точному картированию ее топографии и пониманию её связей с прилегающими структурами.

Здесь мы изучили хондрогенез в образцах PCW5.6-PCW11. Для визуализации развивающегося черепа мы использовали антитела против Sex-determining region of chromosome Y (SRY)-бокссодержащего гена 9 (Sox9), транскрипционного фактора, экспрессирующегося в хрящевых предшественниках, и против его последующей мишени и хондрогенного маркера коллагена 2 (Col2), основного компонента хрящевого матрикса.

Во-первых, мы создали конвейер 3D-rendering (очистки) с использованием иммуномечения Col2 целого эмбриона на ст. PCW7 (рис. 1). Сырой сигнал (рис. 1А) был обработан с помощью интерфейса виртуальной реальности (VR) (syGlass) и программного обеспечения Imaris для сегментирования и создания сетчатых структур. В области головы мы успешно идентифицировали и визуализировали все распознанные хондрогенные шаблоны в соответствующих местах (рис. 1D-1F и S1, а также на видеороликах S1A и S1B).

С помощью Col2 можно было визуализировать элементы хондрокраниума и их взаимосвязанные сочленения. На ст. PCW7 основание черепа демонстрирует хорошо организованное расположение, сосредоточенное вокруг будущей клиновидной кости (рис. 1J). Клиновидная кость соединяется антеро-дорсально с капсулой носа (Рисунок 1G), антеро-вентрально с подъязычной костью и хрящом Меккеля (Рисунок 1H), латерально - с пирамидой височной кости и костями внутреннего уха (Рисунок 1K) и с вентро-задне-передней частью хондрогенных компонентов предположительной затылочной кости (Рисунок 1L).

Кроме того, мы исследовали рост хондрокраниума по сегментации иммуноокрашивания Sox9 со ст. PCW5.6 до PCW11.3 (рис. 1M). Примечательно, что на ранних стадиях наблюдался значительный рост предположительно затылочной кости по сравнению с другими хондрокраниальными структурами. Однако со ст. PCW8 по PCW11.3, ее рост оставался умеренным по сравнению с другими структурами. Особенно примечательным было значительное расширение элементов клиновидной кости (рис. 1М), охватывающее все размеры и заметно затрагивающее переднюю часть, участвующую в формировании орбиты. Чтобы понять, как сфеноидальные элементы соединяются с соседними структурами во время сборки основания черепа, мы использовали как Sox9, так и Col2 (рис. S1). На ст. PCW5.6 сегментированное окрашивание Sox9+ выявило большую центральную массу, фланкированную двумя меньшими продырявленными массами (Рисунок S1), соответствующими basisphenoid (медиально) и ala temporalis (латерально). Этот противоречит предыдущему сообщению,²² и более соответствует рентгенологическому описанию¹³ , указывающим на то, что клиновидная кость изначально формируется как составное образование. Интересно, что в нашем исследовании реконструкция ясно показывает, что клиновидная кость уже связана как с петрозальным, так и с вентро-дорсальным хондрогенными компонентами презумптивной территории затылочной кости уже на ст. PCW5.6, что опровергает представление о последовательном формировании. Напротив, носовая капсула развивается как единое целое, независимо и на расстоянии от сфеноидальной территории (рис. S1). Быстрая дифференциация и усложнение сфеноидальных элементов становятся очевидными к ст. PCW7 (рис. 1). Лобные элементы, прилегающие к носовой капсуле, подверглись значительному расширению (рис. S1), а создание сочленений с будущей petrous костью (латерально) и базиозатылочной костью (заднебоковой) способствует формированию окончательной формы основания черепа. Это включает в себя формирование отверстия, позволяющего проходить нейральным элементам (рис. S1). К ст. PCW11.3 малые крылья достигают приблизительной взрослой анатомии, в то время как ala temporalis еще не полностью сформировались как большие крылья, что еще больше подчеркивает дифференциальный рост хондрокраниальных структур. На ст. PCW7 окрашивание Sox9 и Col2 показало значительное перекрытие во всех хондрокраниальных структурах. Однако при более тонком масштабе Sox9-позитивные клетки были распределены менее плотно, и располагались более центрально, в то время как Col2-экспрессирующие клетки распространялись на периферию и достигали более обширных территорий, таких как дорсальная задняя территория, где расположены затылочная, орбитосфеноидальная и базиоципитальная кости, которые будут формироваться и окостеневать. Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинированное использование обоих маркеров охватывает все хондрогенные элементы, включая активно пролиферирующие, такие как dorsum sellae, а также более развитые, расположенные на дорсальных границах в контакте с областями, предположительно подвергающимися интрамембранозному окостенению.

Голова и шея человека включают в себя более 75 мышц с каждой стороны, которые отвечают за управление различными движениями, таких как движениями глаз, губ и языка, мимикой, положением и поворотом головы, речью, жеванием. ^31,32 Предыдущие исследования развития мышц головы человека опирались на окрашивание гематоксилином и эозином,³³ а более раннее исследование лицевых мышц плода позволило предположить, что их развитие не завершено на ст. PCW10.³⁴ Совсем недавно была проведена компьютерная 3D-реконструкция мышц головы одного человеческого эмбриона.



Рисунок 1. 3D Analysis of the human chon#drocranium development

All panels are LSFM images of solvent-cleared embryos and fetus, immunostained with anti#Collagen 2 (A–L) or anti-Sox9 (M) antibodies. (A–C) Lateral 3D views of a PCW7 embryo illus#trating the image processing pipeline. Raw image data (A) are segmented using syGlass (B) to isolate all cartilage templates and a mesh image is built (C) for 3D rendering. (D and E) (D) All individual skeletal elements have been colored (lateral view). (E) is a frontal view of the same embryo. (F–M) (F) High-magnification 3D rendering of the cranium with all developing cartilage elements pseudocolored. Names appear on the chart on the right of the image. (G)–(L) are views of each element taken in situ (top panels) or isolated (bot#tom panels). The nasal capsule (G) assembles the mesethmoid (Mes) and ectethmoid (Ect). The hyoid and the larynx (elements numbered 1–4) are seen in (H). In (I), The Meckel’s cartilages join at the symphysis (arrowhead). (J) Frontal (upper panel) and superior (lower panel) views of the sphenoid. (K) shows the inner ear bones (dark purple, malleus; pink, incus; red, stapes) and their inser#tion in the petrous (yellow). In (L), the basilar pro#cess (arrowhead) and foramen magnum (asterisk) of the chondrogenic ventro-posterior component of the presumptive occipital bone complex are seen. (M) displays the developmental time course of the cranium in human from 5.6 to 11 PCW. All panels are 3D rendering images generated with syGlass from LSFM images of embryos (PCW5.6, PCW7, and PCW8) and fetus (PCW11.3) immu#nostained with anti-Sox9. Images are presented at the same scale to illustrate the growth of the cranium. See also Figure S1. Scale bars: 2 mm in (A)–(D) and (L, top panel), 4 mm in (E), 1 mm in (F)–(K), 3 mm in (L, bottom panel), and 1.5 mm in (M).

показано, что по меньшей мере 30 мышц головы и шеи еще не сформированы к концу эмбриогенеза в 8 недель.³⁵ В отличие от мышц туловища, которые происходят из сомитов, мышцы головы имеют смешанное происхождение.³⁶ Хотя большинство их предшественников происходит из несегментированной пресомитной параксиальной мезодермы, мышцы языка и некоторые мышцы глотки, гортани и шеи происходят из затылочных сомитов.^37,38 Кроме того, генетическая программа, управляющая дифференцировкой мышц головы из мезодермы черепа, отличается от программы дифференцировки скелетных мышц туловища, которые сомитного происхождения.³⁹ В нашем исследовании мы использовали антитела против тяжелой цепи миозина (MHC) для идентификации дифференцированных мышц (рис. 2А). Использование системы syGlass облегчило сегментацию отдельных мышц по всему телу (рис. 2B-2D и Видео S2). Мышцы головы получают иннервацию от двигательных нейронов расположенных в среднем и заднем мозге, в частности в девяти моторных ядрах (III, IV, V, VI, VII, IX, X, XI и XII). Визуализация развивающихся двигательных нервов была достигнута с помощью анти-Choline acetyl



Figure 2. 3D analysis of the development of head and neck muscles in human embryos

All panels are LSFM images of a solvent-cleared embryos immunostained with anti-MHC (A–E, G, H, and J–M), anti-synaptophysin (F, G, I, J, L, and M), and anti-Sox9 (M). (A) Raw image of a lateral view of the embryo. (B–D) Lateral (B and C) and dorsal (D) views of the muscles of a PCW6.5 embryo segmented using syGlass. 14 muscle modules are differentially pseudocolored. (B) shows an overlay with the surface shading image (gray). (E–G) Lateral view of the tongue (To) and larynx (Lar) of a PCW7.5 embryo with all muscles (E) and nerves (F) segmented. (G) Merged image of the muscles and nerves. (H–K) Frontal view of the tongue of a PCW5.6 embryo with all muscles (H) and nerves (I) segmented. (J) Merged image of the muscles and nerves. (K) shows all individual tongue muscles. (L and M) Frontal view of the face of a PCW8 em#bryo with a 3D overlay of muscles (red) and nerves (white) illustrating the complexity of the staining and raw image before segmentation. (M) is an im#age of the same embryo after segmentation of all extraoculomotor muscles (EOMs; see Figure S4 for the color code), oculomotor nerves, Sox9+ nasal capsule (Nas, gray) and olfactory nerves (ONs, brown). Abbreviations are as follows: V, trigeminal nerve; VII, facial nerve; IX, glossopharyngeal nerve; X, vagus nerve; XII, hypoglossus nerve; Myloh.2, Mylohyoid 2; Geniogl., genioglossus; Sup. Lon, superior longitudinal; Genioh., geniohyoid; and Transv., transverse. See also Figures S2 and S3. Scale bars: 1 mm in (A), (B), (D), (E), and (L); 800 mm in (C) and (M); and 400 mm in (H) and (I); and 300 um in (K).

transferase (ChAT) антител.¹⁹ Двойное иммуноокрашивание на MHC и ChAT позволило нам отследить временные параметры иннервации мышц головы.

Для удобства описания результатов мышцы головы и шеи были разделены на 14 модулей, в которых мышцы cгруппированы на основе их общей функции и/или анатомического расположения (рис. 2 S2 и Таблица S1C). В общей сложности 45 тканей головы эмбрионов и плодов (Таблица S1A).

В первую очередь мы сосредоточились на мышцах языка, которые происходят из затылочных сомитов. Об их развитии известно не так много. Мышцы, присутствующие d языке взрослого человека, были описаны десятилетия назад,⁴⁰ но трехмерное распределение их иннервации было изучено только недавно.^41-43 Наши 3D-изображения развивающейся головы человека позволяют очень точно определить организацию мышц языка и их взаимное расположение. Все мышцы и нервы могут быть извлечены из образцов (n = 19), окрашенных MHC и ChAT или синаптофизином или b3-тубулином (рис. 2 и S3). Это показало, что 7 мышц можно увидеть уже на ст. PCW5.6 (рис. 2H-2K), но последние две мышцы (palatoglossus и pharyngoglossus), все еще отсутствуют на ст. PCW7.5.



Figure 3. Figure 3. Development of the human oculomotor system

All panels are LSFM images of solvent-cleared embryos (A–H) and fetuses (I–N) immunostained with anti-MHC combined with ChAT (A–F, K, and L) or syn#aptophysin (G–J, M, and N). For each specimen, the upper panel corresponds to the merge image of the motor nerves and oculomotor muscle and the lower panel to the nerves. The inset on the left upper side of the figure provides the color code for muscles and nerves. (A and B) At PCW5.6, only 4 muscles are visible. All muscles are innervated except the superior oblique (arrow). (C and D) At PCW6, the 6 extraocular muscles, including the medial rectus (arrowhead) and inferior oblique (arrow) are now present and innervated. (E and F) This is similar at PCW7. (G and H) At PCW8.4, the levator palpebrae starts to split from the superior rectus (arrow in G) and receives a small branch coming from the oculomotor nerve (arrow in H). Note the expansion of the inferior oblique. (I–K) Between PCW9.5 (I and J) and PCW10.4 (K and L), the size of the levator increases and it detaches completely from the superior oblique. (M and N) At PCW11.3, the terminal branches of the nerves occupy the central part of all muscles and display a large bouquet of synaptophysin+ endplates.

Далее мы изучили 6 extraoculomotor muscles (EOMs) и levator palpebrae, отвечающие за движения глаз и верхнего века соответственно (рис. 2L, 2M, 3 и S4 и видеоролики S3B). Их развитие было подробно изучено у многих видов животных,³³ но их временной ход развития не полностью изучен. Отдельные мышцы и 3 глазодвигательных нерва могут быть легко сегментированы из необработанных наборов данных изображений (рис. 2M, 3 и S4). У эмбриона ст. PCW5.6, самого молодого из доступных, можно было выделить латеральную, верхнюю и нижнюю прямые мышцы, а также зачаток верхней косой мышцы (рис. 3A, 3B и S4). Двойное окрашивание с помощью ChAT показало, что только 3 прямые мышцы уже иннервированы (хотя только терминальная часть абдуктивного нерва была помечена; рис. 3C). В отличие от этого, трохлеарный нерв еще не достиг верхней косой мышцы. На ст. PCW6 мышцы увеличились, и они начали принимать свою зрелую морфологию и положение. Хорошо заметна медиальная прямая мышца, а также нижняя косая (рис. 3C), это раньше, чем сообщалось ранее.³³ Между PCW6 и PCW7 все шесть мышц оказывались иннервированы, включая верхнюю косую (рис. 3C-3F и S4B). На ст. PCW8.4, зачаток levator palpebrae начал отделяться от верхней прямой мышцы (Рис. 3G, 3H и S4C) и полностью отделился от неё на ст. PCW10.4 (рис. 3K и 3L). Хотя ChAT специфичен для двигательных аксонов, он не окрашивает двигательные концевые пластинки. Мы не смогли пометить концевые пластинки и с помощью bungarotoxin (данные не показаны), но обнаружили, что anti-synaptophysin окрашивает все двигательные нервы и концевые пластинки (рис. 3M, 3N и S4D). Все периферические нервы, включая сенсорные, можно было отличить от двигательных нервов. Оба типа были иммунореактивны к синаптофизину, но сенсорные нервы являются ChAT- и экспрессируют молекулу клеточной адгезии TAG1/Contactin2 (данные не показаны). Это показало, что (как и в зрелых мышцы), концевые пластинки занимают центральную часть каждой мышцы и что арборизация (ветвление) нервов становится очень плотной на ст. PCW11.3 (рис. 3 и S4 и видео S3C).

Наши данные дают четкое представление об организации среднего и внутреннего уха (Рисунок S5A и Видео S3D), включая stapedius и tensor tympani (Рисунок S5B), две самые маленькие мышцы в теле, а также 3 косточки среднего уха, incus (Рисунки S5C и S5D), malleus (Рисунок S5E) и stapes (стремечко) (Рисунки S5F и S5G). Улитку и полукружные каналы можно было полностью сегментировать только на основе фонового окрашивания, а их иннервация наблюдалась с помощью антител anti-βIII-tubulin (рис. S5H-S5J). Обе мышцы можно было увидеть уже на ст.PCW6.5 (таблица S1C).

Поверхностные и глубокие мышцы расположены под кожей, окружая такие области, как глаза, уши, рот и губы, играют важную роль в мимике и жевании. Вместо того чтобы двигать кости, эти мышцы в основном манипулируют кожей или хрящом. Они происходят из ветвистой мезодермы.⁴⁶ У человека способность двигать наружным ухом или ушной раковиной в основном утрачена и ушные мышцы считаются рудиментарными.⁴⁷ Однако на ст. PCW7.5 все три наружные ушные мышцы и шесть внутренних мышц были обнаружены (Рисунок S5K и Таблица S1C). С помощью двойного иммуноокрашивания на MHC и ChAT (n = 18), мы продемонстрировали, что эти девять мышц иннервируются (Рисунок S5L) и, следовательно, вероятно, функционируют во время формирования ушной раковины. Это подтверждает роль внутренних мышц в морфогенезе ушной раковины.⁴⁸ К ст. PCW11.9 внутренние мышцы увеличились в размерах, образовав почти непрерывное кольцо внутри ушной раковины (рис. S5M). В целом, наши данные показывают, что большинство мышц головы развиваются раньше чем было описано ранее, и, вероятно, все они присутствуют к концу первого триместра беременности.

У человека есть три основные пары слюнных желез: околоушные, подъязычные и подчелюстные железы. Эти железы соединены с полостью рта одним или несколькими протоками и в совокупности вырабатывают не менее одного литра слюны в день. В исследованиях на грызунах было замечено, что эти железы развиваются в процессе, называемом морфогенезом ветвления, который включает в себя последовательное деление и расщепление удлиняющихся протоков.⁴⁹ Однако развитие слюнных желез у человека и конкретные детали морфогенеза ветвления изучены недостаточно хорошо. В первую очередь это связано со сложностью понимания процесса исключительно через двухмерные срезы.⁵⁰ Более ранние исследования, проведенные в основном Институтом Карнеги, показали, что формирование желез ачинается около PCW6.^51,52

Развивающиеся слюнные железы визуализировали с помощью иммуномечения Sox9, который, как известно, экспрессируется в эмбриональном эпителии желез.⁵³ Хотя Sox9 присутствует в таких структурах, как хрящ (рис. 1), Sox9-позитивные железы можно было легко выявлять с помощью VR-направляемой сегментации (рис. 4 и 5 и видео S4A). В общей сложности 38 желез из 20 образцов PCW6-PCW12 были реконструированы. Первые этапы появления околоушных и подчелюстных желез можно было зафиксировать у эмбрионов ст. PCW7-PCW7.5 эмбрионов (рис. 4A и 4B). С каждой стороны каждая околоушная и подчелюстная железа простирается каудально, оставляя позади единственный проток (рис. 4C), который даст начало протокам Stensen и Wharton, соответственно. Развитие субмаксиллярных желез казалось более продвинутым, и они ветвились только на терминальном конце (растущая верхушка), в то время как у околоушной железы несколько боковых также формировались на расстоянии от верхушки. На более поздних стадиях ветвление было более выраженным и распространялось на боковые участки (рис. 4D). На ст. PCW9 подчелюстная железа имела овоидную форму, но ее размер значительно увеличился на ст. PCW11.3 (рис. 4E). Подъязычные железы начали зарождаться в на ст. PCW7 (Рисунок 4A) под языком на каждой стороне рта. После PCW8 некоторые почки начали расти и ветвиться на своей верхушке, но можно было наблюдать новые и менее зрелые отдельные почки (рис. 4F). Это продолжалось и на ст. PCW11, когда на каждой стороне был обнаружен большой массив из более чем 20 желез на разных стадиях сложности (рис. 4G и 4H). Режим ветвления подъязычных желез оказался очень похожим



Figure 4. Development of human salivary glands

All panels are LSFM images of solvent-cleared embryos (A–F) and fetuses (D, E, and G–I) immunostained with anti-Sox9 (A–I) combined with synaptophysin (F, H, and I). Glands immunolabeled with Sox9 were segmented using VR and pseudocolored. (A–C) Dorsal view of the mouth and tongue of PCW7 (A) and PCW7.5 (B) embryos where the nascent parotid (magenta), submandibular (cyan), and sublingual (yellow) glands were segmented and pseudocolored. (C) shows a lateral view of the parotid (arrow) overlaid on the 3D rendering image (gray) of the face. (D and E) Branching morphogenesis of the parotid gland and submandibular glands. A unique duct connects the glands to the mouth. (F–H) Development of the sublingual glands. The first buds are visible at PCW7 and stay rather short until PCW9 when some sublingual glands start ramifying at their apex (F). (G and H) At PCW11.3, the number of glands has increased on both sides and they are distributed beneath the tongue, along all its length, all individually connected to the mouth floor. (H and I) Both the submandibular (arrowheads in H) and sublingual (arrowheads in I) are densely innervated by synaptophysin+ axons emanating from the chorda tympani branch of the facial nerve (VII). Scale bars: all panels are counted from left to right for each row; 700 mm in (A), (B), (D, right), and (I); 1 mm in (C), (G), and (H); 200 mm in (D, left and middlepanels); 100 mm in (E, first panel); 300 mm in (E, second and third panels) and (F, third panel); and 500 mm in (E, fourth panel) and (F, all panels except for the third)



Figure 5. Figure 5. Development of human lacrimal glands All panels are LSFM images of solvent-cleared eyes and heads immunostained with anti-Sox9/

(A–H) and combined with MHC (A) and synaptophysin (D). (A) Frontal view of the left eye of a PCW11.3 fetus. The orbiculari oculari muscle is seen as well as the upper (uel) and lower (lel) eye lids. The eye is pseudocolored in blue. The lacrimal gland (arrowheads) and its individual ducts (colored) are seen lying on the superolateral side of the eyeball. (B–D) Organization the lacrimal gland in a PCW10.1 fetus. (B) shows the raw image obtained with Sox9 staining. In (C), all individual subglands are individually segmented and pseudocolored, the longest one in red. (D) shows the time course of lacrimal gland development, in situ on the eyeballs, between PCW7.5, when only a few buds are observed, and PCW11.3. (E) All images are at the same scale to illustrate the growth of the lacrimal glands. All subglands have been individually segmented and colored. The color code is conserved, with the longest one in red as a reference (see also Figure S6). (F) Frontal view of the face and nose/mouth of a PCW7.5 embryo stained with anti-Sox9. Overlays are 3D rendering images of the face (in gray). The superior (slc) and inferior (ilc) lacrimal canaliculi and nasolacrimal duct (ld) have been segmented and pseudocolored in orange. (G–H) The developing eye lashes are labeled with Sox9 and form 2 arrays lining the edges of the upper (uel) and lower (lel) eyelids at PCW11.3 (arrowheads in G and H). At PCW13 (H), the number of Sox9+ buds has increased and might also include the developing meibomian glands. Related to Figure S6. Scale bars: all panels are counted from left to right for each row; 150 mm in (A); 500 mm in (B, left panel), (D), and (E, fourth panel); 400 mm in (B, right panel), (C), and (E, all panels except for the first and fourth); 200 mm in (E, first panel); and 1 mm in (F)–(H).

на подчелюстную железу, с выраженным расщеплением на кончиках а не вдоль базальных протоков (рис. 4G-4I). Подъязычная и подъязычные и подчелюстные железы также получают плотную иннервацию от синаптофизин+ аксонов (рис. 4I).

Слезные железы вырабатывают слезную пленку, которая необходима для зрения и для гомеостаза роговицы. Как и в случае с другими головными железами, их развитие было изучено только на гистологических срезах.⁵⁴ У взрослых они расположены в орбите на дорсолатеральной стороне глаза, и возникают во время развития (рис. 5А и видеоролики S3C и S4B). Используя Sox9⁵⁵ , мы смогли зафиксировать все ранние фазы развития слезных желез (n = 30 глаз, от ст. PCW7 до PCW11.8). Иммуноокрашивание образцов на ст. PCW10.1 (рис. 5B, 5C и S6C) показало, что слезные железы состоят из множества отдельных протоков. Эти протоки простираются каудально вдоль поверхности глаза и формируют густые ветви в каудальной области. В отличие от мышей, у которых слезные железы формируются путем постепенного разветвления одного протока, у человека это происходит иначе. Чтобы лучше понять морфологию переплетенных подглазничных желез, мы использовали VR для для их сегментации и визуализации (рис. 5B, 5C и S6). В пределах каждого глаза длина и сложность каждой подглазничной железы демонстрировали значительную вариабельность. Эта вариативность наблюдалась не только между глазами разных лдюдей , но и между правым и левым глазом у одного и того же индивида (рис. S6). Хотя одна подглазничная железа, как правило, оказывалась более развитой, чем другие, общее общее количество подглазных желез сильно различалось между глазами, даже в пределах одного и того же эмбриона. Кроме того, длина и сложность желез вдоль медиально-латеральной оси также различались. Во время PCW7, на каждом глазу наблюдалось несколько Sox9+ зачатков (рис. S6A). Количество этих почек увеличивалось, по крайней мере, до ст. PCW11, при этом короткие зарождающиеся почки все еще были видны на медиальной и латеральной сторонах вблизи века (рис. 5D и 5E). Интересно, что развивающиеся носо-слезные протоки, которые собирают слезы и переносят их в носовой полости, также можно выделить с помощью иммуноокрашивания Sox9 (рис. 5F). На ст. PCW11.3 Sox9 также был обнаружен в массивах из небольших круглых структур, выстилающих апикальный край верхнего и нижнего века (Рисунок 5G). На ст. PCW13 их количество значительно увеличилось (Рисунок 5H), и они были обнаружены как на внутренней, так и на внешней стороне век. Эти структуры, вероятно, соответствуют зарождающимся ресничным фолликулам и первым эпителиальным зачаткам мейбомиевых желез.⁵⁶ Режим ветвления подъязычных желез оказался очень похожим.

Padget⁹ основывает свое описание развития сосудов головного мозга человека на графических реконструкциях ²² секционированных эмбрионов из коллекции Карнеги в возрасте от 3 до 7 недель (предполагаемый возраст овуляции) и от 3 (20 сомитов) до 40 мм длины крестца (около 10-11 PCW).⁵⁷ Результаты этого описания до сих пор не воспроизведены внешне и, что самое важное, несмотря на изысканность описания, оно остается неполным. В самом старом образце, описанном Padget, окончательная анатомия задней мозговой артерии (PCA), например, еще не была описана и детали ее развития остаются нерешенными⁹. В данном исследовании трехмерная организация и развитие артерий головы и шеи были проанализированы у 6 эмбрионов ст. PCW5.6-PCW9 (4 полноценных эмбриона и 2 изолированных образца головы и шеи) с помощью иммуноокрашивания на гладкомышечный актин (SMA; рис. 6A-6E). SMA был выбран, так как ранее было показано, что он различает стенки артериальных сосудов с высокой специфичностью.¹⁹ В сочетании с SMA в различных образцах использовались и другие маркеры, включая различные комбинации MHC (данные не показаны), синаптофизин (Рисунок 7H), белок, ассоциированный с везикулами плазмы PLVAP (Рисунок 6D), и маркер Soo. (Рисунок 6D) и Sox9 (Рисунки 6C и 7A), что позволило четко определить идентификацию сосудов по отношению к основным анатомическим ориентирам включая развивающийся нейро- и спланхнокраниум (рис. 6K, 7B, 7C и 7G), позвоночник (Рис. 6M), гортань (Sox9; Рис. 6L), хороидное сплетение (PLVAP; рисунки 6D, 6K, 7J и 7L), мышцы (MHC; данные не показаны) и нервы (синаптофизин; Рисунок 7H). У эмбрионов не было обнаружено признаков врожденной аномалии, за исключением одного образца (PCW5.6), у которого сердце оказалось снаружи грудной полости, что связано либо с травмой, либо с редким врожденным пороком развития, называемым ectopia cordis.⁵⁸ Несмотря на этот возможный врожденный дефект, образец был оставлен для анализа, поскольку он был самым молодым во временной серии и демонстрировал ряд преходящих артериальных структур на незрелой стадии развития (рис. S7A и S7D). В 3 из 6 образцов качество иммуноокрашивания артериальных стенок было признано превосходным, что позволило провести обширный анализ сегментов артерий головы и шеи (рис. 6, 7, S7A-S7D и видео S5A). На ст. PCW5.6 (рис. S7A и S7D) и PCW7 (рис. 6E-6K и видео S5A), в общей сложности S5A) были идентифицированы и выявлены сегменты 95 и 159 отдельных артерий и артериальных сегментов головы и шеи, соответственно. Серия развития отражает последовательность событий приводящих к формированию у взрослого человека наружной сонной и глазных артерий через переходную stapedial артерию (рис.S7A-S7D и видео S5A).^9,59 Для того чтобы лучше продемонстрировать создание глазной сосудистой сети и поскольку дистальные артериолы были отрицательными для окрашивания SMA, 11 глаз, варьирующих от ст. PCW5.4 - PCW12.3, были помечены на PLVAP и проанализированы. Это наглядно продемонстрировало различие хороидной и гиалоидной сосудистых сетей эмбрионального глаза, питаемые цилиарной и гиалоидной ветвями глазной артерии, соответственно (рис. S7E-S7H и Видео S5B).

Особое внимание было уделено созданию церебральных артерий (рис. 7). Представленные данные позволяют определить происхождение PCA (рис. 7C и 7I-7L). В самом молодом образце (PCW5.6), каудальный отдел (будущая задняя сообщающаяся артерия) внутренних сонных артерий (ICAs), соединяясь билатерально с краниальной верхушкой базилярной артерии, дает начало примитивной задней задней хороидальной артерии, диэнцефальной артерии и мезенцефальной артерии (рис. 7I). Примитивные задняя хороидальная и диэнцефальная артерии возникли из общего ствола у всех образцов (рис. 7C и 7I). На ранней стадии средняя мозговая артерия и передняя мозговая артерия появляются как проксимальные латеральные и дистально-медиальные ветви переднего отдела ICA, соответственно, затмевая примитивную обонятельную артерию, при этом передний коммуникационный комплекс еще не сформирован. (рис. 7D). В том же образце, однако, ICA не идентифицирована. Обе примитивные передняя и задняя хороидальные артерии присоединялись к хороидному сплетению телеэнцефалических пузырей (отделов), где они анастомозируют (также видно на PCW7, рис. 7J и 7L). В образцах PCW7 и PCW8.4 круг Willis был полным (рис. 7E и 7F), а примитивные задние хороидальные артерии дают начало пост-хороидальным ветвям, возникающими вдоль ствола примитивной задней хориоидальной артерии и проходящими вдоль медиальной стенки задней части телэнцефвлона (Figures 7K and 7L), in что, по сути, является территорией взрослого PCA.

Наконец, для облегчения визуализации полностью аннотированных 3D-изображений и их использования в просветительских и учебных целях, были созданы интерактивные 3D-модели эмбриональных головных артерий и скелета путем экспорта сегментированных сеток в Verge3D, т.е. веб-интерфейс и инструментарий (рис. S7I-S7L и видео S6A- S6C; см. методы STAR и дополнительную информацию).

Врожденные пороки развития встречаются более чем у 3% новорожденных, но, несмотря на их распространенность, молекулярные механизмы, лежащие в основе межклеточных взаимодействий и правильного морфогенеза тканей у человека, остаются в значительной степени неизвестными. Нарушения развития могут иметь пожизненные последствия для пострадавших людей, поэтому крайне важно понимать



Рисунок 6. Figure 6. 3D analysis of developing cephalic arteries in human embryos

(A–D) Head and neck vascular segmentation in a PCW7 embryo immunostained for SMA (A, lateral view and B, frontal view), SOX9 (C) and PLVAP (D). (E–H) Segmentation and mesh generation of the basilar artery (BA). (I–K) Isolated segmented head and neck arterial vasculature with randomization of individual arte#rial segment colors is shown in frontal (I) and lateral (J) views. (K) shows head and neck arteries in conjunction with semi-transparent meshes of reference cartilaginous structures (white) and the choroid plexuses (green). (L) Frontal view showing the right and left superior thyroid arteries (STAs) in relation to the thyroid cartilage (TC). Also showing the common carotid arteries (CCAs) and lingual arteries (LAs). (M) Frontal view of the right (R VA) and left (L VA) vertebral arteries in relation to semi-transparent cervical vertebra (numbered C1–C7). Related to Figure S7. Scale bars: 2.5 mm in (A)–(C), (E), (J), and (K); 1 mm in (D); 500 mm in (F)–(H), (L), and (M); and 2 mm in (I).

Выяснить причины их возникновения и разработать соответствующие терапевтические стратегии, включая внутриутробные вмешательства. Модели животных позволили получить ценные сведения о дисрегуляции онтогенетических событий, но они лишь частично воспроизводят специфические для человека последовательности и процессы развития, характерные для человека.^60,61 Это несоответствие привело к возобновлению внимания к исследованиям в области эмбриологии человека и появлению полученных из стволовых клеток человека in vitro моделей эмбриогенеза.^62-66 Однако в этой области до сих пор отсутствуют точные эталонные клеточные атласы человеческих эмбрионов и текущие знания основаны в основном на устаревших исследованиях. Несколько недавних исследовательских инициатив, таких как таких как проект "Атлас клеток человека", направлены на использование передовых технологий для идентификации типов клеток человека на протяжении всего развития и построения клеточных карт высокого разрешения развивающихся органов человека.^67,68 Хотя секвенирование РНК одной клетки позволяет идентифицировать типы клеток и предсказывать траектории движения клеток в органах человеческого эмбриона, оно не способно захватить и сохранить пространственную информацию.^69-72 Коммерческие технологии пространственного генома, хотя и способны к анализу транскриптома и другой молекулярной информации ^{in situ}, в настоящее время ограничены срезами тканей.^73,74 Однако недавние исследования показывают, что 3D пространственная транскриптомика возможна.^75,76 Таким образом, сочетание иммуноокрашивания целых образцов и трехмерной визуализации по-прежнему представляет собой наилучшую возможность для построения 3D карт развития эмбриогенеза человека.

В данном исследовании мы применили эту стратегию к развивающейся человеческой голове и создали наборы 3D-изображений in situ различных тканей и органов, включая мышцы, хрящи и секреторные железы. Эти наборы данных доступны через специальный интерфейс веб-сайта. Примечательно, что с помощью сегментации изображений мы создали 3D-модели человеческих эмбрионов с высоким разрешением, которые можно просматривать с помощью различных платформ, таких как виртуальная реальность, интерактивные веб-интерфейсы и даже 3D-печать. Эти модели также являются учебным пособием для студентов-медиков.

Одним из ограничений нашей системы визуализации является одновременная визуализация ограниченного числа маркеров (максимум 4). Однако, наше исследование демонстрирует, что рекомбинантные конъюгированные антитела эффективно работают с нашим протоколом, позволяя использовать человеческие антитела и сочетать несколько типов антител, выращенных от одного и того же вида. Этот вывод подтверждает предыдущее сообщение, сделанное у взрослых мышей⁷⁷ , а наши предварительные данные открывают перспективы для адаптации методов циклического иммуноокрашивания, разработанных для двумерных срезов⁷⁸. Это позволит проводить несколько раундов окрашивания и очистки, расширяя спектр маркеров, которые могут быть использованы в одном и том же образце человека.



Figure 7. igure 7. Closure of the arterial circle of Wil#lis and establishment of major cerebral arteries

Superior view of the circle of Willis in a PCW7 embryo (A–C and E).(A) The circle is fed by the right and left internal carotid arteries (ICAs) and the basilar artery (BA). (B and E) All segments of the circle of Willis are conspicuous including the caudal division of the ICA, subdivided into the most posterior P1 segment and posterior communicating (PCom) segment, the cranial division of the ICA with the adult ICA terminal segment, proximal A1 (distal to the origin of the middle cerebral artery (MCA) and proximal to the origin of the primitive olfactory ar#tery (POA)), distal A1 and anterior communicating artery (ACom). (C) Both MCA and post communicating anterior cerebral artery (ACA) are well identified. Posterior branches of the circle of Willis include the mesencephalic arteries (MesAs) as well as the primitive posterior choroidal arteries (PPChoAs) and diencephalic arteries (DiAs) arising from a common trunk (yellow). (D–F) Anterior closure of the circle of Willis and subsequent growth in PCW5.6, PCW7, and PCW8.4 specimens. The series shows how the anterior cerebral artery first appears as a medial branch of the POA, before overshadowing the latter. (G and H) The POA is shown to course into the nasal capsule along the olfactory filaments (H). Notice the medial striate arteries (MSAs) or recur#rent arteries of Heubner arising from the peri#communicating segment of the ACA. (I) The stem of the posterior cerebral artery (PCA) is represented by the most distal segment of the ICA caudal division (P1 segment). Notice the asymmetry of the P1 segments in the PCW5.6 embryo, showing early onset of a classical circle of Willis variant. (J) The telencephalic choroid plexus (TCP) or choroid plexus of the lateral ventricule, is seen to be fed by both the anterior choroidal artery (AChoA) and the PPChoA. (K) In another late PCW7 specimen, the PPChoAs give rise to prominent branches (yellow arrows) terminating at the medial posterior surface of the cerebral hemispheres (white stars). (L) The adult posterior cerebral artery is a com#posite vessel combining the posterior segment of the ICA caudal division (1; blue), the diencephalic-choroid common trunk (2; yellow), the proximal stem of the primitive posterior choroidal artery (3; pink), and postchoroidal branches (4; beige) that are shown to vascularize the posterior and medial surface of the developing telencephalic vesicles. The terminal choroidal branches are likely represented in the adult by the lateral posterior choroidal arteries. Related to Figure S7. Scale bars: 1 mm in (A)–(H), (J), and (K) and 500 mm in (I) and (L)

Кроме того, наши результаты дают представление о ранних этапах морфогенеза секреторных желез в голове человека. Биологи, занимающиеся вопросами развития, широко изучают морфогенез ветвления, который объясняет регуляцию древовидных структур с тысячами ветвей.⁷⁹ Неотъемлемый вклад генетически закодированной программы развития и влияния факторов окружающей среды (таких как морфогены, силы и клеточные контакты) был внесен исследованы на грызунах на моделях слюнных желез^53,80 и слезных желез.^81,82 Однако, за исключением исследований столетней давности,⁸³ такая информация недоступна для человеческих эмбрионов. Наше исследование предполагает существование стереотипного паттерна роста, но также подчеркивает значительную индивидуальную вариабельность этого процесса. В частности, слюнные и слезные железы состоят из крайне неоднородного множества отдельных желез, которые не расширяются и не ветвятся, растут не с одинаковой скоростью и темпом, что приводит к различной сложности ветвления соседних subglands. Более того, в отличие от мышей, у которых слезная железа имеет один секреторный проток, слезные железы человека состоят из переплетенных между собой отдельных subglands. Изучение их 3D-взаимодействия прольет свет на то, как их способ ветвления отличается от такового у грызунов, что позволит получить важные сведения для оценки значимости развития недавно разработанных органоидов слезной и слюнной желез человека. ^55,84

Комбинируя иммуноокрашивание всей поверхности, очистку тканей, и визуализации light-sheet, появляется возможность пересмотреть и углубить наше понимание развития человеческих артерий головы и шейных артерий. Такой подход минимизирует риск погрешности реконструкции, а также позволяет получить более полное описание их развития. У взрослого человека PCA зарождается проксимально, в прекоммуникационных (P1) или посткоммуникационных (P2) сегментах, растет к медиальной задней хороидальной артерии, а дистальнее - к латеральной задней хороидальной артерии, связь которой с примитивной задней хороидальной артерией остается неясной.^85,86 На основании представленных данных мы можем интерпретировать PCA как преимущественно представляющий ствол примитивной задней хороидальной артерии. Постеро-медиальные телеэнцефалические ветви становятся доминирующими и вытесняют хороидальные ветви, которые впоследствии развиваются во взрослые латеральные задние хороидальные артерии. Эта интерпретация согласуется с наблюдением, что только взрослая латеральная задняя хороидальная артерия анастомозирует с передней хороидальной артерией.^85,86 Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями на эмбрионах крыс.⁸⁷ В целом, данное исследование дает представление об эмбриологическом происхождении и развитии церебральных артерий, проливая свет на сложный состав и взаимоотношения этих сосудистых структур.

Анатомическое образование все больше опирается на смешанные подходы к обучению, включающие 3D-представления анатомических образцов и интерактивных веб-интерфейсов в качестве очень ценных^88-90 Мы твердо уверены, что предоставление удобных для пользователя веб-интерфейсов с 3D-реконструкциями реальных человеческих эмбрионов, может послужить мощным инструментом для возрождения образования в области эмбриологии человека.

Хотя все образцы были тщательно осмотрены эмбриологами на предмет возможных аномалий и считаются здоровыми (за исключением одного эмбриона с эктопией Кордиса), мы не проводили генетический анализ или кариотипирование. Поэтому некоторые из эмбрионов и плодов, изученных здесь, могут нести мутации и иметь дефекты развития. Будет важно расширить этот аналитический подход на патологические эмбрионы с выявленными генетическими дефектами, а также лучше учесть возможные половые различия.

Мы предоставляем лишь приблизительный пространственно-временной 3D-шаблон и эталон развития органов и тканей головы, и потребуются дополнительные эксперименты для полного описания клеточных и молекулярных механизмов, формирующих отдельные структуры головы. Профилирование клеток с помощью транскриптомики и протеомики для идентификации всех типов клеток в тканях головы необходимо, прежде чем мы сможем попытаться составить их точную карту. Это потребует дальнейшего расширения возможностей мультиплексирования антител.

Этот анализ также ограничен образцами, находящимися на стадии PCW5.6 - PCW14, и поэтому мы пропускаем ранние фазы сборки головки (например, миграция NCC), а также заключительные этапы построения и ремоделирования тканей. Например, большая часть развития нейрокраниума и черепных швов происходит после ст. PCW14. Кроме того, иммунная система и центральная нервная система должны быть включены в будущие исследования. Наконец, мы показали, что сегментация с помощью VR может обрабатывать очень большие наборы данных изображений. Однако подходы искусственного интеллекта (ИИ) и глубокого обучения должны быть реализованы, чтобы облегчить 3D-реконструкцию образцов. Это позволит увеличить скорость анализа, особенно для крупных фетальных органов, и ограничить погрешности, присущие сегментации изображений, выполняемой человеком.