Ключевой особенностью терапевтических IVT мРНК является содержание в них модифицированных рибонуклеотидов, которые, как было показано, снижают врожденную иммуногенность и могут дополнительно повышать стабильность мРНК, что является благоприятными характеристиками для мРНК-терапии^1-5. Например, клинически одобренные мРНК-вакцины SARS-CoV-2 включают N1-метилпсевдоуридин (1-methylΨ), который, как было показано, снижает врожденную иммуногенность мРНК IVT^3-5. Некоторые модифицированные рибонуклеотиды, такие как 5-метилцитидин (5-метилС), являются естественными пост-транскрипционными модификациями мРНК у эукариот, в то время как другие не являются таковыми, например 1-methylΨ (ссылки ^6-10).

Мы исследовали, как 5-метоксиуридин (5-methoxyU), 5-метилС и 1-methylΨ влияют на трансляцию мРНК IVT. 5-methoxyU, 5-methylC и 1-methylΨ использовались в IVT мРНК в попытке увеличить синтез рекомбинантного белка in vitro и для до-клинического доказательства концепции терапии на основе IVT мРНК^11,12. Как уже упоминалось, 1-methylΨ является рибонуклеотидом, включенным в лицензированные вакцины SARS-CoV-2 на основе IVT мРНК, а также в разрабатываемые человеческие вакцины и терапию на основе мРНК^2,13,14.

Несмотря на их широкое применение, удивительно мало известно о том, как модификация рибонуклеотидов влияет на синтез белка, особенно на трансляцию терапевтических мРНК IVT. Нас интересовало, как модифицированные рибонуклеотиды влияют на точность трансляции мРНК, по нескольким причинам. Некоторые модификации рибонуклеотидов могут перекодировать последовательности мРНК (например, инозин¹⁵). Ранее было показано, что 5-метилС усиливает неправильное прочтение во время трансляции мРНК у прокариот, однако его влияние на точность трансляции эукариотических мРНК не изучалось¹⁶. Влияние 5-methoxyU на точность трансляции не изучалось. Известно, что псевдоуридин (Ψ) увеличивает неправильное прочтение стоп-кодонов мРНК у эукариот и может влиять на неправильное прочтение во время трансляции прокариотических мРНК^16-18. 1-methylΨ, по-видимому, не влияет на неправильное прочтение кодонов, но, как было показано, влияет на скорость синтеза белка и плотность рибосом на мРНК, что позволяет предположить его прямое влияние на трансляцию мРНК^19,20.

В настоящее время неясно, какие модифицированные рибонуклеотиды влияют на точность трансляции мРНК, а существующие исследования в основном ограничиваются пониманием частоты неправильного прочтения только определенного кодона. Кроме того, неправильное прочтение кодонов мРНК - это лишь один из видов пост-транскрипционных механизмов, которые могут изменять полипептидную последовательность. До сих пор ни одно исследование не изучало фундаментальный вопрос о том, могут ли модифицированные рибонуклеотиды влиять на поддержание правильной рамки считывания во время трансляции синтетического транскрипта. Понимание этих процессов крайне важно для расширения наших знаний о синтезе белка из модифицированных мРНК в целом, но также необходимо для надежной разработки и оценки новых терапевтических препаратов на основе мРНК, использующих модифицированные рибонуклеотиды в сильно различающихся последовательностях РНК или терапевтических контекстах.

Чтобы изучить, как модификация рибонуклеотидов влияет на поддержание рамки считывания во время трансляции мРНК, мы сконструировали и синтезировали IVT мРНК (Fluc+1FS), которые сообщают о вне-рамочном синтезе белка (рис. 1а). мРНК Fluc+1FS кодируют аминоконцевой сегмент люциферазы светлячка (NFluc) и комплементарный ему карбоксиконцевой сегмент Fluc (CFluc), расположенный непосредственно ниже по течению. CFluc кодируется в рамке считывания +1. При нормальной трансляции мРНК Fluc+1FS образует каталитически неактивную (усеченную) NFluc. Однако если во время трансляции рибосомы смещаются за пределы рамки считывания, то могут образовываться удлиненные полипептиды, содержащие остатки как внутри-рамочного NFluc, так и вне-рамочного CFluc, что может повысить каталитическую активность.



Fig. 1: Translation of 1-methylΨ-modified mRNA produces +1 frameshifted polypeptides.

a, Structures of IVT mRNA transcripts used to probe protein synthesis fidelity. WT Fluc contains only (in-frame) Fluc coding sequence. For Fluc+1FS, the green segment represents in-frame N-terminal Fluc coding sequence (NFluc), and the orange segment represents +1 frameshifted C-terminal Fluc coding sequence (CFluc). Asterisk represents a premature stop codon. b, Luciferase activity produced by translation of WT Fluc mRNAs, either unmodified control (canonical nucleotides), or containing 1-methylΨ(m1Ψ), 5-methylC (m5C), 5-methoxyU (mo5U) or the combinations indicated. **P < 0.01 (1-methyl? + 5-methylC, P = 0.0051; 5-methoxyU, P = 0.0023; 5-methoxyU + 5-methylC, P = 0.0042; one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett’s test). c, Luciferase activity produced by translation of modified Fluc+1FS mRNAs and unmodified control. 1-methyl?, P = 0.002 (one-way ANOVA with Dunnett’s test). d, Luciferase activity in lysates produced by transfection of HeLa cells with unmodified or 1-methylΨ Fluc+1FS mRNA for 8 h. P = 0.0104 (Welch’s one-tailed t-test). e, Western blot analysis (anti-Flag epitope) of polypeptides produced by translation of mRNAs in c. All data are obtained from n = 3 replicated experiments. e shows a single blot from n = 3 replicated experiments. Asterisks represent bands at higher molecular weight. For gel source data, see Supplementary Fig. 2.

Мы синтезировали не-модифицированные мРНК Fluc+1FS, содержащие канонические рибонуклеотиды, и транслировали их in vitro. Мы подтвердили, что мРНК Fluc+1FS продуцируют каталитически неактивный NFluc (расширенные данные рис. 1). Для сравнения, не-модифицированная мРНК Fluc дикого типа (WT), содержащая полную внутри-рамочную кодирующую последовательность Fluc, продуцировала ожидаемый активный белок (расширенные данные рис. 1). Затем мы синтезировали и транслировали каждую мРНК, содержащую 5-methoxyU, 5-methylC, 1-methylΨ, 5-methoxyU + 5-methylC или 1-метилΨ + 5-метилС. На трансляцию мРНК WT Fluc не оказывали существенного влияния модификации 1-methylΨ или 5-methylC в отдельности, но она снижалась при включении обоих рибонуклеотидов в один транскрипт (рис. 1б). Включение 5-methoxyU отдельно или в сочетании с 5-метилС значительно снижало трансляцию мРНК WT Fluc (рис. 1б). Встраивание 1-methylΨ в мРНК Fluc+1FS значительно увеличивало сдвиг рамки рибосомы +1 примерно до 8 % соответствующего внутри-рамочного белка, чего не наблюдалось для других рибонуклеотидов (рис. 1в). Клетки HeLa, трансфицированные 1-methylΨ Fluc+1FS мРНК, повторили результаты трансляции in vitro (рис. 1d). На основании этих наблюдений мы пришли к выводу, что мРНК IVT, содержащая 1-methylΨ или 5-метилС, обладает такой же эффективностью трансляции, как и не-модифицированная мРНК, но 1-methylΨ значительно увеличивает рибосомный +1 сдвиг рамки во время трансляции мРНК.

Мы наблюдали значительное увеличение смещения рибосомальной рамки +1 во время трансляции 1-methylΨ мРНК и решили, что лучшее понимание продуктов трансляции дополнит данные репортерного анализа и поможет объяснить, как возникают продукты со смещением рамки +1. Чтобы разобраться с этими аспектами, мы исследовали полипептиды, образующиеся во время трансляции мРНК IVT, методом вестерн-блоттинга. Трансляция не-модифицированной мРНК Fluc+1FS приводила к образованию ожидаемого усеченного внутри-рамочного продукта, что было справедливо и для мРНК 5-methylC (рис. 1е). Трансляция 1-methylΨ мРНК дала ожидаемый внутри-кадровый продукт, но также дала две дополнительные полосы с более высокой молекулярной массой (рис. 1е). Мы предположили, что эти продукты представляют собой полипептиды со сдвигом рамки +1. Мы также подтвердили, что 1-methylΨ + 5-метилС-, 5-метоксиU- и 5-метоксиU + 5-метилС мРНК были сравнительно плохими мРНК-шаблонами для синтеза белка (рис. 1е).

1-methylΨ также используется в клинически одобренных мРНК-вакцинах SARS-CoV-23,⁴. Поскольку 1-methylΨ увеличивал сдвиг рамки +1 рибосомы во время трансляции in vitro, мы исследовали, происходит ли это in vivo для BNT162b2, мРНК-вакцины SARS-CoV-2, содержащей 1-methylΨ Мы предположили, что сдвиг рамки +1 рибосомы во время трансляции мРНК рекомбинантного антигена может привести к презентации продуктов со сдвигом рамки +1 Т-клеток и вызвать вне-целевой клеточный иммунный ответ (рис. 2а). Было показано, что презентация антигена в результате ошибочной трансляции эндогенной опухолевой мРНК происходит in vivo (например, ссылка 21). Чтобы рассмотреть эту возможность, мы вакцинировали мышей вакциной BNT162b2 и количественно оценили их Т-клеточный ответ на in-frame SARS-CoV-2 spike белок и продукты со сдвигом рамки +1, которые, как предполагается, возникают при трансляции +1 рамки мРНК, а также на не-родственный контрольный антиген (SARS-CoV-2 M белок) с помощью анализа ELISpot на интерферон-γ (IFNγ). В анализ не включали соединительные пептиды, состоящие из N-концевых остатков внутри рамки и С-концевых остатков, сдвинутых на +1 рамку. Мы обнаружили, что ответы на пептиды со сдвигом рамки +1 значительно увеличивались у вакцинированных мышей по сравнению с необработанными мышами или вакцинированными ChAdOx nCoV-19, который не продуцирует антиген при трансляции N1-метилпсевдоуридилированной мРНК²² (рис. 2b). Вакцинация как BNT162b2, так и ChAdOx1 nCoV-19 вызывала ELISpot-ответы на внутри-кадровый шип SARS-CoV-2 (рис. 2c). Эти данные свидетельствуют о том, что продукты со сдвигом рамки +1, кодируемые мРНК шипа BNT162b2, являются Т-клеточными антигенами для инбредных мышей, к которым после вакцинации может быть выявлен вне-целевой иммунитет.

Fig. 2: +1 frameshifted products elicit off-target cellular immune responses following modified mRNA vaccination.

Затем мы сравнили ответы IFNγ ELISpot на предсказанные продукты белка шипов SARS-CoV-2 со сдвигом рамки +1 у 21 человека, вакцинированного BNT162b2, и сравнили эти ответы с ответами 20 человек, вакцинированных ChAdOx1 nCoV-19, ни один из которых не сообщил о нежелательных эффектах в результате вакцинации. Мы обнаружили значительно более высокий ответ IFNγ на антиген со сдвигом рамки +1 в группе вакцины BNT162b2 по сравнению с ChAdOx1 nCoV-19 (рис. 2d). Не было выявлено связи между ответами Т-клеток на антиген со сдвигом рамки +1 и возрастом, полом или подтипом HLA (Дополнительная таблица 1 и расширенные данные рис. 2 и 3). Вакцинация как ChAdOx1 nCoV-19, так и BNT162b2 приводила к возникновению ELISpot-ответов на полно-кадровый шип SARS-CoV-2, но ответы на продукты со сдвигом рамки +1 наблюдались только у лиц, вакцинированных BNT162b2 (рис. 2e,f). Во время репликации вируса SARS-CoV-2 запрограммированный сдвиг рамки считывания -1 рибосомы происходит естественным образом во время трансляции открытых рамок считывания (ORF) 1a и ORF1b (см. 23). Не представляется возможным, что эти данные являются следствием естественной инфекции SARS-CoV-2 по следующим, неполным, причинам. Во-первых, неизвестно, что во время трансляции субгеномной мРНК шипа SARS-CoV-2 не происходит сдвига кадров (что само по себе было бы важным открытием). Во-вторых, сдвиг рамки -1 (а не сдвиг рамки +1) ограничивается одним запрограммированным сайтом в ORF1a и ORF1b (см. 23). В-третьих, пептиды со сдвигом рамки +1 предсказаны из последовательности мРНК BNT162b2, а не из последовательности гена S дикого вируса (расширенные данные рис. 4). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что вакцинация 1-methylΨ мРНК может вызывать клеточный иммунитет к пептидным антигенам, образующимся в результате сдвига рамки рибосомы +1, как у людей, различающихся по основному комплексу гистосовместимости (MHC), так и у мышей, не различающихся по MHC.

Чтобы получить дальнейшее механистическое представление о сдвиге рамки +1 рибосомы во время трансляции 1-methylΨ мРНК и определить потенциальные сайты или последовательности сдвига рамки, мы транслировали 1-methylΨ Fluc+1FS мРНК, очистили основной предполагаемый полипептид со сдвигом рамки +1 и провели жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией (LC–MS/MS) триптических digests. Из этого единственного полипептида мы идентифицировали шесть внутри-рамочных пептидов и девять пептидов, происходящих из рамки +1 мРНК (рис. 3а и Таблица 1 расширенных данных). Все внутрирамочные пептиды были сопоставимы с N-концевой областью, в то время как пептиды, сдвинутые на +1 рамку, были сопоставимы с теми, что ниже по течению (рис. 3а). Затем мы повторили этот анализ с использованием другой протеазы и выявили пептид-переходник, охватывающий основную рамку и рамку +1 (рис. 3б). Эти данные показали, что удлиненный полипептид действительно представляет собой химерный полипептид, состоящий из N-концевых остатков, находящихся в рамке, и С-концевых остатков, сдвинутых на +1 рамку. Как и ожидалось, при трансляции 1-methylΨ мРНК, кодирующей полноразмерный Fluc, также образовывались более короткие продукты со сдвигом рамки (расширенные данные, рис. 5).

Fig. 3: Mistranslation of 1-methyl? mRNA is due to +1 ribosomal frameshifting and not transcriptional errors.

Кажущиеся ошибки в синтезе белка, включая сдвиг рамки, могут быть следствием мутации ДНК или ошибок транскрипции²⁴. Следовательно, точная трансляция неправильной последовательности мРНК может привести к образованию неправильных белков. Предполагается, что транскрипты in vitro представляют собой точные РНК-копии шаблонной ДНК, точность которых можно оценить по верности используемой РНК-полимеразы. Однако замена канонических субстратных рибонуклеозидтрифосфатов на модифицированные нуклеотиды может увеличить ошибки транскрипции. Чтобы рассмотреть эту возможность, мы провели высокопроизводительное секвенирование РНК не-модифицированной и 1-methylΨ Fluc+1FS мРНК и количественно определили нуклеотидные вставки и делеции в каждой популяции IVT мРНК. Профили делеций нуклеотидов для каждой мРНК были очень похожи (рис. 3c), как и профили вставок нуклеотидов (рис. 3d), что свидетельствует о незначительных сайт-специфических различиях. Общая частота вставок и делеций была низкой и существенно не отличалась между не-модифицированной и 1-methylΨ мРНК (Таблица 2 расширенных данных), что подтверждает недавние наблюдения²⁵. На основании этих данных мы пришли к выводу, что сдвиг рамок в продуктах трансляции 1-methylΨ мРНК не связан с транскрипционными ошибками, а обусловлен добросовестным рибосомным +1 фреймшифтингом - пост-транскрипционным механизмом.

Сдвиг рибосомной рамки считывания - хорошо задокументированное явление, которое происходит во время трансляции многих естественных мРНК²⁴. Поскольку срыв рибосомы связан с несколькими случаями сдвига рамки +1, мы задались вопросом, как присутствие 1-метила в мРНК IVT влияет на удлинение трансляции^26-28. Для этого мы проанализировали синтез белка во время трансляции не-модифицированной или 1-methylΨ WT Fluc мРНК с помощью ко-трансляционного [35^S]метионинового мечения²⁹. Удлинение трансляции 1-methylΨ мРНК происходило медленнее, чем у не-модифицированной мРНК (рис. 4а), что подтверждается предыдущими наблюдениями²⁰. Все реакции проводили в течение 30 минут, и в результате трансляции 1-methylΨ-содержащих мРНК было получено меньше полноразмерного белка, что свидетельствует о более медленной скорости элонгации по сравнению с не-модифицированной мРНК и большей доле преждевременных полипептидных продуктов. Эти данные позволили предположить, что удлиняющиеся рибосомы останавливаются во время трансляции мРНК, содержащих 1-methylΨ .

Fig. 4: +1 ribosomal frameshifting is dependent on mRNA slippery sequences and associated with ribosome stalling during 1-methylΨ mRNA translation.

Оставалось неясным, влияет ли 1-methylΨ на скорость декодирования мРНК или на другой процесс во время элонгации. Мы предположили, что замедление декодирования 1-methylΨ кодонов во время элонгации трансляции может привести к остановке рибосомы, подобно предыдущим наблюдениям для "голодных" кодонов в местах сдвига рамки +1 во время трансляции мРНК естественного происхождения^21,28. Мы исследовали молекулярный механизм остановки рибосомы во время трансляции 1-methylΨ мРНК с помощью аминогликозида паромомицина. Вкратце, во время декодирования мРНК взаимодействие антикодона с когнатным аминоацил-тРНК вызывает локальные конформационные изменения в 18S рРНК (у эукариот), после чего образуется новая пептидная связь, происходит поворот субъединицы рибосомы, и последующие конформационные изменения рибосомы, связывание фактора элонгации 2 и транслокация к следующему кодону завершают цикл элонгации³⁰. Паромомицин связывается со спиралью 44 из 18S рРНК в рибосомах и изменяет ее конформацию в декодирующем центре, это ингибирует трансляцию, но при этом обеспечивает продуктивное связывание близких и некогнитивных аминоацил-тРНК с А-сайтом 80S рибосомы³¹. При этом паромомицин увеличивает неправильное встраивание аминокислот в удлиняющиеся полипептиды³². Мы предположили, что если медленное декодирование во время трансляции 1-methylΨ мРНК связано с изменением кинетики связывания аминоацил-тРНК, то этот процесс может быть уменьшен паромомицином. Это объясняется тем, что рибосомы, связанные с паромомицином, могут присоединять дополнительные близкие или некогнитивные аминоацил-тРНК и эффективно увеличивать пул субстратных аминоацил-тРНК в местах остановки рибосомы. Трансляция 1-methylΨ мРНК происходила медленнее, чем трансляция не-модифицированной мРНК, и поэтому доля преждевременных полипептидных продуктов была выше (рис. 4а). Однако во время трансляции 1-methylΨ мРНК удлинение полипептида улучшалось при добавлении паромомицина, тогда как паромомицин ингибировал трансляцию только не-модифицированной мРНК (рис. 4а). В совокупности эти данные показывают, что замедленная трансляция 1-methylΨ мРНК, вероятно, связана с остановкой рибосомы, которая вызвана изменением связывания аминоацил-тРНК и может быть устранена путем увеличения включения близких или некогнитивных аминокислот в элонгирующие полипептиды.

Несмотря на отсутствие доказательств того, что продукты со сдвигом рамки считывания у людей, полученные в результате вакцинации BNT162b2, ассоциируются с неблагоприятными исходами, для будущего использования технологии мРНК важно, чтобы дизайн последовательности мРНК был изменен для уменьшения случаев сдвига рамки считывания рибосомы, поскольку это может ограничить ее будущее использование для приложений, требующих более высоких доз или более частого дозирования, таких как производство гормонов in vivo. Важно продолжать изучение терапевтической неправильной трансляции мРНК и иммуногенности, поскольку эволюция антител и цитолитических Т-клеточных реакций против вариантов шипов и пептидов со сдвигом рамки рибосомы +1 не подвергалась систематической оценке у людей, а ELISpot-ответы, полученные из объединенных пептидов, могут также недооценивать Т-клеточные ответы. Основной продукт, кодируемый мРНК, вряд ли вызовет адаптивный иммунный ответ, но презентация продуктов со сдвигом на +1 кадр может активировать Т-клетки, нацеленные на клетки хозяина. Мы предположили, что если нам удастся идентифицировать участки или последовательности сдвига рамки считывания +1 рибосомы, то можно будет изменить последовательность мРНК, чтобы уменьшить подобные эффекты. В качестве доказательства принципа мы использовали нашу репортерную систему мРНК IVT. LC–MS/MS-анализ показал, что трансляция 1-methylΨ мРНК приводит к синтезу продуктов со сдвигом кадров +1 в области кодирующей последовательности между обнаруженными внутри-кадровыми остатками и остатками со сдвигом кадров +1 ниже по течению (рис. 3а). Мы провели поиск РНК-последовательности, соответствующей этой области в кодирующей последовательности пептида стыка (рис. 3б), и детерминанты сдвига рамки считывания рибосомы из опубликованных механизмов, из которых мы идентифицировали три потенциальные скользкие последовательности рибосомы (рис. 4в), причем все три последовательности имеют потенциал быть декодированными одной и той же аминоацил-тРНК во внутри-кадровом кодоне или в непосредственном +1 кадровом кодоне. Примечательно, что шесть скользких сайтов, идентичных скользким сайтам B и C Fluc+1FS, также были распределены в кодирующей последовательности spike мРНК BNT162b2. Эти сайты были аннотированы в кодирующей последовательности Fluc+1FS (рис. 4b) и кодирующей последовательности spike мРНК BNT163b2 (расширенные данные, рис. 6). Мы предположили, что эти последовательности могут функционировать как сайты для +1 рибосомного сдвига рамки считывания. Мы синонимично мутировали каждый сайт в 1-methylΨ Fluc+1FS мРНК таким образом, что внутри-кадровая аминокислота оставалась неизменной, но ближайший +1 кадровый кодон мутировал в не-распознаваемую аминокислоту, разрушая, таким образом, скользкую последовательность рибосомы, и транслировали мРНК для оценки вклада каждого сайта в +1 рибосомный сдвиг рамки считывания (рис. 4c). Ниже по течению от скользкого сайта A присутствовал стоп-кодон с рамкой +1, и было маловероятно, что сдвиг рамки в этом месте способствовал увеличению активности люциферазы. Как и ожидалось, люциферазная активность при трансляции мРНК мутанта A206G с сайтом A была такой же, как и в контроле (рис. 4c). Однако и мутант U*187C мРНК со скользким сайтом B, и мутант U*208C мРНК со скользким сайтом C сильно снижали активность +1 рибосомного сдвига рамки (рис. 4c). Примечательно, что эффективность трансляции каждой мРНК была одинаковой, что позволяет предположить, что ни одна из мутаций не повлияла на трансляцию мРНК в целом, а только на активность сдвига кадров +1 рибосомы (рис. 4d). Трансляция U*187C/U*208C двойного мутанта 1-methylΨ Fluc+1FS мРНК не приводила к заметному сдвигу кадров считывания +1 рибосомы (рис. 4e).

Белковый продукт transframe, предсказанный +1 сдвигом кадров в скользком сайте C, содержит изменение 19 аминокислотных остатков (по сравнению с WT Fluc), тогда как +1 сдвиг кадров в скользком сайте B приводит к образованию продукта transframe, который фактически на 100% гомологичен WT Fluc. Кроме того, учитывая, что мутация скользкого сайта B или C (U*187C или U*208C) значительно снижала активность люциферазы, но при этом при трансляции мРНК U*208C образовывалось относительно больше сдвинутого по рамке продукта (рис. 4e), мы предположили, что продукт трансляции, образующийся при сдвиге рамки в скользком сайте C, обладает более низкой специфической люциферазной активностью, и что сдвиг рамки в скользком сайте B обусловил большую часть обнаруженной люциферазной активности в результате сдвига рамки +1 рибосомы. Вместе взятые, эти данные свидетельствуют о том, что N1-метилпсевдоуридилирование в определенных последовательностях мРНК вызывает сдвиг рамки считывания рибосомы +1, однако при соответствующем дизайне последовательности мРНК можно решить эту проблему.

Мы показали, что 1-methylΨ является модифицированным рибонуклеотидом, который существенно увеличивает сдвиг рибосомной рамки считывания +1 во время трансляции мРНК, и что клеточный иммунитет к продуктам со сдвигом рамки +1 может возникнуть после вакцинации мРНК, содержащей 1-methylΨ Насколько нам известно, это первое сообщение о том, что модификация мРНК влияет на сдвиг рибосомальных рамок. Наряду с влиянием на Т-клеточный иммунитет хозяина, вне-целевые эффекты сдвига рибосомальных рамок считывания могут включать увеличение продукции новых антигенов В-клеток. Другие стратегии модификации рибонуклеотидов, такие как включение 5-methoxyU, значительно снижают эффективность трансляции мРНК IVT, что может ограничить клиническую трансляцию. Хотя мы показали, что трансляция N1-метилпсевдоуридилированных мРНК приводит к сдвигу рамки +1 рибосомы in vitro и в культивируемых клетках, можно предположить, что другие события неправильной трансляции (например, негерметичное сканирование) также могут вносить вклад в Т-клеточный ответ на пептидные антигены со сдвигом рамки +1. Мы показали, что мРНК IVT содержат мало нуклеотидных вставок и делеций, и это не изменяется при включении 1-methylΨ Наши данные показывают, что сдвиг рибосомной рамки +1 происходит на двух охарактеризованных скользких последовательностях. Поэтому мы считаем, что минорная полоса около 50 кДа, образующаяся при трансляции мРНК Fluc+1FS, вероятно, является следствием нескольких событий сдвига рамки (рис. 1е). Трансляция мРНК, содержащей 1-methylΨ, приводит к замедлению элонгации трансляции, вызванному изменением связывания аминоацил-тРНК, это показывает, почему сдвиг рамки считывания +1 рибосомы не происходит при трансляции не-модифицированной мРНК - для продуктивного сдвига рамки +1 рибосомы, по-видимому, необходимы как рибосомная остановка, так и рибосомные скользкие последовательности. Наши механистические данные подтверждаются предыдущими наблюдениями за сдвигом рибосомных рамок при трансляции природных мРНК, в которых задействована рибосомная остановка и требуются рибосомные скользкие последовательности для сдвига рамок +1^{21,26-28,33,34}. Эти результаты имеют особое значение для нашего фундаментального понимания того, как модификация рибонуклеотидов влияет на трансляцию мРНК, а также для разработки и оптимизации будущих терапевтических препаратов на основе мРНК, чтобы избежать событий неправильной трансляции, которые могут снизить эффективность или повысить токсичность.