The number one cause of human fetal death are defects in heart development. Because the human embryonic heart is inaccessible and the impacts of mutations, drugs, and environmental factors on the specialized functions of different heart compartments are not captured by in vitro models, determining the underlying causes is difficult. Here, we established a human cardioid platform that recapitulates the development of all major embryonic heart compartments, including right and left ventricles, atria, outflow tract, and atrioventricular canal. By leveraging 2D and 3D differentiation, we efficiently generated progenitor subsets with distinct first, anterior, and posterior second heart field identities. This advance enabled the reproducible generation of cardioids with compartment-specific in vivo-like gene expression profiles, morphologies, and functions. We used this platform to unravel the ontogeny of signal and contraction propagation between interacting heart chambers and dissect how mutations, teratogens, and drugs cause compartment-specific defects in the developing human heart.

Для получения предшественников SHF мы предположили, что aSHF подвергается воздействию WNT и ингибированию Nodal сигналов, это является сходной сигнальной средой с другими передними и спинными эмбриональными областями (нейроэктодерма и мезодерма головы).^14,15 Таким образом, мы получили кардиоиды (органоиды)¹⁶ из линии aSHF путем индукции сначала мезодермы, а затем стадии aSHF-patterning-1 с использованием двойного ингибирования WNT и Nodal/Activin сигналов (Рисунок 1A). Синергетическое ингибирование WNT и Nodal/Activin было необходимо для ранней регуляции маркеров линии aSHF (TBX1 и FOXC2), в то время как любая модуляция сигналов Nodal/Activin препятствовала дифференцировке FHF (рис. S1D и S1F). Как и in vivo, BMP-сигнализация на стадии формирования паттерна-1 препятствовала спецификации aSHF (рис. S1E).¹⁰ Через 3,5 дня 3D-дифференцировки мы наблюдали гетерогенность предшественников aSHF и FHF/pSHF (TBX5+) и проследили ее происхождение до более ранней стадии индукции (день 1. 5), при этом маркер мезодермы EOMES экспрессировался только на поверхности, а маркер плюрипотентности и нейроэктодермы SOX2 - в кардиоидном ядре (рис. 1B, 1C, S1A и S1B). Мы предположили, что клетки в 2D получают более равномерно распределенные сигналы индукции, что приводит к однородному выходу из плюрипотентности и к дифференцировке, тогда как в 3D мезодерма индуцируется неоднородно. Когда мы индуцировали мезодерму в 2D и инициировали дифференцировку в 3D только на стадии формирования паттерна-1 (день 1,5), клетки выходили из плюрипотентности эффективно (рис. S1B), экспрессировали высокие уровни TBX1 и FOXC2 (67%, уровень белка), и только несколько клеток экспрессировали TBX5 (рис. 1B, 1C, S1A, S1D, S1G и S1H). В отличие от этого, экспрессия маркеров головной мезодермы отсутствовала (рис. S1C),¹⁷ это указывает на то, что поэтапная дифференцировка 2D-3D приводит к образованию более однородных популяций предшественников.



Figure 1. aSHF and pSHF progenitors express specific markers and form functional cardioids

(A) Differentiation protocol into three main cardiac lineages: first heart field (FHF), anterior second heart field (aSHF), and posterior second heart field (pSHF). WNT, CHIR99021; LY, LY 294002; B, BMP4; F, FGF2; I, insulin; WNTi, C59 or XAV-939; TFGBi, SB 431542; RA, retinoic acid (numbers represent µM).
(B) Marker RT-qPCR in FHF/aSHF progenitors in 2D, 3D, and 2D?3D protocols.
(C) RNA-scope marker staining of aSHF-cardioid cryosections in 2D?3D vs. 3D differentiation. For subsequent figures, the 2D-3D protocol is used.
(D) RNA-seq volcano plot of differentially expressed genes in indicated conditions.
(E) RNA-seq expression heatmap for lineage-specific cardiac mesoderm TFs.
(F) RNA-scope marker staining as specified.
(G) (G and G') Marker immunostaining in cardioids with (G") quantification (N = 3, n = 3–9). (H) RNA-seq Venn diagram of shared upregulated genes in different cardiac progenitors.
(I) Biological and technical replicates of representative whole-mount cardioid images derived from TNNI1-GFP-hPSCs. Scale bars, 500 µm.
(J) MYL7-GFP-hPSC-derived cardioid subtype cryosections.
(K) Representative CM flow cytometry plot derived from TNNI1-GFP/WT-hPSCs. Indicated day of analysis (D). Scale bars, 200 µm, except where specified. hPSC lines: H9 and WTC11. Bar graphs show mean ± SD. Statistics: one-way ANOVA. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. ns: not significant.
N, biological replicate number; n: technical replicate number.

В отличие от aSHF, pSHF подвергается воздействию ретиноевой кислоты (RA) in vivo,¹⁸ которая активирует регуляторы pSHF (HOXB1, HOXA1 и TBX5) и подавляет экспрессию aSHF. Как и в естественных условиях,²⁰ различные уровни сигналов Nodal/Activin и WNT во время индукции мезодермы стимулировали aSHF и pSHF по сравнению с линией FHF (рис. S1G). Когда мы проанализировали три подтипа предшественников с помощью секвенирования РНК (RNA-seq), мы обнаружили, что маркеры FHF, aSHF и pSHF были в числе наиболее дифференциально экспрессируемых генов (рис. 1D и 1E). Специфичность и однородность популяций предшественников еще больше подчеркивалась взаимоисключающей экспрессией маркеров, специфичных для конкретной линии (рис. 1D-1H и S1H). Тем не менее, все популяции были положительными в отношении маркера сердечных предшественников NKX2-5 и в основном отрицательными для SOX2 (рис. S1I). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что в кардиоидной системе мы можем эффективно и однородно генерировать все три основных сердечных предшественника.

FHF, aSHF и pSHF дают начало нескольким различным типам сердечных клеток в эмбрионе, включая CM и эндотелиальные клетки ( ECs). Ранее мы показали, что предшественники FHF генерируют сокращающиеся кардиоиды LV (кардиоиды LV), содержащие CM и ECs.¹⁶ Следуя этому методу, мы продолжали ингибировать передачу сигналов WNT, обрабатывая предшественников aSHF/pSHF BMP, FGF, инсулином и RA (patterning-2) (рис. 1A), что привело к воспроизводимому образованию сокращающихся кардиоидов, содержащих полости, с высокой пропускной способностью (рис. 1I и 1J). В отличие от кардиоидов, полученных из FHF, кардиоиды, полученные из aSHF/pSHF, требуют более высокой дозировки RA на этом этапе. Эффективная дифференцировка aSHF также потребовала более низкой плотности посева (рис. S1K и S1L) во время индукции мезодермы, поскольку высокая плотность приводила к неэффективной дифференцировке CM и экспрессии нейронных маркеров в ядре органоида (рис. S1K и S1K'). Точный подсчет клеток перед агрегацией patterning-1 был необходим для надежного формирования кардиоида (рис. S1L). В результате более 85% кардиоидных клеток экспрессировали маркер CM TNNI1 (рис. 1K и S1M) и низкие уровни маркеров SOX2, эндодермы (FOXA2) и фибробластов (COL1A1) (рис. S1J). Наконец, предшественники aSHF и pSHF эффективно дифференцировались в PECAM1+ ECs в 2D при воздействии VEGF и forskolin после aSHF/pSHF-patterning-1 (рис. S1N и S1O). В итоге, применяя in vivo подобную сигнализацию и оптимизацию числа клеток, предшественники aSHF/pSHF могут эффективно дифференцироваться в CM и эндотелиальные линии в рамках кардиоидной системы.

В процессе развития предшественники FHF дифференцируются в CM, формирующие сердечную трубку, в то время как предшественники aSHF сначала пролиферируют, а затем дифференцируются вместе с предшественниками pSHF на более поздней стадии развития.¹⁰ Соответственно, подробный анализ временного процесса выявил задержку спецификации CM и морфогенеза в кардиоидах SHF (рис. 2A-2C и S2A), в то время как скорость пролиферации и экспрессия Ki67 были повышены в предшественниках aSHF до 4,5 дня (рис. 2C, 2D и S2B). Кроме того, предшественники aSHF выглядели более эпителиальными, о чем свидетельствовала более высокая экспрессия CDH1 и более низкая экспрессия CDH2, что напоминает ситуацию in vivo.^19,21 Кардиоиды aSHF/pSHF также были меньше кардиоидов FHF и демонстрировали более позднюю экспрессию TNNI1 (рис. 2A, 2B и S2A). Кардиоиды FHF были крупнее, несмотря на меньшее количество клеток по сравнению с кардиоидами aSHF, а отдельные клетки были одинакового размера, что указывает на то, что наблюдаемые различия обусловлены межклеточным пространством (рис. 2D и S2A). Глобальная экспрессия генов подтвердила, что экспрессия структурных генов CM была задержана в кардиоидах SHF (рис. 2E и S2C), и мы наблюдали задержку в формировании полостей (рис. 2C). Таким образом, ступенчатая дифференцировка кардиоидов SHF и FHF in vitro соответствует срокам развития и морфогенезу in vivo.

Далее мы задались вопросом, следует ли приобретение камерной идентичности также траектории развития в кардиоидах, полученных из aSHF/pSHF. В естественных условиях FHF дает начало LV и незначительной части CM предсердий, тогда как aSHF и pSHF дают начало RV и предсердиям, соответственно.¹¹ Чтобы ответить на этот вопрос, мы сравнили потенциал спецификации предшественников aSHF/pSHF/FHF, регулируя концентрацию RA. Мы наблюдали, что предшественники aSHF дали начало ранним RV-подобным идентичностям (IRX1+, IRX2+, IRX3+ и NPPA+), в то время как прогениторы pSHF дифференцировались в ранние CM предсердий (HEY1+, NR2F1+ и NR2F2+) (рис. 2E-2G'). При сравнении глобальной экспрессии генов на 9,5 день мы обнаружили, что в кардиоидных клетках aSHF наиболее высоко регуляторные гены включают ISL1, IRX1, HEY2 и RFTN1 (рис. 2F и S2D), которые были связаны с качественными особенностями и физиологией желудочков. Напротив, в кардиоидах pSHF наблюдалась повышенная регуляция TBX5, NR2F2 и NR2F1, что соответствует ранней предсердной идентичности (рис. 2F и S2D). Эти данные были подтверждены на белковом уровне для IRX1, NR2F2 и HEY2 (рис. 2G, 2G' и S2E). Спецификация подтипов CM была также достигнута с использованием эмбриональных стволовых клеток человека H9 (hESCs), различных подлиний, индуцированных человеком PSC (hiPSC) WTC и другой независимой линии hiPSC (рис. 2H и S2F-S2H). Таким образом, предшественники aSHF формируют RV-подобные кардиоиды (RV-кардиоиды), а предшественники pSHF - предсердные кардиоиды (A-кардиоиды), показывая, что раннее праймирование предшественников имеет решающее значение для получения различных камер в развивающемся сердце.

Для достижения дальнейшей спецификации и созревания камер мы протестировали несколько недавно опубликованных сигнальных и метаболических методов лечения CM желудочков (рис. S2I).^22-24 При адаптированном сочетании этих условий в кардиоидах LV/RV повышалась регуляция ключевого структурного белка желудочков MYL2, маркеров камер NPPA и NPPB и наблюдался типичный сдвиг в соотношении экспрессии MYH7 и MYH6 (рис. 2I и S2J-S2M), что привело к появлению хорошо выраженных саркомерных структур и повышению амплитуды сокращений (рис. S2L и S2N). Однако, поскольку такой подход препятствовал дифференцировке предсердий, мы попытались определить комбинацию факторов, способствующих дальнейшему созреванию камер предсердий (рис. S2I). Мы обнаружили, что активация путей FGF и RA и ингибирование сигналов NOTCH и BMP в сочетании с метаболическим созреванием способствовали развитию программы предсердных камер (NPPA+, NPPB+, NR2F2+, IRX4- и MYL2-) при сильном снижении транскриптов TBX2 и TBX3, специфичных для сердечной трубки и AVC (Рисунок S2O). В целом, мы продемонстрировали, что можем определять и дифференцировать кардиоиды в три камеры, которые встречаются в эмбриональном сердце.

Помимо RV, предшественники aSHF дифференцируются в OFT, дающий начало аортальному и легочному клапану и структурам сосудов.¹⁰ Аномалии производных OFT являются наиболее частыми врожденными пороками сердца.³ Мы наблюдали, что более высокие дозы RA способствовали спецификации aSHF в сторону RV (рис. 3A и S3A), в то время как отсутствие экзогенного RA способствовало экспрессии маркеров OFT (WNT5A, ISL1, HAND2 и RSPO3), но не маркеров камер (рис. 3B-3D, S3B и S3C).¹⁹ Кардиоиды OFT были более мезенхимными (MC)-подобными (рис. S3E), задерживались в дифференциации (рис. 3B) и имели меньшие размеры по сравнению с кардиоидами RV (рис. 3I). Дальнейшая оптимизация показала, что C59 (ингибирует канонический и неканонический WNT) приводит к более высокой экспрессии камерных маркеров в кардиоиде RV, тогда как XAV-939 (ингибирует только канонический WNT) способствует повышению регуляции генов OFT (Рисунок S3D). Кардиоиды OFT содержали в основном TNNI1+ CM, и лишь немногие из них экспрессировали маркеры фибробластов или эндотелия (рис. S3G). В качестве функционального подтверждения кардиоиды OFT продемонстрировали более эффективную склонность к дифференцировке гладкомышечных клеток (SMC) (ACTA2+ и TNNT2-) по сравнению с FHF, которая обычно не дает начало SMCs in vivo (рис. S3F и S3F').²⁵ Они также могут быть стимулированы VEGF для формирования внутреннего слоя ECs и демонстрируют MC SOX9+ клетки при обработке факторами, стимулирующими EMT, трансформирующим фактором роста β (TGF-β) и FGF2 (рис. S3E). Таким образом, предшественники aSHF могут формировать кардиоиды OFT с потенциалом дифференцировки SMC и эндотелиального EMT, напоминающим раннее развитие клапанов и крупных сосудов.

В естественных условиях CM, полученные из pSHF, составляют большую часть предсердий и способствуют формированию AVC - важнейшей области, где развиваются клапаны и элементы кардиостимулятора. Исследования на мышах показали, что предшественники pSHF располагаются в разных областях примитивной полоски и мигрируют в разные временные точки (в AVC раньше, в предсердие позже).^20,27,28 Таким образом, мы предположили, что условия индукции мезодермы для двух популяций pSHF будут отличаться. Действительно, мы обнаружили, что промежуточный уровень Activin и низкий уровень активации WNT во время индукции мезодермы привели к более высокой экспрессии маркеров примитивной полоски на 1,5 день (рис. 3E и S3H), что впоследствии привело к повышению регуляции генов, специфичных для AVC (TBX2 и TBX3), и снижению регуляции генов предсердий на 9,5 день (рис. S3I). Сигнатура pSHF на день 3.5 сохранилась в обеих популяциях pSHF (рис. S3I). Еще одним отличием между развитием AVC и предсердий in vivo является высокая подверженность области AVC воздействию лигандов BMP. Как и предполагалось, добавление BMP4 на стадии формирования паттерна повышало уровень ранних маркеров AVC (Рисунок S3I), а оптимизированная индукция и формирования паттерна (Рисунок 3E) приводили к спецификации pSHF в сторону AVC (Рисунки 3F-3H). Кардиоиды AVC были меньше, чем предсердия (рис. 3I), и только несколько клеток были PECAM1+ или COL1A1+ (рис. S3G). В целом, подразделение предшественников pSHF на предсердные или AVC кардиоиды началось еще на стадии индукции мезодермы, что отражает пластичность pSHF в процессе развития.

Кардиогенез эмбрионов человека в период с 19 по 28 dpf недоступен и плохо охарактеризован, а существующие наборы данных по одноклеточным РНК-секвенированным структурам (scRNA-seq) обычно соответствуют более поздним стадиям развития. Таким образом, мы стремились сравнить все пять кардиоидных подтипов с помощью анализа scRNA-seq и изучить различия в спецификации ранних отделов человеческого сердца, помимо хорошо известных животных маркеров. Мы провели scRNA-seq в LV (день 7,5), RV, AVC, OFT и A кардиоидов (день 9,5), сопоставленных по стадии дифференцировки структурных CM (см. рис. 2A-2C). Фильтрация контроля качества потребовала удаления только 5-10 % клеток, а кластерный анализ с помощью равномерной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP) позволил выделить различные типы клеток и компартмент-специфичные CM (рис. 3J). Кластеризация выявила небольшие популяции клеток, не относящихся к CM (ECs и эндодерма), эффективную дифференцировку CM и воспроизводимое расположение кластеров в биологических репликах (рис. S4A и S4B). Как и в процессе развития, многие ранние CM желудочков имели пролиферативную транскриптомную сигнатуру и высокий балл S. (рис. 3J-3L). Расходились кластеры CM, специфичные для каждого компартмента, включая RV и LV (рис. S3J-3L и S4C), и модули экспрессированных генов, рассчитанные по литературным данным (рис. 3L, 3M и S3J-S3L). Многие из дифференциально экспрессируемых генов являются хорошо известными маркерами. Тем не менее, другие не были выделены ранее, такие как PDGFRA (предсердие), CD24 (RV), TMEM88 (OFT) и TRH (AVC) (рис. 3L и S3J), открывая ценное окно в скрытый этап развития человека. Затем мы сравнили эти данные, соответствующие примерно 25-28 dpf кардиогенеза человека, с двумя наборами данных scRNA-seq, полученными из препарированных желудочков, предсердий²⁶ и OFT (30-50 dpf)²⁹ эмбриона человека, используя те же параметры. Случайное уменьшение выборки для облегчения интеграции с количеством клеток in vivo выявило значительное совпадение в кластеризации CM желудочков и предсердий (рис. 3N и S3N). Поскольку образцы in vivo представляли более позднюю стадию развития, ожидалось наличие большей популяции фибробластов и более зрелой, но сходной сигнатуры OFT. В целом, анализ scRNA-seq кардиоидного подтипа подтвердил идентичность CM по компартментам, обеспечив бесценный ресурс для выявления ранних механизмов спецификации на неясной стадии развития человека.

Сердце должно функционировать в процессе развития, поэтому понимание ранней сердечной деятельности во время формирования эмбрионального сердечного компартмента крайне необходимо. Мы предположили, что кардиоидная платформа позволит изучить функциональные различия в развитии между отделами в отсутствие данных in vivo у человека. Сократительное поведение кардиоидных подтипов на 6,5 день показало спонтанное сокращение (автоматизм) в 90-100 % LV, предсердий и AVC, а также большую степень сокращения. Напротив, только 18% кардиоидов RV сокращались спонтанно, а 8% кардиоидов OFT показали меньшую степень сокращения (рис. 4A, 4C и S4B; видео S1). На 9,5 день автоматизм кардиоидов A/AVC сохранялся, в то время как скорость сокращения уменьшилась в кардиоидах LV, RV и OFT (рис. 4A-4C; видео S1). Как и в естественных условиях³⁰ , потеря автоматизма коррелировала со снижением экспрессии калиево-натриевого канала HCN4, обнаруженного в кардиостимуляторах (рис. 4D). Эти наблюдения были воспроизводимы как в технических, так и в биологических репликах и клеточных линиях (рис. 4A-4C и S4A). Для дальнейшего изучения распространения сигнала в кардиоидах мы создали репортерные линии GCaMP6f для отслеживания Ca²⁺-переходов (рис. S4C) и обнаружили, что каждый подтип кардиоидов имеет свой собственный характер Ca²⁺-волн; кардиоиды A, AVC и LV сокращаются очень регулярно (100% сокращений), тогда как кардиоиды RV обычно не сокращаются, но демонстрируют Ca²⁺-волны, которые постоянно проявляются в одном длинном всплеске ("re-entry", 80%) (рис. S4C; видео S2).

Когда мы исследовали, как Ca²⁺ волна проходит по всему кардиоиду, кардиоиды LV показали более длительный переходный процесс, чем предсердия и AVC,¹⁹ как сообщалось in vivo.³¹ Скорость распространения сигнала по кардиоидам различалась между подтипами и стадиями дифференцировки, где переходные процессы Ca²⁺ в кардиоидах LV еще больше увеличивались с 6,5 дня и распространялись быстрее, чем в кардиоидах AVC на 9,5 день (рис. 4F и 4G). Это согласуется с повышением регуляции GJA1 (CX43), особенно в кардиоидах LV, которые обладают высокой проводимостью, и повышением регуляции GJC1 (CX45) в кардиоидах AVC, которые обладают низкой проводимостью (рис. 4H и 4I).³² В пределах одного кардиоида происхождение распространения сигнала варьировалось между ударами (видео S2). Мы также наблюдали различия между подтипами кардиоидов, что отражалось в различиях экспрессии Ca²⁺ каналов T- и L-типа (рис. 4E). В целом, кардиоиды, специфичные для разных компартментов, имеют разные профили сокращения и распространения сигнала на этих ранних эмбриональных стадиях, которые недоступны для исследования у человека.

На ранних стадиях развития сердца экспрессия ионных каналов относительно однородна, но на более поздних стадиях появляются профили экспрессии генов в конкретных камерах и видовые формы потенциала действия (ПД), часто измеряемые потенциалом возбуждения (ПВ) или длительностью ПД (ДПВ).³³ Подтипы кардиоидов также развивают различные экспрессии ионных каналов к 9,5 дню (рис. 4H). Поскольку очень важно охарактеризовать, как различаются FP и AP ранних подтипов CM человека в 3D кардиоидах, 2D монослоях, полученных из кардиоидов, и в отдельных 2D CM, мы использовали множественные электродные массивы (MEA), визуализацию с помощью чувствительного к напряжению красителя (FluoVolt) и ручной патч-клемм. Для измерения FP с высоким пространственным разрешением целые кардиоиды помещали на электродную сетку размером 64 x 64. Мы наблюдали разнообразие FP в разных подтипах кардиоидов (рис. 4J и S4H-S4L), причем в одном кардиоиде LV наблюдалось более однородное распространение FP при распространении сигнала, чем в кардиоидах A/AVC (рис. S4I-S4L). В 2D-монослоях с использованием FluoVolt мы обнаружили, что CM LV/RV имели более длительную APD, чем CM предсердий (рис. S4M-S4P). Анализ одиночных CM с помощью Patch-clamp показал, что APD в CM предсердий/AVC короче, чем в RV CMs, что подтверждает тенденции в монослоях и аналогично первичным CMs человека (рис. 4K, 4N, 4O и S4Q-S4U). Диастолический потенциал составлял около -70 mV (рис. 4L), скорость нарастания (рис. S4S) и амплитуда (рис. 4M) APs напоминали самые современные модели in vitro³⁴ , и, что важно, конкретные CMs были электрофизиологически однородными. В целом, электрохимическая сигнализация кардиоидных подтипов разнообразна и похожа на эмбриональную, что позволяет проводить функциональные исследования раннего кардиогенеза человека.

Эмбриональные сердечные предшественники становятся определенными в соседних областях и самосортируются для формирования отдельных компартментов,¹¹ но изучение молекулярной основы механизмов сортировки у эмбрионов является сложной задачей. Чтобы проверить, обладают ли предшественники aSHF/pSHF/FHF тем же потенциалом самосортировки, что и их аналоги in vivo, мы диссоциировали кардиоидные подтипы, полученные в день 3.5 из H2B-GFP- или LMNB1-RFP-hPSCs, смешали их (рис. 5A) и наблюдали самосортировку в течение 24 ч, сохраняя идентичность CM до дня 7.5 (рис. 5B-5D, S5A и S5B). Напротив, предшественники того же подтипа не сортировались при смешивании (рис. 5B', 5C и S5A'). Сортировка соответствовала специфическим сигнатурам экспрессии кадхеринов и TF в различных предшественниках, что напоминает ситуацию in vivo (рис. 5D, 5E, 5E' и S5C).²¹ Отделения сохраняли соответствующую камерную судьбу (рис. S5D), подтверждая, что первые две стадии дифференцировки определяют идентичность линий и что совместная дифференцировка возможна с 3,5 дня и далее.

В естественных условиях сердечные камеры развиваются беспрепятственно, однако нам не хватает многокамерной модели для изучения этого важнейшего этапа и сложного процесса морфогенеза сердца. Поскольку уже на 3,5-й день предшественники становятся детерминированными и отсортированными, мы предположили, что совместно развивающиеся кардиоиды также будут оставаться отдельными на этом этапе, но будут проходить морфогенез вместе. Когда мы поместили различные подтипы кардиоидов вместе на 3,5 день (рис. 5F), они совместно развивались, образуя структурное соединение через 24 ч (рис. S5E и S5F). Тем не менее, они сохраняли свою идентичность и компартменты (рис. 5G и 5I). Напротив, когда мы поместили кардиоидные подтипы вместе на 5,5 день, они не смогли соединиться к 9,5 дню (рис. S5E). Кардиоиды развивались совместно только в том случае, если их объединяли на 3,5 день, электрохимически соединялись и координированно сокращались к 6,5 дню (рис. 5H и S5G; видео S3), демонстрируя функциональное взаимодействие. Когда мы объединили предшественники непосредственно перед формированием полости (рис. 5M) (день 1.5 FHF/LV; день 3.5 aSHF/RV и pSHF/A), мы обнаружили, что они также имеют общий просвет, сохраняя идентичность CMs (рис. 5M-5O, S5Q и S5R). В дальнейшем мы будем называть эти структуры многокамерными кардиоидами. Многокамерные кардиоиды развивались во всех комбинациях, что позволило нам изучить взаимодействие двухкамерных или трехкамерных кардиоидов (слияние предсердий, LV и RV; рис. 5G-5I и S5G; видео S3) в том же порядке, что и в развивающемся эмбриональном сердце, или в альтернативных экспериментальных схемах (рис. S5J и S5K; видео S3).

Направленность распространения электрохимического сигнала в раннем кардиогенезе устанавливается постепенно, изначально без кардиостимуляторов, клапанов и перегородок. Однако этот процесс не был отслежен у человеческих эмбрионов.³⁵ У мышей и цыплят сердечная трубка и ранний отдел LV, полученные из FHF, начинают сокращаться первыми, но теряют автоматизм по мере созревания.^36,37 Напротив, развивающиеся предсердия и AVC начинают сокращаться позже и сохраняют автоматизм до формирования кардиостимуляторов, обеспечивая однонаправленное движение и поток сигналов от предсердий через LV к RV и OFT.³² Чтобы выяснить, воспроизводит ли многокамерная кардиоидная система этот процесс, мы измерили распространение сигналов Са²⁺ и FP в целом органоиде и его компартментах. Мы обнаружили, что каждый удар обычно исходил из одного отсека и затем распространялся по всему многокамерному кардиоиду (рис. 5H и S5K; видео S3), создавая однонаправленное распространение сигнала и ФП в кардиоидах A-LV-RV. На 6,5 день большинство сигналов Ca2+ исходят из области LV (рис. 5K) и распространяются через область RV, которая не бьется независимо (рис. 4A, S5G и S5H). Мы подтвердили эти наблюдения, показав, что многокамерные кардиоиды, которые на 6,5-й день развития были прикреплены к области LV, сохраняли такую же частоту сокращений, как и кардиоиды LV (рис. 5J). С 6,5 по 9,5 день частота сокращений кардиоидов А увеличивалась, в то время как частота сокращений кардиоидов LV уменьшалась, что соответствовало постепенному доминированию предсердной области в ритме двух- и трехкамерных кардиоидов (рис. 5J). По мере развития многокамерных кардиоидов до дня 9.5 сигнал Ca²⁺ и FP исходили преимущественно из предсердной области во всех комбинациях, а скорость распространения сигнала стала диктоваться предсердием с однородным профилем FP во всех субкомпартментах (рис. 5H, 5J, 5K и S5K-S5P; видео S3). Интересно, что взаимодействие компартментов снижало скорость распространения сигнала как в области LV, так и во всей многокамерной кардиоиде (рис. 5L и S5I). Таким образом, наша платформа комплексного анализа позволяет расшифровать онтогенез распространения электрохимических сигналов в многокамерных кардиоидах и в их субкомпартментах, а также то, как их взаимодействие влияет на совместное развитие отдельных камер.

Мутации в генах, кодирующих кардиоидные TFs, вызывают врожденные дефекты, специфичные для данного компартмента, причем автономные и не автономные эффекты трудно разделить. Кроме того, все большее внимание уделяется видоспецифической экспрессии и функциональным вариациям TFs.³⁸ Чтобы генетически подтвердить специфичность платформы кардиоидного компартмента человека, мы создали нокаутные (KO)-hPSCs для известных TFs ISL1 и TBX5 и менее изученного FOXF1 (рис. S6A, S6G и S6J).

Известно, что мутации в ISL1 вызывают тяжелые пороки сердца в OFT и RV, частичные дефекты предсердий и летальность у мышей на эмбриональный день (E)10.5.³⁹ При анализе временного хода развития кардиоидов ISL1-KO с 2,5 по 9,5 день мы отметили серьезное нарушение морфогенеза и размера полостей на 5,5 день в кардиоидах OFT/A, тогда как влияние на кардиоиды RV было довольно незначительным (Рисунок S6D). На 9,5 день у нокаутов и дикого типа (WT) наблюдалась значительная разница в размерах во всех подтипах кардиоидов (рис. 6A и S6E). Мы обнаружили, что экспрессия генов была нарушена уже на 3,5 день, о чем свидетельствовали более низкие уровни MEF2C и MYOCD, указывающие на аберрантную прогрессию дифференцировки (рис. S6B).⁴⁰ Кардиоиды OFT продемонстрировали наиболее резкие изменения экспрессии генов, при этом HAND2 и BMP4 были снижены, а TBX5 - повышены (Рисунок S6B).³⁹ В кардиоидах A маркер pSHF HOXB1 был снижен (Рисунок S6B), а NR2F2, RSPO3, WNT5A и MYL7 были неправильно отрегулированы во всех подтипах на 9,5 день (Рисунок 6C). Эффективность дифференцировки CMs была сильно нарушена в кардиоидах KO-RV и заметно ниже в кардиоидах A/OFT, в то время как в LV была затронута в меньшей степени (Рисунок 6B). Хотя кардиоиды A сохраняли свою идентичность, хотя и с задержкой дифференцировки и начала сокращения (рис. 6B-6D и S6C), кардиоиды OFT демонстрировали глобальный сдвиг экспрессии генов в сторону предсердной идентичности (NR2F2+, HEY1+ и WNT5A?) (рис. 6D, 6F и S6F).^41,42 В соответствии с анализом экспрессии генов большинство ISL1-KO OFT кардиоидов начали биться с той же скоростью, что и кардиоиды A на 14 день (рис. 6E). Таким образом, кардиоидная платформа имитирует аспекты специфических для компартмента ISL1-KO дефектов in vivo, позволяя исследовать специфические эффекты на человеке с высоким разрешением.

TBX5, еще один известный кардиологический TF, является критическим регулятором в FHF и pSHF предшественников, ответственных за управление программой экспрессии камерных генов.^43,44 Мутации в TBX5 приводят к дефектам межпредсердной и желудочковой перегородки и к нарушениям проводимости и ассоциируются с пациентами с синдромом Холта-Орама.⁴³ Когда мы дифференцировали TBX5-KO кардиоиды, глобальный анализ экспрессии генов на 3,5 день показал, что маркеры aSHF были повышены в TBX5-KO A/AVC кардиоидах, в то время как pSHF-специфический ген HOXB1 был понижен, что соответствует результатам in vivo (рис. 6G и S6H).⁴⁴ TBX5-KO-LV кардиоиды повысили уровень HAND2 и FGF10 и понизили NKX2-5 и GATA4 (рис. S6H). В противоположность этому, кардиоиды KO-RV не показали никаких серьезных дефектов, за исключением повышения регуляции FOXC2 на 3,5 день (рис. S6H). На 9,5 день мы наблюдали серьезные морфогенетические фенотипы в кардиоидах LV/AVC (рис. 6H, 6H' и S6H), где CM AVC не смогли дифференцироваться (рис. 6I). Кардиоиды KO-LV/RV/A в основном характеризовались неэффективной дифференцировкой CMs, с понижением уровня TNNT2 и камерно-специфического маркера NPPA (рис. 6I-6K). Все подтипы TBX5-KO кардиоидов показали значительный дефект в экспрессии маркеров камер желудочков и повышение экспрессии не-камерных маркеров TBX2 и WNT5A в KO-RV/LV кардиоидах (Рисунок 6K), аналогично in vivo.⁴⁵ TBX5-KO кардиоиды также потеряли способность к спонтанному сокращению во всех подтипах и временных точках (Рисунок S6I). В целом, TBX5-KO демонстрировали специфические фенотипы на разных стадиях; в то время как кардиоиды LV/A/AVC были поражены уже в качестве предшественников, кардиоиды RV характеризовались мягким фенотипом на стадии спецификации CMs.

Наконец, FOXF1 является специфическим регулятором линии pSHF; мутации приводят к дефектам перегородки предсердий, а нокаутированные мыши погибают рано на ст. E8.0 из-за дефектов вне-эмбриональной мезодермы, что исключает дальнейший анализ фенотипов сердца.^46,47 Когда мы анализировали подтипы кардиоидов FOXF1-KO, мы наблюдали на 3,5 день более раннее начало морфогенеза полости в кардиоидах A (рис. S6J, желтая стрелка). Напротив, кардиоиды KO-AVC не смогли сформировать полноценные полости (рис. 6L и S6L). Основные маркеры pSHF (HOXB1 и OSR1) и AVC (TBX2 и TBX3) были снижены в кардиоидах FOXF1-KO (рис. 6M и 6N), что согласуется с нарушением спецификации pSHF. В кардиоидах KO-LV/RV на 3,5-й день было неправильно отрегулировано лишь несколько генов, включая повышение уровня PITX2 и TBX1, соответственно (рис. 6M). На 9,5 день кардиоиды KO-LV/AVC были меньше (рис. 6O и S6K). Интересно, что кардиоиды KO-A приобрели более выраженную желудочковую идентичность и развили более обширные полости, в то время как кардиоиды KO-AVC не смогли эффективно дифференцироваться (рис. S6L-S6N). Как и ожидалось, мы не наблюдали тяжелого фенотипа у кардиоидов KO-RV/OFT, за исключением снижения уровня NPPA во всех подтипах (рис. 6O, S6L и S6M). Менее выраженный фенотип проявился у кардиоидов KO-LV, где были снижены гены, участвующие в сокращении сердца (ENO1) (рис. S6M), что привело к снижению частоты сокращений (рис. 6P). Кардиоиды KO-A также демонстрировали более низкую частоту сокращений, в то время как кардиоиды KO-AVC не сокращались на 6,5 день (Рисунок 6P). Эти результаты свидетельствуют о том, что FOXF1 играет специфическую роль в компартменте, в частности в линии pSHF, проявляя дифференцированное действие в кардиоидах A и AVC. Таким образом, кардиоидная платформа может быть использована для изучения специфических для стадии и компартмента человека генетических сердечных дефектов спецификации, морфогенеза и функции без компенсаторных механизмов, присутствующих в эмбрионе.

Помимо генетического происхождения, врожденные пороки сердца могут быть вызваны тератогенами (например, лекарствами, токсинами, метаболитами).⁴⁸ В настоящее время нам все еще не хватает человеческих систем для высоко производительного и легко поддающегося количественной оценке исследования того, вызывают ли тератогены специфические для каждого отдела пороки сердца.⁴⁹ Сначала мы подтвердили, что не-тератогенный фактор, аспирин, не вызвал никаких морфологических или значительных различий в экспрессии генов (рис. S7A и S7B).^49,50 Затем мы протестировали талидомид, хорошо известный тератоген у людей, но не у грызунов, который вмешивается в функцию TBX5, вызывая серьезные пороки сердца и конечностей.^51,52 Мы использовали кардиоидную платформу для изучения эффектов талидомида в диапазоне концентраций, обнаруженных в плазме крови человека⁵³ , и выявили ранее невиданные поразительные эффекты на AVC, промежуточные фенотипы в кардиоидах LV/RV и более тонкие эффекты на кардиоидах A/OFT (рис. 7A и S7G). Профили экспрессии генов и иммуноокрашивание обработанных образцов выявили снижение регуляции мишени TBX5 - NPPA для всех линий, кроме RV и OFT, а также дозоспецифическую дисрегуляцию маркеров идентичности компартментов NR2F2, IRX1 и IRX4 (рис. 7B и 7C).

Далее мы рассмотрели производные ретиноидов, используемые для лечения лейкемии, псориаза и акне, как еще один класс соединений, способных вызывать врожденные дефекты, в частности пороки развития AVC и OFT. Поскольку AP играет важнейшую роль в развитии сердца, мы ожидали, что кардиоидная платформа позволит нам выявить механизмы, зависящие от стадии развития. Когда мы тестировали ацитретин и изотретиноин (данные не показаны), мы обнаружили, что поразительно низкие дозы вызывают серьезные эффекты, специфичные для каждого отдела и стадии развития. Кардиоиды OFT/A/AVC имели дефекты спецификации, формирования паттерна и морфогенеза при лечении ацитретином (рис. 7D, 7E, S7C и S7C'). Удивительно, но при использовании транс-ретинола мы наблюдали серьезный морфологический эффект только в кардиоидах OFT, в то время как все остальные подтипы не были затронуты (рис. S7E и S7E'). В кардиоидах OFT ретиноиды вызывали снижение регуляции генов OFT и повышение регуляции генов желудочков, но не предсердий (рис. 7F и S7F). Кроме того, кардиоиды OFT, обработанные ретиноидами, раньше дифференцировались в CMs (рис. 7D и S7D). Эти данные свидетельствуют о том, что кардиоидная система удивительно чувствительна к различным ретиноидным соединениям, проявляющим лекарственные и компартмент-специфические эффекты.

Наконец, мы подумали, что многокамерная платформа может быть использована для тестирования влияния лекарств на отдельные или взаимодействующие кардиоиды, поскольку такие подходы в настоящее время ограничены, несмотря на настоятельную необходимость предотвращения лекарственно-индуцированных электрохимических возмущений у развивающихся плодов. Сначала мы подтвердили, что трехкамерный кардиоидный анализ MEA в принципе может быть использован для обнаружения удлиненных FPs при обработке модулятором калиевых каналов 4AP (рис. S7H и S7I). Для повышения производительности мы сосредоточились на измерении распространения сигнала Ca²⁺ в кардиоидах А, LV и двухкамерных LV-А, обработанных различными электрофизиологическими модуляторами, такими как ивабрадин (блокатор каналов HCN4), изопреналин (стимулирует бета-адренорецепторы) и Bay K 8644 (стимулирует кальциевые каналы L-типа). Хотя на Ca²⁺ активность кардиоидов LV влиял препарат-растворитель ДМСО и наблюдался аберрантный повторный вход Ca²⁺ сигнала в присутствии Bay K 8644, на кардиоиды A/LV-A это не повлияло (рис. 7G и 7H). Напротив, Bay K 8644 стимулировал кардиоидное биение как A, так и LV-A, а ивабрадин снижал его во всех подтипах (рис. 7I). Интересно, что изопреналин увеличивал скорость распространения сигнала Ca²⁺ в обоих субкомпартментах кардиоидов LV-A, но не в одиночных кардиоидах (рис. 7J и 7K). Обратный эффект наблюдался при использовании ивабрадина, когда воздействию подвергался отдельный кардиоид А, но не кардиоид LV-A. Таким образом, платформа позволяет проводить скрининг на специфические эффекты лекарств в отдельных кардиоидах, во взаимодействующих субкомпартментах и в целом многокамерном кардиоиде.

В совокупности эти результаты подтверждают, что мы можем выявить ранние развивающие эффекты мутаций, известных тератогенных и аритмогенных препаратов и терапевтических агентов в человеческой многокамерной сердечной платформе и связать их с сердечными дефектами, наблюдаемыми у пациентов. Таким образом, наша работа имеет широкое значение для изучения влияния на биологию сердца человека в различных контекстах - от разработки терапии до экологических исследований.