Время репликации (RT) является фундаментальной эпигенетической характеристикой⁶ , однако как и когда RT устанавливается в процессе развития млекопитающих, неизвестно. Во время фазы S геном должен реплицироваться один и только один раз. Репликация происходит по скоординированной программе, в рамках которой начала репликации происходят в определенном временном порядке, что приводит к появлению паттернов репликации, характерных для каждого типа клеток^7,8. Домены ранней и поздней репликации коррелируют с доступным, активно транскрибируемым эухроматином и молчащим гетерохроматином, соответственно⁹. RT взаимосвязано с другими эпигенетическими характеристиками, хотя их временная и функциональная зависимость до конца не установлена. Например, RT тесно связано с трехмерной организацией генома, причем ламина-ассоциированные домены (LADs) и компартменты типа B обычно соответствуют доменам поздней репликации. В то время как клетки млекопитающих не имеют четко определенных генетических последовательностей, определяющих начало репликации, поэтому репликация начинается в зонах инициации, которые представляют собой области размером около 40 кб, содержащие один или несколько сайтов стохастического запуска начала репликации^10,11. Как правило, зоны инициации с высокой эффективностью реплицируются рано, в то время как зоны инициации с низкой эффективностью реплицируются поздно, во время S-фазы. Таким образом, RT в первую очередь определяется вероятностью инициации в зонах инициации. Остается выяснить, каким образом зоны инициации специфицируются в начале развития и имеют ли клетки раннего эмбриона сходную структуру и особенности программы RT с дифференцированными клетками.

Развитие млекопитающих начинается с оплодотворения и сопровождается интенсивным периодом ремоделирования хроматина¹². Основные характеристики эпигенома впервые определяются в этот период развития: LADs создаются de novo в зиготах мыши, а компартменты A и B, хотя и обнаруживаются в зиготах, постепенно становятся более определенными по мере развития до бластоцисты¹³. Topological-associating domains (TADs) едва различимы до стадии 8 клеток и появляются только на поздних стадиях расщепления^14-16. У мышей активация зиготического генома (ZGA) происходит в это время, причем незначительная часть ZGA происходит в зиготах, а основная волна ZGA - в эмбрионах на поздней 2-клеточной стадии¹⁷. Однако когда впервые появляются программы RT, неизвестно. У дрозофилы микроскопические исследования показывают, что начало поздней репликации возникает после ZGA¹⁸ , но наше понимание этого процесса отсутствует, и как и когда RT впервые возникает у млекопитающих, неизвестно.

Чтобы понять, когда и как RT возникает в процессе развития, мы использовали одноклеточную Repli-seq^5,19 в преимплантационных эмбрионах мыши (рис. 1a,b). Мы собрали 529 отдельных клеток, из которых 53, 54, 50, 49, 34, 44 и 55 прошли контроль качества для зиготы, 2-клеточных, 4-клеточных, 8-клеточных, 16-клеточных, морулы и внутренней клеточной массы (ВКМ) стадии бластоцисты, соответственно (расширенные данные рис. 1а,б, дополнительная таблица 1 и методы). При построении схемы отдельных клеток на основе их балла репликации, который отражает процент реплицированного генома (рис. 1c), была выявлена четкая структура домена репликации, соответствующая прогрессии репликации, с типичными переходами от ранней к поздней стадии на большинстве стадий (рис. 1c и расширенные данные рис. 1c). Исключение составили зиготы и 2-клеточные эмбрионы, которые показали менее четкую структуру репликации по клеткам и всему геному, что говорит о более изменчивой и менее скоординированной программе (рис. 1c). Это не было связано ни с отсутствием синтеза ДНК, ни с эмбриональной гетерогенностью в прогрессии синтеза ДНК, поскольку мы убедились микроскопически, что зиготы демонстрируют ожидаемую и последовательную пространственную картину синтеза ДНК на протяжении S-фазы (Extended Data Fig. 1d,e). Для получения количественной оценки программы RT мы вычислили балл изменчивости, который измеряет дисперсию программы репликации в разных клетках. Показатель вариабельности RT был самым высоким в зиготах, 2-клеточных и 4-клеточных эмбрионах, но постепенно снижался, начиная с 4-клеточной стадии (рис. 1d). RT в ICM оказался более вариабельным по сравнению с морулой, это может отражать то, что ICM принимает решения о судьбе клеток в направлении эпибласта и примитивной эндодермы²⁰ , и, следовательно, в нем, вероятно, присутствует большая гетерогенность в идентичности клеток. В целом, программа RT на самых ранних стадиях развития менее четко определена.

Fig. 1: RT emerges gradually during mouse preimplantation development.

Эмбриональные RT-профили демонстрируют как ранние, так и поздние домены репликации, видимые как долины и плато (рис. 1е). Визуальный осмотр показал постепенное разграничение доменов репликации по мере развития (рис. 1е и расширенные данные рис. 2а). Это не зависит от длины S-фазы, поскольку ее длина остается относительно постоянной до стадии бластоцисты²¹. Чтобы выяснить, меняется ли RT в процессе развития, мы сравнили "ранние" (RT ≥ 0,5) и "поздние" (RT ≤ 0,5) значения RT от зиготы до ICM бластоцисты. В целом значения RT увеличивались в сторону более ранней или более поздней репликации (расширенные данные рис. 2б; увеличение), это указывает на определение ранней и поздней программы RT в ходе развития. Часть генома демонстрирует постоянный раннее или позднее RT на протяжении всего развития (33,1 % генома реплицируется рано и 16,0 % реплицируется поздно на всех семи стадиях; расширенные данные рис. 2b; постоянный). Однако некоторые регионы переходят от ранних к поздним значениям RT и наоборот (расширенные данные рис. 2b; shuffle). Например, 20,9 % генома переходит от раннего к позднему RT от 2-клеточной к моруле и 11,1 % - от 8-клеточной к 16-клеточной ст. Аналогичным образом, 3,1 % генома переходит от позднего к раннему RT между 8 клетками и морулой. Этот анализ также показал, что, хотя некоторые геномные регионы действительно смещают RT между ранними и поздними значениями, наиболее распространенной тенденцией является прогрессивное определение значений RT в сторону более ранних и более поздних (расширенные данные рис. 2b). Действительно, если большая часть генома зиготы и 2-клеточного эмбриона (73 и 77 %, соответственно) демонстрирует промежуточные значения RT (0,4 ≤ RT ≤ 0,8), то по мере развития геном разделяется на значения RT, охватывающие всю фазу S, что приводит к расслоению на более экстремальные ранние и поздние значения RT после 2-клеточной стадии (расширенные данные рис. 3а). Такое поведение напоминает поведение компартментов A и B¹⁴, которые постепенно увеличивают свою прочность на этапах расщепления^14,16, это позволяет предположить, что преимплантация служит периодом постепенного становления трехмерной ядерной архитектуры и RT. Мы пришли к выводу, что, хотя примерно половина генома сохраняет своё RT, оставшаяся половина претерпевает изменения в RT по мере развития и становится более определенной с течением времени. Далее мы охарактеризовали особенности эмбриональных RT, выделив зоны инициации, а также зоны, в которых сходятся противоположные вилки репликации (зоны терминации), и переходные области (TTRs), которые являются областями, расположенными между зонами инициации и зонами терминации^5,7. Из-за разрешения scRepli-seq. и для того, чтобы отличить эти особенности от особенностей таких методов, как OK-seq и EdU-seq22,23, мы называем зоны инициации "пиками RT", а зоны терминации - "впадинами RT". Мы определили пики RT как последовательные бины локальных максимумов, а впадины RT - как последовательные бины локальных минимумов значений RT (расширенные данные рис. 3b)¹⁰... Пики RT могут перетасовываться в TTR, а TTR - в пики RT во время каждого деления клетки (расширенные данные, рис. 3д). Аналогичным образом RT-впадины преобразуются в TTR, а TTR - в RT-впадины, но изменения из RT-пиков в RT-впадины и наоборот происходят крайне редко (Extended Data Fig. 3d). Примерно половина RT-пиков и RT-впадин превращалась в TTR на последующей стадии развития, что свидетельствует о ремоделировании особенностей репликации между каждой стадией после деления клетки. Поскольку TTR являются областями, в которых происходят потенциальные изменения в RT^24,25, такое ремоделирование может служить основой для постепенного развития программы RT. Кроме того, одновременное уменьшение числа пиков RT и увеличение их размера предполагает прогрессирующую консолидацию программы RT⁷ , в результате которой все больше соседних областей с похожими RT сливаются. Действительно, пики РТ постепенно увеличиваются в размерах и приобретают более отчетливые и ранние относительные значения RT по сравнению с их геномным окружением на стадии 4 клеток (рис. 1h). Наши данные подтверждают постепенную консолидацию особенностей RT в ходе преимплантационного развития и позволяют предположить, что формирование RT происходит на уровне пиков RT и TTR...

Наконец, мы исследовали зависимость между трехмерной архитектурой генома и установлением RT. В дифференцированных и стволовых клетках ранняя и поздняя репликация коррелируют с А и В компартментами, соответственно^3,40, а TADs, как правило, соответствуют доменам репликации². Однако, поскольку TADs не обнаруживаются на ранних стадиях дробления^14,16, мы сосредоточились на компартментах и задались вопросом, различаются ли компартменты А и В по RT уже на самых ранних стадиях развития. Компартменты A последовательно демонстрировали более ранний профиль RT по сравнению с компартментами B (рис. 5a и расширенные данные рис. 10d). Различия между ранними и поздними значениями RT в обоих компартментах были менее выражены в зиготах и становились более четкими по мере развития (рис. 5а). В соответствии с незначительными различиями в RT родительских геномов (рис. 2), значения RT в материнском и отцовском A и B компартментах различались незначительно (расширенные данные, рис. 10e). RT между отцовскими компартментами A и B различалось сильнее, чем в материнских компартментах, возможно, из-за более слабой структуры последних^14-16 (Extended Data Fig. 10e,f). Разница в значениях RT между компартментами A и B увеличивалась в процессе развития как за счет лучшей сегрегации значений RT, так и за счет увеличения количества компартментов (рис. 5b). Ингибирование ZGA с помощью α-аманитина полностью устранило различия в RT между компартментами A и B, но оценка компартментов осталась одинаковой (рис. 5c)¹⁴. В целом у эмбрионов, обработанных α-аманитином, компартменты А реплицировались позже, а компартменты В - раньше по сравнению с контролем (расширенные данные, рис. 10g). Поскольку B-компартменты менее доступны, чем A-компартменты (Extended Data Fig. 10h), эти наблюдения можно объяснить нашими результатами, указывающими на то, что α-аманитин приводит к сдвигу в сторону более ранней репликации менее доступных регионов. Мы пришли к выводу, что разделение ранних и поздних RT во время раннего развития совпадает с созреванием A и B компартментов. Кроме того, если ZGA не вносит вклад в прочность компартмента¹⁴ , то ингибирование транскрипции выравнивает различия в RT между компартментами...

Наконец, мы изучили связь между LADs и RT. LADs образуются в зиготах сразу после оплодотворения и реорганизуются в ходе преимплантационного развития, но значительная часть LADs остается неизменной и похожа на LADs клеток ES¹³. В целом LADs, в отличие от межклеточных LADs (iLADs), реплицируются поздно^2,49. Однако, в отличие от клеток ES, RT в зиготах не имеет четкого различия между LAD и iLAD (рис. 5d). Зиготические LAD различаются между родительскими геномами¹³ , и, соответственно, отцовские LAD и iLAD демонстрируют незначительную сегрегацию значений RT, а материнские - ещё в меньшей степени (Extended Data Fig. 10j). RT в зиготах не проявляли сильного смещения в сторону отцовских или материнских LADs/iLADs (Extended Data Fig. 10k). Разделение значений RT в LADs и iLADs увеличивается по мере развития, достигая четкого различия в клетках ES (рис. 5d). Эти наблюдения позволяют предположить, что организация ядер в LADs и iLADs по времени предшествует формированию программы RT. Для решения этой проблемы мы задались вопросом, соответствует ли RT в ES-клетках LADs/iLADs в зиготах. Примечательно, что значения RT в эмбриональных стволовых клетках, построенные по границам LAD в зиготах, показали четкое разграничение RT в эмбриональных стволовых клетках по границам LAD в зиготах (рис. 5е), что свидетельствует о том, что организация LAD в зиготах предрасполагает к RT на более поздних стадиях развития. В отличие от этого, при построении графика значений RT зиготы по границам LAD клеток ES такой корреляции не наблюдалось (рис. 5е). Мы заключаем, что организация LAD и iLAD в начале развития предшествует разделению динамики ранней и поздней репликации.

Наши данные свидетельствуют о том, что становление RT происходит постепенно после оплодотворения, параллельно с постепенным приобретением отличительных особенностей хроматина и аналогично другим эпигеномным характеристикам (рис. 5f). Менее четко определенная и более гетерогенная программа RT у зигот и двухклеточных эмбрионов может отражать большую пластичность структуры хроматина в целом, а также может быть связана с изменениями в отложении гистонов, происходящими на этих стадиях⁵⁰. РНК Pol II в зиготах и эмбрионах двухклеточной стадии вносит свой вклад в определение RT. Сравнительно более мягкое воздействие на RT, оказываемое DRB по сравнению с α-аманитином, позволяет предположить, что сама RNA Pol II влияет на программу RT в эмбрионах 2-клеточной стадии в большей степени, чем транскрипционная элонгация. Хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, вносят ли дополнительные, не связанные с транскрипцией эффекты вклад в эти наблюдения - например, через структурные белки⁵¹ - наши результаты согласуются с работами, показывающими, что транскрипция ZGA может быть менее подвержена влиянию DRB, чем α-аманитина^34,52.

Корреляция между транскрипционной активностью и RT возникает после стадии двух клеток, совпадая с прогрессивным удлинением фазы G1⁵³, которая, как известно, играет важную роль в определении RT⁶. Хотя мы наблюдали крупномасштабные изменения в RT, например, около 20% генома переходят от раннего к позднему RT во время преимплантационного развития, тонкомасштабные изменения за счет постепенного приобретения модификаций гистонов, вероятно, также вносят вклад в настройку RT по мере появления типов клеток. Примечательно, что наши данные показывают, что транскрипция и функция RNA Pol II способствуют определению эпигенетических особенностей компартментов, в данном случае их RT (рис. 5g), но не их сегрегации¹⁴. Наши наблюдения за тем, что структурирование генома на LADs и iLADs предшествует разделению RT на более поздних стадиях развития, устанавливают захватывающую временную зависимость между этими двумя столпами эпигенома.

Наша работа закладывает основы для понимания того, как репликация генома регулируется во время развития, и проливает свет на то, как ремоделируется эпигеном в начале развития млекопитающих.