Межклеточная вариабельность, также известная как клеточная гетерогенность, является неотъемлемой характеристикой клеточных популяций, органов и опухолей и определяется транскрипционными, (1) метаболическими, (2,3) эпигенетическими, (4) и протеомными (5) профилями. Высокопроизводительные анализы с разрешением sc, такие как sc транскриптомика (6,7) или sc протеомика (8,10,113), успешно отражают многочисленные аспекты клеточной гетерогенности и значительно продвигают наше понимание биологии рака (11,12), иммунологии (13) и изучение нормального и патологического состояния тканей. (14-17)

Метаболомика - это изучение малых молекул (метаболитов), которые являются компонентами клеточного метаболизма, выступая в качестве субстратов, продуктов и промежуточных продуктов в биохимических реакциях. (18,19) Помимо того, что метаболизм является неотъемлемой частью всех клеточных функций, он регулирует физиологические (20,21) и болезненные состояния, (20,22-24) включая дифференциацию клеток, (244) пролиферацию, (3) и ответ на терапию. (25) Изменения в метаболитах могут точно и количественно отражать изменения в клеточном состоянии, где часто встречается метаболическая гетерогенность. (3,26,27) Таким образом, метаболомика имеет решающее значение для улавливания динамического фенотипа отдельных клеток.

Интегративные анализы мультиомики могут обеспечить более мощный и всеобъемлющий профиль состояния клетки (28-33) и улучшить наше понимание клеточной динамики, лежащей в ее основе. Функциональная клеточная гетерогенность может наблюдаться даже в генетически идентичных клеточных популяциях. (34,35) Ни обилие белков, ни обилие метаболома не может быть напрямую определено по уровням мРНК. (36,37) Например, протеомные исследования выявили особенности развития и клеточные состояния, которые не отражены в РНК-секвенировании (38), а также обнаружили множество белков, которые не предсказаны генетическим кодом. (39) Ортогональные подходы могут дополнять (28-33) и подтверждать друг друга, а также открывать доступ к механистическим деталям, выходящим за рамки линейных регуляторных программ. Кроме того, такие мешающие факторы, как стадии клеточного цикла, типы клеток или состояния активации, могут быть лучше выяснены с помощью одной модальности данных, которая затем дополняет и усиливает другие.

Для интеграции омики и построения комплексных моделей клеточной гетерогенности необходимы количественные данные высокой пропускной способности (40,41). В настоящее время метаболизм не всегда фиксируется на количественном уровне. Межклеточная изменчивость также требует значительной глубины анализа для уверенного отражения редких клеточных фенотипов. Транскриптомика и протеомика sc уже являются высокопроизводительными методами, что говорит о необходимости разработки специальных методов для количественного доступа к клеточной метаболической гетерогенности при эквивалентной пропускной способности.

Масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS) с использованием таких масс-анализаторов, как ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (FTICR), orbitrap и время пролета (TOF), наряду с методами отбора проб в живых клетках (42-53) и подходами, основанными на визуализации (54-56), с использованием матричной лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS), продвинули область метаболомики. Эти технологии способствуют открытию de novo, количественным и высокопроизводительным измерениям, а также значительно улучшили соотношение сигнал/шум, необходимое для sc-анализа. Однако эти аналитические методы также создают ряд препятствий для всестороннего анализа sc (54-61), и остается несколько проблем, которые в настоящее время редко решаются в подходах к метаболомике sc.

В этой статье рассматриваются последние достижения в области метаболомики с помощью MS с точки зрения биолога. Новые методологии, в частности стратегии ионизации и высокопроизводительного выделения sc, а также усовершенствования в области визуализации MS (MSI) тщательно анализируются с точки зрения их способности отвечать на актуальные биологические вопросы. Подчеркиваются ключевые остающиеся проблемы в улавливании биологической гетерогенности, которые могут быть решены с помощью будущих технологических разработок. Кроме того, выделены ортогональные методы, которые обеспечивают дополнительное понимание глубинных механизмов и подтверждают результаты биологических исследований. Наконец, рассматриваются биологические области, в которых технологии sc могут принести значительную пользу.

Метаболическая гетерогенность - это многогранное явление (62), отражающее разнообразие метаболических состояний внутри и между клетками, организмами и популяциями под влиянием различных факторов в пространстве и времени (рис. 1). Эта неоднородность может возникать в пределах одной и той же ткани, например, в мозге, где взаимодействие между различными типами клеток и их субпопуляциями способствует формированию сложной архитектуры ткани (рис. 1A). Дальнейшая неоднородность возникает из-за пространственных вариаций в тканях, таких как опухоли, где различные регионы могут демонстрировать различные метаболические профили из-за вариаций в доступности кислорода и питательных веществ (рис. 1B). Во времени состояние метаболизма может колебаться из-за изменений в условиях окружающей среды или на разных этапах роста клеток или развития организма, старения и иммунных реакций (рис. 1B). Метаболические ферменты часто регулируются не транскрипционно, а на уровне доступности субстратов или ингибирования продуктов (63), и мало экспрессируемые ферменты могут существенно влиять на концентрацию метаболитов за счет высоких потоков. Кроме того, стохастические вариации в экспрессии и катализе ферментов вносят значительный вклад в метаболическое разнообразие даже в генетически идентичных популяциях (64) (рис. 1С). Такие вариации можно рассматривать как аналог Waddington’s Landscape, метафорически представляющего мяч, катящийся по контурному ландшафту с многочисленными долинами и пиками, которые изображают, как генная регуляция направляет клетки по различным путям развития к различным судьбам. Аналогично, метаболические неоднородности в пространстве и времени могут определять стабильные устойчивые состояния в различных клетках и, таким образом, направлять клетки к различным метаболическим судьбам (рис. 1С).



Рисунок 1. Схематическое представление типов наблюдаемых метаболических неоднородностей в биологических системах. (A) Рисунок иллюстрирует сложность архитектуры ткани в мозге, подчеркивая взаимодействие между различными типами клеток и их субпопуляциями (популяция 1 с субтипами 1-3: p1.1; p1.2; p1.3). Эти взаимодействия способствуют формированию сложной, гетерогенной структуры ткани, которую можно зафиксировать с помощью sc-технологий. (B) Гетерогенность может возникать из-за пространственных вариаций в тканях, как показано для области s1 или s2. Также показаны временные колебания, например, в момент времени t1 или t2 во время роста опухоли и инфильтрации иммунными клетками. Опухолевые клетки выделены красным или желтым цветом, различные иммунные клетки - синим и зеленым (C) Стохастические вариации в экспрессии и катализе ферментов вносят значительный вклад в метаболическое разнообразие. Здесь различные скорости каталитических реакций изображены как k1 и k2 (левая панель). Далее представлен ландшафт метаболических состояний Уоддингтона (правая панель) с различными квазистабильными метаболическими состояниями, обозначенными как «st». (D) Изображены межклеточные различия (левая панель) между клетками в разных микросредовых нишах, каждая из которых обозначена как n1 или n2. На правой панели показана межорганизменная и межиндивидуальная изменчивость.

Гетерогенность усугубляется межклеточными различиями, когда клетки одной и той же ткани могут по-разному адаптироваться в зависимости от микросредовых ниш (65,66), а также межорганизменной и межиндивидуальной изменчивостью, которая охватывает более широкие биологические и экологические вариации (Рисунок 1D). Таким образом, метаболическая гетерогенность - это не просто отражение уже существующего транскрипционного или протеомного разнообразия, и на концентрацию метаболитов влияют как внутренние генетические регуляторы, так и внешние факторы окружающей среды. Таким образом, метаболическая гетерогенность отражает биохимическую активность и адаптацию в режиме реального времени, предлагая независимое считывание функционального состояния клеток.

Для дальнейшего обсуждения метаболической гетерогенности мы отсылаем читателя к недавним обзорам, посвященным аспектам опухолевой гетерогенности (3,67) или гетерогенности развития. (67,68) Хотя в микроорганизмах также наблюдаются клинически значимые метаболические гетерогенности, они выходят за рамки данного обзора, и мы отсылаем читателя к недавнему обзору Evans and Zhang. (69)

Улавливание и интерпретация гетерогенности включает несколько важных соображений (рис. 2). Одним из общих для всех omics является обеспечение того, чтобы измеренная гетерогенность выявляла истинную биологическую гетерогенность. Объемные эксперименты усредняют технический шум и биологическую гетерогенность, в то время как sc-методы чувствительны к ним и, следовательно, сбивают с толку. (70-72) С другой стороны, технологии sc-метаболомики должны достигать достаточной аналитической глубины, пропускной способности и количественной оценки, чтобы надежно отражать клеточную метаболическую гетерогенность. Еще одно важное соображение заключается в обеспечении того, чтобы захваченные состояния отражали истинное состояние метаболизма. Из-за своей высоко динамичной природы метаболизм требует более строгих методов сохранения, чем те, которые используются в sc-транскриптомике или sc-протеомике. Эти соображения взаимодействуют со специфическими техническими возможностями MS, что приводит к возникновению уникальных проблем в sc-метаболомике.



Рисунок 2. Схематическое представление различных соображений для эффективного отражения метаболической гетерогенности. Выделены 1) связь между биологической гетерогенностью и техническим шумом; 2) необходимость достижения достаточной пропускной способности; 3) глубина анализа; 4) количественная оценка и 5) надежность сохранения истинных метаболических состояний. Графики снижения размерности представлены с помощью осей Component 1/2 и tSNE1/2. Сокращения: p: популяция; Gln: глутамин; Glu: глутамат; IS: внутренний стандарт.

Для того чтобы метаболомика sc могла отразить истинную биологическую гетерогенность, методы должны быть способны отличить клеточные метаболиты от случайных загрязнений и шума, особенно при низких концентрациях, характерных для анализа sc, или для метаболитов, образующихся транзиторно в уникальных условиях. В метаболомике отсутствие всеобъемлющего плана клеточных метаболитов приводит к исследованию широкого химического пространства, в отличие от геномных или белковых баз данных, которые имеют четко определенное пространство поиска analyte. Это пространство поиска еще более расширяется за счет множества adducts и фрагментов, которые могут образовываться даже в зависимости от образца. (73)

Эта проблема особенно актуальна для методов метаболомики, в которых не используется разделение аналитов перед детектированием, таких как масс-спектрометрия с прямой инфузией (DIMS), масс-спектрометрия с проточной инжекцией (FI-MS) или MSI. В отличие от LC-MS и GC-MS, которые используют хроматографию для разделения метаболитов, обеспечивая высокую селективность и большую достоверность аннотации соединений, (74) DIMS and MSI обходятся без этого этапа. (75) Кроме того, такие методы, как MALDI-MS, часто требуют жесткой подготовки проб которая может изменить нативные профили метаболитов (76), а матрицы, используемые для подготовки проб, могут вносить дополнительные химические загрязнения. Более того, было показано, что даже при метаболомике с помощью MS большинство обнаруженных сигналов имеют не-биологическое происхождение. (77) Таким образом, несмотря на дополнительную уверенность, анализ MS (2) и методы разделения сами по себе не могут подтвердить биологическое происхождение аннотированных соединений. Поэтому аннотации метаболитов должны быть проверены ортогональными методами или подтверждены с помощью строгих имитационных образцов и параллельного изотопного мечения, как это делается при проверке метаболитов. (77,78)

Помимо обеспечения специфичности, методы метаболомики должны обеспечивать достаточную глубину анализа для получения информации о метаболической гетерогенности. Под «глубиной» понимается количество метаболитов, последовательно определяемых в отдельных клетках, однако оптимальная информативная глубина остается неясной. В объемной метаболомике количественное определение примерно 100-150 центральных углеродных метаболитов часто является достаточным для понимания биологических вопросов, основанных на гипотезах. Интересно, что исследования по секвенированию РНК также показали, что анализ части экспрессируемых транскриптов - около 400 генов - может быть достаточным для получения значимых биологических данных. (79) Поэтому приоритет количественной точности для определенного набора метаболитов над увеличением глубины анализа может быть более выгодным и должен рассматриваться в контексте четких биологических вопросов.

Помимо глубины анализа, важным моментом в метаболомике является масштабируемость. Большинство современных технологий не позволяют эффективно обрабатывать большое количество клеток. Например, методы, включающие хроматографию (80,81) или отбор проб живых клеток, редко позволяют проводить анализ с высокой пропускной способностью. (46-53) Несколько новейших методов демонстрируют значительный прогресс (82-88) и способны получить доступ к клеточной гетерогенности многих клеток, а также биологических реплик. Тем не менее, оптимальное количество клеток должно быть протестировано самостоятельно, руководствуясь статистическими соображениями, основанными на гетерогенности в биологическом контексте и исследуемой гипотезе. (89)

Для того чтобы метаболомика sc достигла надежных количественных показателей, необходимо найти удовлетворительное решение проблемы «эффекта матрицы». (90,91) Матричный эффект - это разница в масс-спектрометрическом отклике для аналита в стандартном растворе и в отклике для того же аналита в биологической матрице. (92) Этот эффект нарушает линейность сигналов MS вследствие либо подавления ионов, когда эффективность ионизации снижается из-за конкуренции зарядов во время ионизации, либо усиления ионов, когда один аналит усиливает ионизацию другого. Эти эффекты различны для отдельных соединений и не могут быть единообразно скорректированы, что в конечном итоге приводит к затушевыванию биологически значимых вариаций.

Матрицы, используемые в MALDI-MS, - соединения, которые совместно кристаллизуются с молекулами аналита и способствуют ионизации, поглощая энергию лазера, испаряясь и помогая переносить протоны на молекулы аналита, - вероятно, приводят к более сильным матричным эффектам. (54,93) Однако важно отметить, что подавление ионов - это широкая проблема, которая в конечном итоге мешает количественному определению во всех методах ионизации.

Эффекты ионного подавления могут быть вызваны метаболическим состоянием образцов, типов клеток или областей ткани, что может исказить результаты, подчеркивая необходимость независимых мер контроля. Для решения этой проблемы применение стратегий нормализации с использованием изотопом меченных внешних стандартов считается методом выбора. (94-96) Недавно были предложены некоторые попытки предсказать подавление ионов (97,98), и в настоящее время они находятся на стадии коммерциализации. (99) В целом, коррекция ионного подавления является обязательной, когда требуется количественная оценка любой сложной матрицы.

Другой основной проблемой метаболомики является высокодинамичный характер метаболизма. С одной стороны, есть соображения, присущие биологии: концентрация метаболитов может резко колебаться в узких временных рамках как из-за внутренних стохастических клеточных процессов, так и из-за внешних флуктуаций окружающей среды. С другой стороны, существуют специфические технологические соображения - определенные методы выделения клеток могут вызвать изменения в метаболоме из-за стресса или введения реактивных химических веществ. (100,101) Например, метаболические потоки могут быть нарушены в течение нескольких секунд (102,103), а кинетика маркировки глюкозы в системах млекопитающих показала, что весь пул NADH, полученный из глюкозы, может быть перевернут в течение 15 минут (104). Поэтому захват невозмущенных метаболомов требует тщательного учета этих внутренних и внешних факторов, а будущие достижения (как обсуждается в разделе 7) должны предложить строгие стратегии оценки.

В целом, различные проблемы метаболомики sc требуют постоянного совершенствования аналитических технологий и методологий для точного отражения сложных метаболических ландшафтов отдельных клеток. Эффективные решения позволили решить некоторые проблемы, такие как чувствительность и масштабируемость. Достижения в области sc-протеомики могут вдохновить на дальнейшие усовершенствования. (105,106) Например, такие стратегии сбора данных, как независимое от данных параллельное накопление-последовательная фрагментация (DIA-PASEF), приоритетная одноклеточная протеомика (pSCoPE) и анализ последовательного получения всех теоретических масс-спектров (SWATH), увеличили глубину анализа sc-протеома. (107-110) Прогресс также достигнут в выделении невозмущенных метаболомов, а дальнейшие достижения могут черпать вдохновение в sc-протеомике, где готовые к использованию решения улучшили переносимость и воспроизводимость методов, упростив внедрение sc-протеомики в новых лабораториях. (111-113) Однако такие проблемы, как специфичность и количественное определение, остаются нерешенными, что требует специальных подходов к метаболомике. В конечном итоге нам понадобятся технологии, комплексно решающие все эти проблемы. Если технология решает проблему масштабируемости, но не решает проблему специфичности, биологическая интерпретация будет ограничена. Нахождение баланса между достижением высокой специфичности и чувствительности, высокой точности и количественных результатов, сохранением нативного состояния клеточных метаболитов во время анализа и получением данных с высокой пропускной способностью и высоким разрешением остается важнейшей задачей, которая определит будущую траекторию развития этой области исследований.

Методы машинного обучения ( ML) будут все чаще использоваться для более эффективного учета клеточной гетерогенности и поддержки разработки методов для воспроизводимого извлечения данных и анализа (рис. 3). Одним из примеров является применение ML для устранения нелинейных взаимосвязей в различных наборах данных метаболомики. (114) Кроме того, модели смешивания и многомерный анализ являются надежными вычислительными методами, часто применяемыми к наборам данных, характеризующимся высокой вариабельностью. (115,116) Для кластеризации и классификации одиночных клеток обычно применяются методы обучения без надзора и с надзором. Некоторые приложения этих методов включают кластеризацию отдельных клеток в значимые популяции при отсутствии меченых данных, (117) классификацию клеточного состава в тканях пациента для выявления фенотипов опухолей и оценки клинического риsc (118) профилирование множества секретируемых биомаркеров для классификации опухолевых клеток (119) и мониторинга устойчивости к химиотерапии. (120)



Figure 3. Schematic representation of the various stages where ML methods could be applied in sc metabolomics: data acquisition, peak picking and image segmentation, downstream analysis, multiomics integration, and predictive models. ML methods could be used in upstream data analysis, such as peak picking, in situ image segmentation for subcellular metabolomics, and intelligent cell isolation. Nonlinear relationships in diverse metabolomics data sets could be solved by applying ML. ML also assists in integrating multiomics data and building predictive models for drug responses, especially in cancer research. Unsupervised and supervised learning methods are essential for clustering and classifying single cells, profiling biomarkers, assessing chemotherapy resistance, and identifying clinical risk phenotypes.

Алгоритмы ML также играют важную роль в анализе исходных экспериментальных данных или изображений. MSI стал мощным инструментом для sc-протеомики и метаболомики, позволяя проводить пространственно-разрешенный анализ на уровне sc, и требует специализированного анализа данных, в котором часто используются методы ML. (121) Методы ML применяются в самых разных областях - от сегментации изображений in situ для субклеточной метаболомики, (122) интеллектуальной изоляции клеток (123) до более широких рабочих процессов при анализе данных MSI. (124) Эти приложения ML упростили и стандартизировали различные аспекты метаболомики.

Будущие исследования, несомненно, приведут к расширению применения ML. Автоматизированное извлечение признаков с помощью ML будет способствовать обработке огромного количества высокопроизводительных данных в будущем. Дальнейшее применение ML в sc будет связано с построением моделей для прогнозирования ответа на лечение, особенно в исследованиях рака. (125) Методы ML также могут помочь в мультиомической интеграции метаболомической информации о sc, чтобы наложить омические данные на метаболомическую модель и объединить различные омические слои с помощью методов многослойных сетей. (126) Постоянное совершенствование применения методов ML, несомненно, будет и дальше приносить пользу метаболомике.

Анализ одиночных клеток - не новая концепция, впервые появившаяся в 1970-х годах. Ранние технологические разработки 1970-х годов включали внедрение масс-спектрометрии с лазерной абляцией для анализа биологических образцов. (127) Jimenez и др. использовали MALDI-MS для прямого пептидного дактилоскопирования отдельных нейронов в мозге Lymnaea, продемонстрировав его потенциальное использование в исследованиях sc. (128) Одни из первых метаболомических исследований sc были проведены Kennedy и Jorgenson в конце 1980-х годов, которые проанализировали аминокислотный состав одного гигантского нейрона из улитки Helix aspersa с помощью открытой трубчатой капиллярной хроматографии. (129) Примерно в то же время Wallingford и Ewing проанализировали содержимое клеток нейронов из Aplysia californica с помощью капиллярной пробы. (130) Дальнейший значительный импульс был достигнут в 1990-х годах благодаря достижениям в области молекулярной биологии и методов визуализации. (131,132) В 1990-х годах Masujima’s разработал «видеомасс-спектроскоп», который позволил проводить анализ живых образцов с помощью стеклянного капилляра и наноэлектроспрей-ионизации. (133) Хотя изначально эти методы были малопроизводительными, дальнейшие исследования привели к появлению более надежных и универсальных методик. (134) Сегодня передовые технологии позволяют проводить высокопроизводительный анализ тысяч клеток, а методы, обеспечивающие чувствительность, позволяют анализировать даже мельчайшие отдельные клетки, включая отдельные бактерии. (88,135,136)

HRMS, например, на основе приборов Orbitrap и TOF, стали незаменимы, когда дело доходит до улавливания метаболической гетерогенности. Несмотря на значительные успехи, проблемы с улавливанием метаболической гетерогенности sc сохраняются из-за специфических технологических ограничений инструментария и присущей биологическим системам и аналитам сложности.

Ниже мы представляем некоторые из последних инноваций, которые расширяют границы того, как мы фиксируем и анализируем сложные метаболические ландшафты отдельных клеток.

Обнаружение малораспространенных метаболитов в ничтожных объемах привело к разработке высокочувствительных MS-детекторов. Проблемы чувствительности в метаболомике остаются из-за специфических для каждого химического класса проблем, которые требуют специальных решений. Например, такие методы, как MALDI и ионизация наноэлектроспреем (nanoESI), сталкиваются с проблемами низкой эффективности ионизации для неполярных соединений и специфическими для каждого класса аналитов эффектами, которые могут исказить метаболическое профилирование. (137,138) Кроме того, зависимость MALDI от выбора матрицы может привести к матричным эффектам, которые изменяют эффективность ионизации и специфичность для отдельных соединений. (139,140) Это послужило причиной разработки новых, более чувствительных и комплексных технологий ионизации.

Недавние усовершенствования методов ионизации на основе лазера способствовали значительному прогрессу в метаболомике sc повысив чувствительность и специфичность. Микроскоп LAESI, использующий ионизационную масс-спектрометрию с лазерной абляцией электрораспыления (LAESI-MS), позволяет проводить пространственно-разрешенный MS-анализ единичных клеток. (141-144) Этот метод успешно идентифицировал химические виды, специфичные для физических структур в листьях Fittonia argyroneura с высоким пространственным разрешением, демонстрируя способность точно определять метаболические изменения в изолированных одиночных клетках или тканях. (142)

Еще более расширяя возможности LAESI, недавние разработки включили ионную подвижность (f-LAESI-IMS-MS), (143) существенно улучшив обнаружение метаболитов. Эта инновация позволила получить 259 связанных с образцом пиков на клетку, что почти вдвое больше, чем 131 связанный с образцом пик на клетку, достигнутый с помощью традиционной f-LAESI-MS. Благодаря полной автоматизации платформы для отбора проб in situ, метод достиг общей скорости отбора проб 804 клетки в час. Примененный для изучения корневых клубеньков сои (Glycine max), этот метод выявил как унимодальное, так и бимодальное распределение метаболитов, что подчеркивает его потенциал для выяснения сложных метаболических неоднородностей внутри отдельных клеток и во всех клеточных популяциях. (143) Несмотря на свою мощь, подход LAESI-MS не имеет хроматографического разделения, что может привести к эффектам подавления ионов и невозможности различить изомерные и изобарные соединения. (145) Будущие разработки должны быть направлены на решение этих проблем, чтобы обеспечить надежный количественный анализ.

Помимо этих лазерных инноваций, разработка наносекундной импульсной ионизации в диэлектрическом барьерном разряде (146,147) (DBDI) сообщила о еще одном значительном улучшении сигнала. В DBDI используются высоковольтные импульсы длительностью до 100 ns с задержкой около 900 µs для значительного снижения фонового химического шума и усиления сигнала ионов. Эта методика позволила улучшить соотношение сигнал/шум и чувствительность на 172 % и 271 % соответственно, обеспечив более чувствительное обнаружение летучих молекул в сложных смесях. (146)

Если говорить о методах ионизации, специально предназначенных для sc-анализа, то гибридный источник ионизации, сочетающий nanoESI и DBDI, предлагает инновационный подход для обнаружения метаболитов с различной полярностью. (147) Капилляр с внутренним диаметром наконечника 1 µм берет пробы клеток и служит источником nanoESI для ионизации полярных метаболитов, в то время как источник DBDI улучшает ионизацию аполярных метаболитов. Гибридный режим позволил обнаружить более широкий спектр метаболитов в луке и клетках рака поджелудочной железы человека PANC-1, увеличив охват, эффективность ионизации и пределы обнаружения. Была описана еще одна инновационная технология ионизации, на этот раз предназначенная для конкретного химического класса аналитов: онлайн-платформа кватернизированной дериватизации. Десорбируя метаболиты с помощью лазера и реагируя с дериватизирующим реагентом, передаваемым по углеродному волокну (LACFI-MSI), эта платформа значительно увеличила массовые сигналы моноглицеридов и диглицеридов, тем самым повысив чувствительность и специфичность профилирования глицеридов. (148) Эти специфические эффекты соединений следует тщательно учитывать при выборе этих методов для решения конкретных биологических вопросов.

Чтобы расширить границы химического пространства, исследуемого одним методом MS, был разработан новый концентрический гибридный источник ионизации, сочетающий nanoESI и химическую ионизацию при атмосферном давлении (nanoESI-APCI), для одновременного обнаружения полярных и неполярных метаболитов в одиночных клетках. Этот источник позволил на порядок повысить предел обнаружения до 10 pg mL–1. После оптимизации рабочих параметров было предварительно идентифицировано 254 метаболита, обнаруженных в наноESInanoESI-APCI, что продемонстрировало его применение для изучения метаболической гетерогенности тканевого микроокружения гепатоцеллюлярной карциномы человека. Это было объединено с лазерным захватом микродиссекции (LCM), что позволило достичь пропускной способности 80 клеток в минуту и различить типы и подтипы раковых клеток, а также изучить метаболические нарушения, вызванные голоданием глюкозы в клетках Michigan Cancer Foundation-7 (MCF7), и метаболическую регуляцию раковых стволовых клеток. (84) Отдельное исследование было направлено на совершенствование анализа метаболитов на основе липидов. Исследователи разработали метод дериватизации на зонде и объединили его с бесконтактной ионизацией на наноуглеродном волокне для чувствительного обнаружения жирных спиртов и стериновых метаболитов на уровне sc. (149) В этом методе использован уникальный источник ионизации, совместимый с низкополярными растворителями, такими как дихлорметан, что расширяет возможности обнаружения этих сложных аналитов. Кроме того, масс-спектрометрия с реакцией переноса протона (PTR), традиционно используемая для определения следовых уровней летучих органических соединений, теперь адаптируется для анализа малых нелетучих молекул. Используя supercritical fluid extraction (SFE), этот подход позволяет быстро и селективно извлекать липофильные соединения из сложных матриц. Сочетание PTR MS с SFE продемонстрировало потенциал для анализа малых молекул в одиночных клетках, особенно липофильных соединений, при этом метод позволяет наблюдать значительное количество ионов как в режиме положительных, так и отрицательных ионов. (150,151) Способность сопоставить некоторые из этих ионов с химическими формулами из базы данных LipidMaps подчеркнула потенциал метода для детального анализа липидов на клеточном уровне. Будет интересно определить, являются ли наблюдаемые улучшения в ионизации специфичными для определенных классов липидов и совместимы ли они с более широким количественным анализом липидов в сложных тканях и матрицах.

Капиллярный электрофорез (CE), являясь альтернативой широко используемому методу LC для разделения метаболитов, обеспечивает уникальные преимущества для метаболомики. (44,152-154) Он требует очень малых объемов образцов (от нанолитра до пиколитра), что делает его идеальным для анализа ограниченных или ценных образцов, и обычно имеет более короткое время анализа, позволяя быстрее проводить разделение и анализ. Используя нанокапиллярную электрофорез-масс-спектрометрию (nanoCEMS), исследователи оптимизировали ионизацию без оболочки и скорость потока образцов, чтобы еще больше оптимизировать технологию CE-MS для анализа на малом уровне. Это позволило обеспечить эффективную ионизацию по механизму ESI с использованием конического наконечника, количественно определив 20 аминокислот из 10 отдельных клеток. (155) Далее исследователи внедрили метод обогащения образцов - двойное предварительное концентрирование большого объема путем изотахофореза и укладки (LDIS) - и применили его в nanoCESI-MS. По сравнению с обычной CE-MS без оболочки, соединение nanoCESI и LDIS обеспечило увеличение чувствительности до 800 раз. Аналогично, метод field amplified sample injection (FASI) CE-ESI-MS обеспечивает 100-300-кратное улучшение пределов обнаружения по сравнению с гидродинамическими инъекциями. (154) В методе FASI образец вводится в капилляр в условиях, которые вызывают концентрацию в начале капилляра, обусловленную полем. В этом методе также используются внутренние стандарты, что повышает точность идентификации и количественного определения аналитов. Однако ограниченное количество клеток, к которым можно получить доступ с помощью этих технологий, в частности из-за трудностей с автоматизацией загрузки образцов, ограничивает их биологическую применимость, требуя инновационных подходов к отбору проб для увеличения пропускной способности.

Несколько групп сообщили о новых стратегиях ионизации в сочетании с манипуляцией или выделением sc. В этой связи 3D-печатный источник ионизации объединил внесение образца, выделение метаболитов и ионизацию в одном устройстве для MS-анализа sc. Это упростило анализ sc и улучшило воспроизводимость измерений, при этом зонд можно адаптировать к клеткам разного размера. В последующем исследовании он был использован для высокопроизводительного анализа трех типов раковых клеток с целью их дифференциации на основе обнаруженных метаболитов. (156) В последующем исследовании использовались алгоритмы ML для выявления значительных различий в метаболических характеристиках 756 отдельных клеток. (157) Разработка масс-спектрометрии с электрозапуском ионизации в интактных живых клетках (83,125) (ILCEI-MS) аналогичным образом объединила в одном технологическом подходе выделение и повышение чувствительности. В ней используется капиллярный эмиттер для переноса целых живых клеток непосредственно в ионообменную трубку MS, что позволяет достичь высокой пропускной способности детекции без использования растворителя, тем самым минимизируя разбавление и матричные помехи. (83) Важно отметить, что этот метод позволил добиться относительно высокой пропускной способности - 51 клетка в минуту, и было зарегистрировано более 4000 первичных одиночных клеток, выделенных из свежих мультиорганных тканей мышей, что демонстрирует его применимость и надежность. Быстрое выделение отдельных живых клеток, вероятно, сохраняет их метаболомы в целости и сохранности, однако будущие исследования должны официально подтвердить это предположение с помощью маркеров окисления, стресса или клеточного энергетического статуса.

Методики, описанные здесь, демонстрируют важные достижения в области чувствительности и эффективности ионизации. Эти достижения демонстрируют разнообразные инновации в стратегиях ионизации, от улучшения обнаружения сигнала до адаптации методов к анализу sc. Однако такие ограничения, как пропускная способность, подавление ионов и сохранение метаболических состояний, сохраняются, что указывает на области для будущего развития и интеграции в системы выделения sc. Кроме того, хотя эти технологии демонстрируют успешный захват технических гетерогенностей, существует необходимость в дальнейшей оценке биологических результатов. Еще предстоит выяснить, подвержены ли эти новые методы количественным погрешностям, например, из-за эффектов ионизации, присущих образцу и специфичных для метаболического состояния. Также неясно, можно ли эффективно уловить биологические гетерогенности, помимо тех, что отличают различные типы клеток. Тем не менее, достигнутые чувствительность и пропускная способность значительно продвинули технологию sc MS.

Последние достижения в области технологий sc MSI значительно улучшили наше понимание метаболической гетерогенности на клеточном уровне. (158)

MALDI отличается своей щадящей ионизацией и до сих пор является наиболее распространенным методом сканирования MSI. (159,160) Тем не менее, ионизация на основе MALDI может иметь ограничения, такие как инвазивная подготовка проб или ограниченная пригодность для небольших молекул. В последнее время появилось множество методов, являющихся альтернативами или усовершенствованиями. Например, лазерная десорбционная ионизация под давлением (t-AP-LDI) с постфотоионизацией (PI) обеспечивает высокое пространственное разрешение при анализе липидов и нейротрансмиттеров, а в будущем обещает субмикронное разрешение. (161) Техника ионизации на основе лазера, называемая ионизацией электрораспылением с лазерной абляцией на основе волокна (f-LAESI), еще больше облегчает профилирование одиночных клеток с высоким разрешением. (143,162,163) Например, применение этого метода, использующего для отбора проб абляцию в среднем инфракрасном диапазоне, позволило выявить метаболические субпопуляции и проанализировать динамику инфекции в растениях. (162) Возможность брать пробы непосредственно с отдельных клеток, без предварительной изоляции, позволяет более эффективно сохранять метаболом. Кроме того, использование сверхвысокого разрешения позволило определить элементные формулы неизвестных метаболитов, особенно тех, которые производятся редкими клетками. Этот подход позволил выявить скрытые субпопуляции в многоклеточном симбиотическом органе, продемонстрировав бимодальное распределение химических веществ, указывающее на клетки в пролиферирующей и покоящейся фазах - такое различие возможно только с помощью sc-анализа. Будущая работа над методами анализа окружающей среды, такими как LAESI или t-AP-LDI MS, может быть направлена на ограничение влияния высоких фоновых помех для обеспечения количественного анализа. Кроме того, спектральная сложность, присущая методам MSI из-за отсутствия ортогонального разделения, может быть решена путем включения разделения на основе ионной подвижности и MS высокого разрешения. (164,165)

Несколько недавних разработок, хотя они еще не вышли на научный уровень, многообещающие и побуждают к дальнейшим исследованиям. Достижения в области масс-спектрометрии MALDI с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье (FT-ICR MSI) выявили метаболическую гетерогенность в адренокортикальной карциноме и человеческом (HER2)-позитивном раке желудка. (166,167) Это новшество позволяет выявить метаболическую вариабельность как на меж-, так и на внутриопухолевом уровне и связать ее с результатами лечения и эффективностью химиотерапии. Хотя специфические изменения метаболитов не были подтверждены с точки зрения биологического происхождения сигнала MS или его количественной точности, гетерогенность, наблюдаемая на уровне субпопуляций опухоли, была продемонстрирована как независимый прогностический фактор, что подчеркивает потенциальную клиническую пользу такого анализа. Еще один новый метод визуализации продемонстрировал неоднородность тканей на примере гиппокампа мыши. Исследователи разработали новую липид-микроскопическую платформу с лазерной микродиссекцией (168), которая позволила расширить границы количественного и широкомасштабного анализа липидома в сторону пространственного разрешения. Для этого были подготовлены последовательные криосрезы образцов тканей, перекрестное сопоставление нативных и окрашенных изображений, лазерная микродиссекция интересующих областей, экстракция липидов in situ и количественная shotgun lipidomics. Исследователи продемонстрировали количественный предел на уровне около 10 клеток. Пока неясно, позволят ли дальнейшие усовершенствования этих методов достичь количественного уровня при разрешении, необходимом для sc-анализа.

Для повышения чувствительности и разрешения пространственной метаболомики был разработан новый подход с использованием масс-спектрометрии с сегментированной десорбцией электрораспылением с контролем температуры (STC-DESI), который позволяет точно контролировать температуры десорбции и ионизации. (169) Этот метод концентрировал распылительный шлейф и ускорял испарение растворителя при различных температурах, достигая пространственного разрешения 20 µм. Достигнутое разрешение позволило напрямую наблюдать неоднородность вокруг отдельных бляшек амилоида-бета (Aβ) в тканях мозга, выявляя такие важные детали, как истощение карнозина в мышиной модели болезни Альцгеймера. Несмотря на то, что этот подход нацелен на микроскопические объекты, а не на отдельные клетки размером около 150 м, значительное повышение чувствительности позволило обнаружить метаболиты с низкой концентрацией и менее ионизируемые нейтральные липиды, преодолевая разрыв в направлении разрешения sc.

Несколько других методик продемонстрировали превосходное разрешение изображений и пригодность для метаболомики в sc. Метод Ambient Fiber-Assisted Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging (AFADESI-MSI) позволяет проводить прямой анализ биологических тканей in situ в условиях окружающей среды без необходимости подготовки проб. (170-173) Это должно стать преимуществом для метаболомики, поскольку потенциально повышает вероятность отбора образцов метаболомов, не подвергшихся воздействию. Применение AFADESI-MSI позволило провести пространственные метаболомические исследования конкретных областей мозга у крыс на модели диабетической энцефалопатии. (170) Родственная методика, масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS), была объединена с TOF (TOF-SIMS) и позволила с высоким разрешением изучить глиобластому, обнаружив белки и липиды в одном и том же образце с разрешением 800 нм. (174) Следует отметить, что хотя и SIMS, и AFADESI-MSI используются для анализа и визуализации поверхности, SIMS требует вакуумных условий и может вызвать большее повреждение образца, в то время как AFADESI-MSI работает в условиях окружающей среды и считается в целом менее инвазивным, хотя и более подверженным влиянию внешних помех.

Масс-спектрометрия с визуализацией наноструктур (NIMS) и NIMS с наночастицами фторированного золота (f-AuNPs) были предложены для преодоления проблем высокого ионизационного шума и низкого охвата метаболома традиционным MALDI, предлагая комплексный, ультрачувствительный и высоко-разрешающий MSI метаболитов в биологических системах. (175,176) В одном из примеров применения, предназначенном для метаболомики, NIMS с f-AuNPs позволил одновременно обнаружить полярные метаболиты и липиды в одном и том же аналитическом сеансе, а затем интерпретировать метаболические изменения на системном уровне. (175) Несмотря на эти преимущества, AuNP требуют высоких энергий лазера для десорбции/ионизации, что может вызвать лазерно-индуцированную фрагментацию и адсорбцию метаболитов на поверхности наночастиц, что приводит к смещению в аннотации и количественном определении биологически значимых малых молекул. (177)

Методы, основанные на MSI, могут эффективно применяться к диссоциированным и изолированным одиночным клеткам, однако традиционно значительное количество времени уходит на отбор проб между разрозненными клетками или анализ только части клетки в зависимости от ее положения в растровой схеме визуализации. Последние достижения объединили MSI со стратегиями сегментации, что позволило повысить пропускную способность и улучшить нацеленность на конкретные типы клеток или редкие клеточные популяции в тканевых и культуральных моделях. (178)

С помощью высокопроизводительного метода МMS было проанализировано 154 910 липидомикропрофилей из различных областей мозга, что позволило выявить кластеры липидов и метаболическое разнообразие между типами клеток и на протяжении всего развития. (88) Для достижения этой цели исследователи использовали платформу, управляемую Python, и микроскопическую визуализацию для выбора областей, представляющих интерес, и проведения MALDI-MS анализа только в этих местах. (179) Было опубликовано множество дальнейших исследований, проведенных с помощью этого подхода, которые расширили применение на различные виды визуализации и ионизации. (178) В более позднем подходе сублимация матрицы позволила проводить точечный анализ отдельных клеток in situ под микроскопом. Дальнейшие усовершенствования объединили разделение подвижности ионов в ловушке с двухполярной ионизацией MSI и внедрили разработанный на заказ анализатор совместной регистрации изображений, что позволило автоматизировать профилирование человеческих клеток PANC-1 и активированных клеток PSC, при этом было проанализировано 52 одиночные клетки на каждый тип клеток и подтверждены метаболические различия на основе возмущений. (180) Будущая работа может показать, можно ли расширить эту платформу до более высокой пропускной способности и более разнообразных типов клеток.

В другом исследовании вместо использования меток абляции MALDI для корегистрации клеточная информация была получена из выбранных каналов MSI (т.е. спектров). Визуализация MALDI-2-MS с высоким разрешением в сочетании с оптической микроскопией позволила провести корегистрацию масс-спектрометрических и оптических данных для сотен совместно культивированных клеток. (181) Это позволило провести статистический анализ гетерогенности клеток на основе индивидуальных масс-спектров, предварительно определив 99 видов липидов, что подчеркивает гетерогенность липидов в разных типах клеток и на разных стадиях развития. Хотя была продемонстрирована сопряженность с маркерами иммунофлюоресценции, в будущем этот метод можно расширить, включив в него биологическую валидацию, такую как специфические возмущения или корреляции с другими sc omics или ортогональными методами.

Дальнейшее применение микроскопического MS для культивируемых клеток продемонстрировало потенциал для анализа редких клеточных популяций и поддержки персонализированной точной медицины. Сочетание sc MALDI-MS с иммуноцитохимической классификацией позволило провести высокопроизводительный анализ более 1800 клеток мозжечка грызунов, выявить липидную гетерогенность между астроцитами и нейронами и определить потенциальные подтипы клеток. (182) В другом примере MALDI-MSI применялся к отсортированным с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) клеткам множественной миеломы (ММ) и нормальным плазматическим клеткам, при этом анализировалось по 16 клеток из каждой группы и было выявлено значительное снижение содержания PC (16:0/20:4) в клетках ММ. (183) Этот метод стабилизировал липидные профили путем фиксации и улучшил разрешение сканирования, объединив MSI и микроскопию и увеличив площадь лазерной абляции. Однако в будущих работах необходимо подтвердить его преимущества перед объемным анализом.

Будущие достижения в области мультимодальной MS диссоциированных клеток могут устранить ряд ключевых ограничений, таких как потеря тканевого контекста и потенциальные метаболические возмущения, возникающие при выделении клеток, а также артефакты, возникающие при культивировании клеток. Также необходимо уменьшить зависимость от фиксации клеток, которая в настоящее время ограничивает применимость метаболомики. Включение контролируемых метаболических возмущений и совершенствование количественных возможностей будут иметь решающее значение для выявления тонких, но биологически значимых различий. В дальнейшем важно сбалансировать эти достижения с достоинствами метода, такими как уменьшение вмешательства соседних клеток, использование ко-культивирования для контролируемых экспериментов и интеграция ортогональных подходов, таких как микроскопия для идентификации клеток, что позволит эффективно использовать методологию для решения конкретных биологических вопросов и гипотез. Примечательно, что обсуждаемые выше стратегии были использованы для повышения пропускной способности и разрешения в МMS тканей и, как ожидается, будут приобретать все большее значение в будущем. (178,184-186)

Достижения в области методов MSI и MMS не были бы столь успешными без соответствующих достижений в области анализа и обработки изображений, а также разработки инновационных методов выделения и построения матрицы (arraying) клеток. Эти усовершенствования способствуют точному нацеливанию, идентификации и сегментации отдельных клеток, что крайне важно для перехода от традиционного применения культуры ткани к более сложным анализам in situ. Например, в исследовании с использованием конического зонда для пневматического нано-DESI были оптимизированы условия для работы с массивами одиночных клеток, что позволило достичь производительности около 3 клеток в минуту. (187) Этот метод также включал оптимизацию условий промывки и анализа, а его проверка была сосредоточена на голодании глюкозы в клетках INS-1 с участием 93 или 97 клеток, демонстрируя его эффективность в обработке изолированных одиночных клеток в конкретных экспериментальных условиях. Аналогичным образом, в другом исследовании была представлена быстрая и чувствительная методика с использованием инфракрасной матричной лазерной десорбционной электрораспылительной масс-спектрометрии (188) (IR-MALDESI-MS) для изучения липидных профилей изолированных клеток Henrietta Lacks (HeLa). С помощью этого подхода удалось идентифицировать 45 различных видов липидов в 34 проанализированных клетках. Ожидается, что интеграция RastirX, управляющего программного обеспечения на базе MATLAB и камеры, связанной с микроскопом, позволит еще больше сократить время сбора данных до менее чем 1 с на клетку, что повысит пропускную способность и общую эффективность липидомикроскопических анализов. (188) Более того, высокопроизводительный подход с использованием рабочего процесса подготовки на основе микрочипов был продемонстрирован в исследовании, в котором анализировался состав липидов и пигментов в отдельных клетках водорослей. Этот метод успешно проанализировал более тысячи отдельных клеток, подчеркнув значительную гетерогенность между ними и продемонстрировав способность MSI эффективно проводить крупномасштабные исследования. (82)

Для решения проблем сегментации и интеграции при визуализации тканей была разработана мультимодальная стратегия MSI, позволяющая сочетать MALDI-MSI с конфокальной визуализацией иммунофлюоресценции. (189) Этот интегративный конвейер объединяет данные MALDI-MSI с конфокальными изображениями, помеченными антителами к плюрипотентности и красителем Hoechst для ядер, что облегчает точное выравнивание и сегментацию. Такое выравнивание позволяет извлекать спектральные количества MALDI на приблизительной клеточной основе, что дает возможность анализировать клеточно-специфические метаболические сигнатуры. Несмотря на некоторое распространение сигнала за пределы сегментированных областей, что свидетельствует о трудностях в достижении точного разрешения, такой подход позволяет получить полный набор данных, пригодный для использования методов многомерного анализа, позволяющих выявить пространственные взаимосвязи метаболизма в данных.

Родственная технология, SpaceM, объединяет сигналы абляции MALDI in situ с сегментацией клеток на основе флуоресценции, что позволяет проводить ко-регистрацию сигналов и быстрый автоматизированный анализ отдельных или смешанных клеточных популяций. (135) Хотя этот подход обеспечивал высокую пропускную способность, совместная выборка соседних клеток потенциально затушевывала тонкие различия и снижала точность количественного анализа. Позднее эти недостатки были устранены (185,190), а в будущих работах можно будет использовать изотопом меченные внутренние стандарты для устранения потенциальных различий в эффективности ионизации между типами клеток, что повысит точность количественного анализа.

Еще один инновационный подход к сегментации МMS использует глубокое обучение для изменения цикла «проектирование-строительство-тестирование-обучение» (DBTL): RespectM (85), основанный на прерывистой масс-спектрометрической визуализации, позволяет обнаружить более 700 метаболитов (в основном липидов) со скоростью 500 клеток в час (получая 4 321 точку данных метаболомики на уровне sc). RespectM отличал отдельные микробные клетки от пустой матрицы с точностью 98,4 %. (191) Этот метод также позволяет классифицировать отдельные клетки Chlamydomonas reinhardtii среди аллельных штаммов. Используя в дальнейшем лазерное травление капельного микрочипа (LEM), сублимацию матрицы 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) и создание матрицы с разреженными данными, исследователи улучшили дискриминацию сигнальных клеток и проблемы генерации пиков по сравнению с традиционными подходами на основе MALDI. Для решения проблемы перекрестного загрязнения между соседними растрами, которое снижает достоверность данных MSI - явление, усугубляемое малым размером микробных клеток, - исследователи использовали функцию прерывистого получения MSI в системе гибкой визуализации Bruker. Будет важно проследить за ходом этого исследования и выяснить, влияет ли применение матрицы на метаболомы отдельных клеток и точность количественных данных.

Достижения в области методов MSI и MMS продолжают совершенствовать нашу способность наблюдать и анализировать метаболическую неоднородность в сложных тканевых средах с разрешением, близким к sc. Несмотря на высокое разрешение ниже размера sc, эти методы все еще должны бороться со сложной 3D-архитектурой тканей, и потребуются дальнейшие достижения в области интеллектуальной сегментации. Например, хотя SpaceM, метод метаболомики in situ sc, является мощным и эффективным для картирования пиксель за пикселем корреляций метаболических целей в цитозольных границах больших клеток в культурах, он сталкивается с проблемами разрешения при применении к срезам тканей. (135) Метод пространственной одноядерной метаболомики SEAM использует ядерные регионы в качестве сегментации для исследования ядерного метаболомного профиля в естественной тканевой среде. Хотя SEAM позволяет проводить субмикронное картирование метаболитов в клетках и тканях, он извлекает преимущественно ядерные паттерны, оставляя ассоциацию конкретных типов клеток с метаболическими профилями менее определенной и упуская более широкие цитозольные границы. (192)

Достижения в области метаболомики MSI sc позволили интегрировать ее с другими омическими технологиями. Включение этих деталей позволяет связать ферментативную активность и клеточную идентичность с метаболическими изменениями, углубляя понимание биохимических процессов и их влияния на здоровье и болезнь.

Недавнее исследование, объединяющее sc MALDI-MSI и Visium 10x RNAseq, демонстрирует силу этих корреляционных измерений, хотя и не строго на уровне sc. Несмотря на то что исследование в первую очередь было посвящено специфическим для рака изменениям в образцах человека, оно успешно продемонстрировало потенциал MSI для корреляции изменений продуктов, субстратов и ферментов, подчеркивая полезность интеграции различных омических подходов. (193) Это шаг вперед в использовании MSI для комплексного биологического анализа.

Дальнейшие успехи были достигнуты благодаря сочетанию MALDI-MSI с иммунофлуоресцентной микроскопией, что позволило повысить пространственное разрешение внутри тканей. Этот подход позволил точно отобразить метаболические изменения в тканях и использовать Spatial Coherence Measure (SCM), чтобы отличить реальные пространственные паттерны от шума в распределении ионов, что повысило надежность пространственной метаболомики. Стратегия маркировки антителами позволила выявить различные типы клеток, обеспечив гистологическую структуру, основанную на дополнительных данных о распределении метаболитов. (194) Однако исключение нормализации матричного эффекта в этом анализе указывает на необходимость будущих проверок для подтверждения индивидуальных метаболических изменений.

Система пространственно-разрешенного метаболизма одиночных клеток (scSpaMet) представляет собой значительную инновацию, объединяя не-целевую пространственную метаболомику с целевой мультиплексной визуализацией белков для профилирования одиночных иммунных и раковых клеток в тканях человека. Разработанный на основе обширной платформы для анализа изображений и интеграции омических технологий, этот подход использует совместное встраивание на основе глубокого обучения для выявления уникальных состояний метаболитов внутри типов клеток и локальной конкуренции метаболитов между соседними одиночными клетками. Включая трехмерное пространственно разрешенное метаболомное профилирование (3D-SMF) для метаболической визуализации с субмикронным разрешением и мультиплексную протеомную визуализацию IMC, scSpaMet коррелирует с более 200 метаболических маркеров с 25 белковыми маркерами в отдельных клетках в нативных тканях, демонстрируя свою эффективность в различных переполненных тканях человека. (184) Несмотря на ограничения, связанные с жесткой подготовкой образцов и инвазивным характером анализа метаболитов, эта система может стать мощным инструментом для понимания клеточно-специфических метаболических профилей и их влияния на гетерогенность тканей и заболевания.

Выходя за рамки этих отдельных участков ткани или изолированных культивированных клеток, 3D-SMF, первоначально представленный Ganesh, S. et al., повысил специфичность клеток, используя библиотеку антител с изотопной меткой для маркировки тканей миндалин, которые затем пространственно коррелировали и классифицировались в трех измерениях. (195) Аналогичным образом, масс-спектрометрия фотоионизации при инфракрасной лазерной абляции при атмосферном давлении (196) (LAAPPIMS) показала многообещающий потенциал для анализа профилей глубины. Эта методика позволила достичь латерального разрешения 70 µм, что дало возможность детально проанализировать субструктуры листьев Arabidopsis thaliana на разных уровнях листовой ткани. LAAPPIMS эффективно картирует аналиты на разных глубинах, отчетливо выделяя верхние трихомы и слой кутикулярного воска из нижележащих тканей и выявляя различное распределение метаболитов по различным частям листа, таким как жилки, кутикула и трихомы. (197) Однако остаются и недостатки, поскольку сигналы LAAPPIMS могут меняться из-за подавления ионов и характера поверхности образца, что может привести к потере количественной точности и снижению воспроизводимости, что крайне важно для правильной биологической интерпретации. Тем не менее, эти достижения в совокупности расширяют сферу применения MSI от простого анализа поверхности до комплексного трехмерного исследования метаболических функций внутри и между типами клеток.

Общие инновации в sc MSI подчеркивают широту технологических достижений, каждое из которых адаптировано к уникальным приложениям. Однако, несмотря на то, что эти инновации расширили возможности sc-метаболомики, они часто сталкиваются с такими проблемами, как отсутствие адекватного контроля для сохранения метаболических состояний или присутствия загрязняющих веществ, возникающих при подготовке образцов или вмешательстве соседних клеток или внеклеточного матрикса. Кроме того, эффекты матрицы, влияющие на количественную оценку и аннотацию, требуют дальнейшей оценки. Нам нужны стратегии подтверждения результатов MSI с использованием ортогональных методов (как обсуждается в разделе 6), нормализационных контролей и дальнейших знаний, полученных в результате интеграции мультиомики. Например, влияние матрицы в таких методах, как MALDI, может быть подтверждено для отдельных метаболитов с помощью 13C-меченых стандартов, введенных в матрицу. (93) В настоящее время мы не имеем четкого представления об ограничениях новых технологий. Это подчеркивает необходимость совершенствования стандартизированных стратегий для обеспечения количественной точности.

Выделение и экстракция sc имеют решающее значение для метаболомических исследований, о чем подробно говорится в недавних обзорах. (101,198) Вдохновляясь видеомикроскопией в реальном времени, патч-клампингом или отбором проб из капилляров, которые позволяют исследовать клеточные функции неинвазивно с высокой точностью и в течение длительного времени, было разработано несколько методов, позволяющих отбирать пробы цитоплазмы или клеточных компонентов и напрямую вводить их в масс-спектрометр. (42,45,47,50-53,55,56,58,60,199-202) Клеточные компоненты могут быть извлечены in situ в наконечник наноэлектроспрея или с помощью зонда или капилляра. Эти методы, хотя и были новаторскими, первоначально были ограничены низкой пропускной способностью.

Усилия по улучшению масштабируемости привели к появлению более автоматизированных и высокопроизводительных методов. Например, метод компьютерной микроскопической изоляции (CAMI) объединил визуализацию, машинное обучение и высокопроизводительную микроскопию, чтобы направлять извлечение клеток с помощью лазерной микродиссекции или микроманипуляции. (123) Улучшение пропускной способности при анализе сотен клеток было многообещающим, но в будущем, вероятно, потребуется увеличение на порядок, чтобы сравниться с другими омическими приложениями. Аналогичным образом, миниатюрная пиколитровая система экстракции обеспечивает автоматизированную подготовку проб для sc MS-анализа и может послужить вдохновением для будущих улучшений, выходящих за рамки текущих 20 клеток в час. (203)

Методы, использующие электромиграцию и микроаспирацию, также были разработаны для лучшего сохранения метаболической целостности. В одном из исследований для комплексного определения метаболитов использовалась калиброванная микроаспирация эмбрионов Xenopus laevis (204), а в более позднем исследовании эта стратегия была продемонстрирована на отдельных дрожжевых клетках, а электромиграция и электропорация использовались для выделения содержимого клеток в герметичный объем для анализа с помощью nanoESI. (205) Подход, использованный в данном исследовании, дает преимущества в пропускной способности и чувствительности, когда отдельные клетки можно легко получить в суспензии. Однако потребуются дополнительные соображения, чтобы перенести этот подход на системы млекопитающих, у которых во время процедуры могут происходить метаболические изменения.

В заключение следует отметить, что, хотя эти достижения в области методов выделения и экстракции клеток открывают многообещающие возможности для исследований в области метаболомики, они подчеркивают постоянную необходимость решения проблем, связанных с ограничением производительности и сохранением целостности метаболома. Следует отметить, что методы прямого отбора проб дают значительное преимущество по сравнению с выделением sc поскольку сводят к минимуму попадание внешних загрязняющих веществ и обеспечивают лучший контроль над сигналами, не присущими клеткам. Тем не менее, эти факторы все равно должны тщательно контролироваться.

Микрофлюидика стала важнейшим инструментом для развития метаболомики, обеспечивая непревзойденную точность при выделении и анализе отдельных клеток. Недавние инновации, такие как контролируемая печать клеток (206) и микрофлюидические чипы с microwell массивами (207,208), значительно улучшили высокопроизводительный мониторинг и быстрый химический лизис отдельных клеток, соответственно. В обзорах также подчеркивается растущая роль микрофлюидики в метаболомике, что подчеркивает ее потенциал для революции в этой области. (209-211)

Чтобы обеспечить высокоточное выделение sc для профилирования метаболитов, была разработана технология принтера sc в сочетании с жидкостным вихревым захватом-MS (SCP-LVC-MS). Эта технология позволяет выделять капли sc для точного химического анализа. (212) Подход SCP-LVC-MS был подтвержден анализом липидного состава клеток Chlamydomonas reinhardtii, Euglena gracilis и HeLa в их родной среде. Метод успешно идентифицировал различные липиды в отдельных клетках и обеспечил отсутствие переноса сигнала между клетками. Он позволил дифференцировать смешанные клетки микроводорослей по уровню содержания липидов. Результаты были подтверждены сравнением количественных площадей пиков с объемными экстрактами липидов и показали четкие различия в клеточных популяциях в условиях ограниченного и нормального роста. Кроме того, количественный анализ был уточнен с использованием внутреннего стандарта, и расширение этой стратегии для включения большего количества химических веществ (213) или более широкого диапазона стандартов и биологических условий позволит надежно подтвердить ее применимость к анализу sc.

Интегрированные микрофлюидные чипы могут предложить комплексный подход, обеспечивая мультиплексную и автоматизированную обработку для мультиомических приложений. В качестве примера можно привести систему, разработанную для комплексной протеомной подготовки проб в сочетании с (214) DIA. Хотя эта система может столкнуться с проблемами, связанными с пропускной способностью и потерей образцов, и требует дальнейшей проверки для метаболомики. Другие микрофлюидические системы на основе капель продемонстрировали успех в точной инкапсуляции отдельных клеток и снижении загрязнения. (215) Однако их эффективность в устранении не-биологических загрязнений еще не полностью подтверждена. В другом методе на основе капель использовалась сфокусированная жидкость оболочки для выравнивания клеток по направлению к стыку капель, где они инкапсулировались и характеризовались флуоресцентными сигналами. Этот метод продемонстрировал потенциал для будущего применения в сочетании с модулем селективной изоляции на основе электрокоалесценции. (216)

Высокоточные микрофлюидические системы позволили изолировать отдельные растительные клетки с исключительной точностью. Например, микрофлюидический робот для сбора клеток был использован для выделения протопластов из Catharanthus roseus, что позволило провести целевой и не-целевой метаболомный анализ с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (UPLC-MS), проанализировав 586 клеток. (217) Этот подход не только обеспечил многообещающую пропускную способность, но и продемонстрировал абсолютное количественное определение метаболитов. Последующий анализ показал вариабельность между различными растительными тканями, хотя в нем не учитывались матричные эффекты и подавление ионов. (218)

Интеграция микрофлюидных технологий с технологиями визуализации также позволила анализировать пространственно-временную гетерогенность опухоли. Объединив ультразвуковую эластографию с масс-спектрометрической визуализацией (UEg-MSI), исследователи смогли составить карту метаболических изменений в опухолях как in vivo, так и in vitro, обеспечив подробный профиль стадий опухолевого генеза. (219) В другом исследовании для анализа первичных клеток печени мышей, стимулированных этанолом, использовалось микрофлюидное устройство на основе многоцветной флуоресцентной детекции (MFD-MD). Эта система эффективно разделяла клетки и измеряла такие метаболиты, как перекись водорода, глутатион и цистеин, выявляя значительную клеточную гетерогенность. Эти чувствительные к окислительно-восстановительным процессам молекулы имеют решающее значение для оценки метаболического состояния отдельных клеток и служат потенциальными ориентирами для будущих более масштабных измерений метаболомики на основе MS.

Эти достижения в области микрофлюидики открывают возможности для точного манипулирования и анализа сканов, позволяя получить бесценные сведения о клеточных метаболических процессах. Интеграция этих методов с дальнейшими достижениями в области MS-ионизации и детектирования остается сложной задачей. Кроме того, для повышения эффективности этих технологий в метаболомике sc требуется дальнейшее изучение влияния различных материалов устройств на определяемые метаболиты и их интерференции с количественными результатами. Тем не менее, микрофлюидные технологии способны обеспечить высокоэффективную и выгодную систему выделения клеток, которая будет быстрой, щадящей и интегрируемой с другими омическими технологиями. Клетки можно поддерживать в подходящих условиях роста на протяжении всего процесса выделения, вплоть до короткой промывки и экстракции, что позволяет оптимально сохранить исходные метаболические состояния.

Только благодаря применению sc-технологий можно захватить и охарактеризовать редкие клетки, такие как раковые стволовые клетки, которые могут иметь решающее значение для метастатического потенциала и лекарственной устойчивости. Достижения в области метаболомики с помощью sc-технологий позволили получить ценные сведения о метаболической гетерогенности в опухолях, что улучшает наше понимание опухолевого генеза, прогрессии опухоли и резистентности к лечению (рис. 4). Читатели, заинтересованные в более полном обсуждении лекарственной устойчивости опухолей, метаболомики и гетерогенности опухолей, могут обратиться к недавним обзорным статьям. (220-222)



Figure 4. Schematic representation of metabolic heterogeneity within tumors. This diagram highlights key aspects of tumor heterogeneity influenced by metabolic states at the sc level: 1. Drug resistance, illustrating how variations in metabolic state translate to varying response to therapy; 2. Proliferation rates, illustrating how metabolic states dictate proliferation rates; 3. Metastatic potential, illustrating how tumor cells in organs like the brain or liver exhibit distinct metabolic profiles; 4. Immune response, illustrating pathways of immune evasion and cell death that arise from differences in metabolic states within cancer cells. Each cluster represents distinct cellular populations (depicted as different colors) within a tumor, emphasizing the complexity of interactions and behaviors influenced by metabolic states at the sc level.

Метод MSI превратился в важный инструмент в онкологии, позволяющий выявить метаболическое разнообразие внутри опухолей и определить значительные метаболические различия между типами и регионами опухолей. Например, такие методы, как MALDI-MSI высокого разрешения, позволили стратифицировать пациентов с раком желудка и выделить подтипы не-мелкоклеточного рака легкого (NSCLC) путем выявления специфических липидных и метаболических профилей. Они выявили метаболические изменения между раковыми тканями и окружающей стромой, продемонстрировав потенциал MSI для выявления временной и пространственной гетерогенности опухоли. (221,223-225) Пространственный анализ MSI в глиобластоме, например, выявил различия в уровнях антиоксидантов и энергетических потребностей между ядрами опухоли и перитуморальными областями. (225) Аналогичным образом, масс-цитометрия с визуализацией позволила получить представление об архитектуре опухоли и иммунных клеток в диффузной крупноклеточной В-лимфоме, соотнеся клеточные структуры с реакцией на химиотерапию (226), а DESI-MSI успешно дифференцировал типы тканей рака молочной железы, связав степень опухоли и статус гормональных рецепторов с различными метаболическими профилями. (227)

Новая методология расширила возможности MSI для мультиомического подхода к биологии опухолей. В исследовании использовалась water gas cluster ion beam secondary ion mass spectrometry (228) ((H₂O)n-GCIB-SIMS) для комплексного липидо- и метаболомного профилирования замороженных гидратированных срезов ткани. (229) Этот подход позволил впоследствии профилировать клеточно-специфические лантанидные антитела с помощью C60-SIMS с разрешением 1,1µм для дифференциации типов клеток. Этот подход выявил отчетливые вариации в распределении и интенсивности более 150 ключевых ионов, включая липиды и важные метаболиты, в различных типах клеток опухолевого микроокружения (TME), таких как активно пролиферирующие опухолевые клетки и инфильтрирующие иммунные клетки. (229) Благодаря интеграции мультиомического профилирования, объединяющего липидомические, метаболомные и протеомные данные, этот метод позволил получить более целостное представление о TME. Хотя он не позволил достичь сегментации отдельных клеток, он продемонстрировал возможность использования визуализации SIMS для интеграции мультиомического профилирования в контексте сложной клеточной мозаики, предлагая ценные сведения о клеточной гетерогенности TME’s.

Хотя в метаболомике опухолей для выяснения биологии опухолей основное внимание уделяется методам масс-спектрометрии с визуализацией, значительные успехи достигаются и в методах MS без визуализации, что расширяет возможности метаболического профилирования на уровне sc опухолей.

Для изучения механизмов действия лекарственных препаратов в клетках NSCLC, обработанных gefitinib, был использован новый подход, получивший название sc-метаболомика с помощью электропусковой ионизационной масс-спектрометрии в интактных живых клетках (sMDA-scM ILCEI-MS). Этот метод выявил две различные субпопуляции клеток, демонстрирующих дифференцированный метаболический ответ на лечение. (125) Было проанализировано значительное количество клеток в различных концентрациях, что продемонстрировало способность ILCEI-MS фиксировать тонкие метаболические сдвиги в отдельных клетках в ответ на фармакологические вмешательства и при соответствующих объемах.

Дальнейший прогресс в технологии ионизации привел к разработке нового концентрического гибридного источника ионизации, сочетающего наноэлектроспрей и химическую ионизацию при атмосферном давлении (nanoESI-APCI). Эта методика позволила значительно улучшить обнаружение как полярных, так и неполярных метаболитов одновременно в одиночных клетках, повысив предел обнаружения на порядок до 10 pg mL^-1. Метод был применен для исследования метаболической гетерогенности в тканевом микроокружении гепатоцеллюлярной карциномы человека. (84) Он облегчил различение типов и подтипов раковых клеток и позволил изучить метаболические нарушения, вызванные голоданием по глюкозе в клетках MCF7, а также метаболическую регуляцию в стволовых клетках рака. Исследование показало, что метаболические последствия глюкозного голодания были сопоставимы с теми, которые наблюдались между различными типами клеток, что подчеркивает глубокое влияние метаболических условий на состояние клеток.

Эти методы MS, не основанные на визуализации, вносят уникальный вклад в биологию опухолей, позволяя проводить детальное метаболическое профилирование без необходимости пространственного картирования, тем самым обеспечивая дополнительные сведения, которые имеют решающее значение для всестороннего понимания клеточного метаболизма. Однако такая техника будет в большей степени опираться на интегрированную омику, поскольку метаболическую гетерогенность необходимо рассматривать в контексте типов клеток и транскрипционных состояний.

Транскриптомика и протеомика sc свидетельствуют о значительной метаболической гетерогенности различных типов рака. Будущие разработки могут объединить эти данные с прямыми метаболическими показаниями, которые особенно хорошо подходят для фиксации переходных клеточных состояний, проявляющихся в таких условиях, как воздействие лекарств.

Исследования, посвященные гетерогенности при прогрессировании опухоли, показали, что транскрипционная гетерогенность увеличивается по мере прогрессирования опухоли и метастазирования и связана с метаболическими состояниями. При раке молочной железы секвенирование РНК выявило различные транскрипционные программы, связанные с метастазированием, в основном обусловленные измененными метаболических путей. (230) Исследование клеток меланомы показало, что фенотипическая гетерогенность и изменения в экспрессии генов тесно связаны с эпигенетической регуляцией. (231) В этом контексте прямые метаболические измерения приобретают решающее значение. Так, при раке молочной железы метаболическая гетерогенность в таких процессах, как гликолиз, глюконеогенез и синтез жирных кислот, была связана с устойчивостью к химиотерапии. (232)

При изучении гетерогенности между различными опухолями у разных пациентов комплексные мультиомические исследования показали значительную клеточную гетерогенность. Например, исследование гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) выявило существенные различия в метаболической и иммунной активности пациентов, что подчеркивает необходимость разработки персонализированных стратегий лечения. (233) Аналогичным образом, в исследовании рака желудка были выявлены корреляции между различными метаболическими подтипами и уровнем иммунной инфильтрации, что дает ценные сведения для разработки индивидуальных терапевтических подходов. (234)

При изучении пространственной гетерогенности sc-транскриптомика олигодендроглиом выявила значительные метаболические различия между регионами опухоли, что подчеркивает важнейшую роль пространственного анализа в понимании метаболического разнообразия. (235) Кроме того, исследование рака простаты, в котором sc-транскриптомика сочеталась с анализом метаболических путей, выявило вариации метаболической активности в различных типах клеток, на которые в значительной степени влияет функция митохондрий, что свидетельствует об обширной пространственной гетерогенности и внутриклеточной изменчивости. (236)

Эти и другие недавние сообщения (3,222,237,238) подчеркивают важность будущих последующих оценочных исследований с использованием специализированного метаболомического анализа, который может прояснить механизмы регуляции отдельных биохимических путей и ферментов. Это может помочь выявить конкретные, целенаправленные метаболические уязвимости, что потенциально приведет к созданию более эффективных, адаптированных противораковых методов лечения.

Недавние достижения в области метаболомики sc дают важнейшие сведения, выходящие за рамки биологии опухолей, позволяя нам лучше понять метаболическую гетерогенность в пространственно-временных измерениях и при заболеваниях, имеющих отношение к человеку, или при нормальной физиологии (рис. 1).

Развитие организмов регулируется жестко регламентированными процессами клеточной пролиферации и дифференциации, направляемыми сложными геномными и экологическими сигналами. Sc-метаболомика становится ключевым инструментом для изучения этих сложных процессов, позволяя понять метаболическую перестройку и молекулярные механизмы во время эмбрионального развития у разных видов. Например, исследования на Xenopus laevis выявили значительную метаболическую гетерогенность на критических стадиях развития, продемонстрировав широкую применимость и важность sc-подхода в биологии развития. (44,201,239,240)

Синдром Leigh (LS) - тяжелое неврологическое заболевание, характеризующееся прогрессирующей дегенерацией центральной нервной системы, обычно проявляющееся в младенчестве такими симптомами, как задержка развития, судороги и регресс двигательных навыков, и вызванное генетическими мутациями, влияющими на производство клеточной энергии, а точнее, тяжелым митохондриальным заболеванием. (241) Было высказано предположение, что метаболические факторы могут непосредственно регулировать это и связанные с ним расстройства. (242,243) Последовательное секвенирование scRNA и мультиомические анализы в органоидах человека продемонстрировали нарушение морфогенеза нейронов в нейрональных клетках предшественниках (NPCs). Эти клетки остаются в гликолитическом пролиферативном состоянии, препятствуя надлежащей дифференцировке нейронов. (244) Было показано, что метаболизм регулирует формирование, миграцию и дифференцировку NPCs. (245-247) Были выявлены два основных биоэнергетических сдвига (248-251), и нарушения в этих переходах были связаны с неврологическими расстройствами. (242) Аналогичным образом, исследования с использованием высокопроизводительного секвенирования в HCC выявили значительные метаболические различия между линиями и стадиями дифференцировки гемопоэтических клеток. Кроме того, пути транспорта и метаболизма глюкозы продемонстрировали значительные различия, хотя в исследовании не применялся непосредственно sc-анализ. (252) В настоящее время эта область готова к непосредственному изучению метаболомики, которая обеспечит точное измерение измененных метаболических состояний и выявит ключевые пути, на которые можно будет направить воздействие, чтобы модулировать болезнь.

Нефрогенез, процесс формирования почки, включает в себя значительный метаболический переход от гликолиза к окислению жирных кислот. (253) В этой связи MALDI-MSI и scRNA-seq анализы выявили метаболические траектории судьбы клеток во время дифференцировки почек, что позволило понять пространственно-временную динамику метаболизма. (254) Исследователи распространили эти результаты на клетки in vitro, что позволило им манипулировать метаболическими путями для лучшего понимания дифференцировки стволовых клеток.

В исследованиях нейроразвития сочетание электрофизиологии с использованием патч-зажима и капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии (CE-MS) позволило соотнести физиологическую активность нейронов с их нейрохимическим состоянием. Это исследование выявило поразительную межклеточную гетерогенность метаболомов нейронов и представило подход, применимый к более широкому спектру мелких типов клеток. (255)

В исследованиях травм мозга пространственная транскриптомика и метаболомика в образцах тканей человеческого мозга выявила молекулярные маркеры метаболических изменений, а области перекисного окисления липидов указывали на поврежденные нейроны. (256) Этот комплексный подход объединил пространственную транскриптомику с MSI для детального анализа. Эти усилия могут привести к разработке малых молекул, эффективных для лечения травм мозга, что дает преимущества перед генетическими манипуляциями, которые сложнее реализовать в клинических условиях.

При дальнейшем изучении клеточной гетерогенности недавние достижения в области сканирования и пространственных технологий позволили получить глубокое представление о клеточном разнообразии и состоянии метаболизма в различных тканях. Новый метод SEAM объединил масс-спектрометрию с высоким пространственным разрешением и вычислительные алгоритмы для проведения широкомасштабной и многоцветной томографии тканей. Этот подход позволил успешно выявить субпопуляции гепатоцитов с различными метаболическими особенностями, связанными с их близостью к фиброзным нишам. (192) Полученные результаты были подкреплены пространственной транскриптомикой с помощью Geo-seq, что позволило лучше понять микросреду ткани на уровне одного ядра. Безметочная методика SEAM, требующая минимальной подготовки эксперимента, сохраняла нативное состояние образцов и обеспечивала значительную пропускную способность. Однако идентификация конкретных типов клеток зависела от последующей иммунофлуоресценции, что усложняло дифференциацию клеточных кластеров. Тем не менее, этот метод показал, что подмножество клеток (14,4 %) демонстрирует неизменные пути глутатиона, что не видно при массовом анализе, но различимо при использовании sc-подходов.

Продолжая изучать метаболическую гетерогенность, связанную со старением, исследователи использовали комбинацию пространственной транскриптомики, sc-анализа транспозазно-доступного хроматина (ATAC)-seq и RNA-seq наряду с липидомикой и функциональными анализами для изучения возрастных изменений в мужской мышиной печени. (257) Этот комплексный подход позволил выявить специфические для каждой зоны и возраста изменения в метаболических состояниях, эпигенетике и транскриптомике. В функциональном плане было обнаружено, что перипортальные гепатоциты демонстрируют сниженный митохондриальный фитнес, а перицентральные гепатоциты накапливают значительное количество липидных капель, что указывает на различные метаболические адаптации к старению в печени. Эти результаты подчеркивают ключевую роль интеграции методов мультиомики для раскрытия сложных взаимодействий в тканях.

Sc-технологии открывают новые перспективы для исследований старения. (258) Например, биоинформационный анализ данных sc-транскриптомики выявил нарушение антиоксидантной сигнализации в клетках яичников приматов как отличительную черту старения яичников. (259) Дальнейшие исследования показали, что в стареющих легких происходит регуляция провоспалительных путей и снижение функции митохондрий, что предполагает возможность вмешательства для решения проблем, связанных со старением. (260) В контексте старения расширение исследований метаболомики в дополнение к другим методам может иметь дополнительное преимущество, указывая на конкретные пути, которые поддаются вмешательству, например, восстановлению окислительно-восстановительного состояния (261) или добавлению определенных питательных веществ. Такие подходы могут выйти за рамки существующих широких рекомендаций, таких как ограничение калорий и физические упражнения. (262)

Хотя некоторые исследования еще не применяли sc-метаболомику напрямую, они служат путеводной звездой для будущих исследований. Дальнейшая интеграция этих методов с sc-метаболомикой обещает расширить наше понимание временных и пространственных гетерогенностей при различных заболеваниях, открывая путь к инновационным подходам к лечению.

Такие технологии, как позитронно-эмиссионная томография (PET), магнитно-резонансная томография (MRI) и рамановская визуализация, позволяют выявлять метаболические гетерогенности на клеточном или организменном уровне и значительно улучшают понимание различных заболеваний. (263-266) Эти и другие технологии, основанные на флуоресценции, различаются по разрешению: некоторые из них позволяют визуализировать метаболические процессы на уровне отдельных участков, в то время как другие дают более широкое пространственное представление. Кроме того, эти методы не требуют особой подготовки образца и могут быть выполнены неинвазивно и неразрушающе. Самое главное, что эти методы представляют собой ортогональные подходы к метаболомике sc, поскольку они не страдают от одинаковых технических проблем и ограничений. Ниже приводится несколько исследований в качестве примеров того, что могут предложить эти технологии. Для более полного обзора читатели могут обратиться к недавним всеобъемлющим обзорам. (263-266)

Методы визуализации, не связанные с MS, дополняют метаболические исследования. (267) Например, был разработан альтернативный подход к прямому измерению концентраций метаболитов для визуализации и количественной оценки множества ферментативных активностей в естественной тканевой среде. Используя простой флуоресцентный микроскоп, этот метод измерял ферментативную активность при насыщении субстратом, а типы клеток идентифицировались с помощью стандартных иммунофлуоресцентных методов. (268) Чувствительная к окислительно-восстановительным реакциям соль тетразолия, нитросиний тетразолий хлорид (NBT), служила в качестве реагента для обнаружения образования продуктов пяти дегидрогеназ с течением времени. Эта методика позволила проанализировать метаболические взаимодействия между раковыми клетками и ассоциированными с раком фибробластами в массиве тканей рака молочной железы. Таким образом, можно получить представление о клеточных метаболических взаимоотношениях отдельных клеток в их естественном контексте. Схожая методика - оптическая визуализация с использованием флуоресцентных репортеров метаболизма - позволяет отслеживать метаболическое перепрограммирование в остаточном раке молочной железы, выявляя повышенную метаболическую гибкость и гетерогенность при персистирующем заболевании. (269) Состояние метаболизма можно также оценить, используя fluorescence lifetimes (FLIM) внутренних метаболических кофакторов, таких как NAD(P)H и FAD. (270) Эти кофакторы демонстрируют различное время жизни флуоресценции в зависимости от их связанного (фермент-ассоциированного) или несвязанного состояния, что отражает их участие в метаболических реакциях. Например, FLIM NAD(P)H и FAD позволил выявить метаболическую гетерогенность иммунных и опухолевых клеток меланомы, что позволило получить важнейшие сведения о метаболизме с высоким разрешением. (271)

Для мониторинга соединений, которые не флуоресцируют, оптическая фототермическая инфракрасная визуализация (O-PTIR) может предоставить прямую информацию о химическом составе на основе IR-поглощения. O-PTIR, примененная к популяциям бактерий, была использована для анализа фенотипической гетерогенности. При мониторинге производства поли-3-гидроксибутирата (PHB) в штаммах Bacillus Bioplastic, O-PTIR обеспечил биохимический анализ в масштабе, который имеет решающее значение для промышленных приложений биопереработки, где субпопуляции неэффективных клеток-продуцентов могут влиять на производительность. (272) Аналогичным образом, электрохимические методы позволяют проводить мониторинг окислительно-восстановительных метаболитов путем настройки биосенсорных интерфейсов на поверхности электродов для исследования широкого спектра окислительно-восстановительных соединений. Например, методология дыхания на основе OptoElecWell стала компактной альтернативой широко используемому анализатору Seahorse XF (регистрирующему скорость дыхания и потребление глюкозы), позволяя анализировать метаболизм дрожжей с использованием в 20 раз меньшего количества образцов и адаптируясь к одиночным клеткам. Эта платформа объединила платиновый нано-электрод для электрохимии in situ с визуализацией живых клеток с высоким разрешением, что позволило одновременно анализировать базовое дыхание и внутриклеточные параметры при различных концентрациях глюкозы. (207)

Дальнейшее развитие технологий визуализации без меток значительно обогатило метаболомику, позволяя с высоким разрешением изучать состояние клеточного метаболизма без использования внешних маркеров. В данном случае передовым примером является стимулированное комбинационное рассеяние (SRS). Рамановская спектроскопия - это неразрушающий метод изучения клеточного метаболизма с субклеточным пространственным разрешением.

С помощью SRS-изображения были детально изучены метаболические профили отдельных клеток при стрессе при раке поджелудочной железы, выявлены богатые липидами выпячивания, которые подчеркивают сдвиги в метаболизме при неблагоприятных условиях. (273) Конфокальная рамановская спектроскопия была использована для количественного определения биомолекул в клеточных линиях NPC, создав метаболическую карту, которая подтверждает результаты, полученные с помощью UPLC-MS/MS. Способность этой методики классифицировать рак и здоровую ткань с помощью моделей машинного обучения демонстрирует ее пропускную способность и широту применения. (274) Raman с изотопным зондированием дейтерия (Raman-DIP) и поверхностно-усиленное рамановское рассеяние (SERS) в рамках микрофлюидной платформы были использованы для изучения бактериального метаболизма и мультиплексного анализа метаболитов на уровне микроорганизмов. Raman-DIP позволил выявить метаболические адаптации Salmonella Typhi внутри клеток человека-хозяина, что подчеркивает его потенциал для выявления метаболических изменений и гетерогенности в ответ на бактериальные патогены. (275) Между тем, SERS-микрофлюидный подход использовал магнитные SERS-подложки для анализа таких метаболитов, как пируват, АТФ и лактат из отдельных клеток, выявляя метаболическую гетерогенность, связанную с плотностью клеток и межклеточным взаимодействием, подчеркивая динамическую природу клеточной метаболомики. (276)

Другой подход, не требующий меток, основан на генетически закодированных форстеровских датчиках резонансного переноса энергии (FRET), которые позволяют проводить метаболический анализ в режиме реального времени на уровне клеток и субклеток. Эти сенсоры обычно состоят из бактериального связывающего белка, соединенного с одним или несколькими флуоресцентных белков. При связывании специфического метаболита бактериальный белок претерпевает конформационные изменения, которые изменяют флуоресцентные свойства сенсора. Сенсоры на основе FRET, в которых используются два флуоресцентных белка, обладают тем преимуществом, что они являются ратиометрическими, что делает измерения менее чувствительными к концентрации сенсора, изменениям объема и незначительным смещениям фокуса по сравнению с сенсорами с одним флуорофором (277).

Было разработано несколько датчиков на основе FRET для обнаружения ключевых метаболитов, включая АТФ, глюкозу, NADH, глутамат, пируват и лактат. Датчик АТФ Perceval, созданный на основе круговой перестановки GFP и бактериального регуляторного белка GlnK1, позволяет в реальном времени отслеживать соотношение АТФ в живых клетках, фиксируя динамику клеточной энергии. (278) Аналогично, датчик глюкозы, FLIPglu-170n, использует бактериальный глюкозо/галактозо-связывающий белок и демонстрирует способность измерять внутриклеточную концентрацию глюкозы в ответ на изменения внешнего снабжения и мутации транспортеров. (279,280) Сенсоры NADH, такие как Peredox, были разработаны для определения соотношения NADH/NAD (+), что дает представление о клеточных окислительно-восстановительных состояниях, особенно в ответ на метаболизм глюкозы и активность электронно-транспортной цепи. (281,282) Эти датчики позволяют проводить количественные измерения в живых клетках и субклеточных компартментах. Аналогичным образом, сенсор FLIPE для глутамата измеряет уровень внеклеточного глутамата, что позволяет проводить мониторинг в реальном времени в живых клетках, включая нейроны. (283) Кроме того, были разработаны сенсоры на основе FRET для пирувата и лактата. Датчик пирувата был создан для мониторинга транспорта, производства и потребления пирувата митохондриями в отдельных клетках с высоким временным разрешением, что особенно полезно для изучения динамики метаболизма нейронов. (284) Для лактата датчик Laconic различает лактат-продуцирующие и лактат-потребляющие клетки, а другой датчик лактата/пирувата, Lapronic, нацелен на митохондриальный матрикс для оценки метаболических потоков. (285,286) Эти датчики предоставляют ценные данные о регуляции метаболизма на клеточном уровне.

Хотя эти технологии позволяют получить уникальные сведения о клеточном метаболизме, они ограничены небольшим числом метаболитов, которые они могут анализировать. Например, FLIM в значительной степени зависит от флуоресцентной активности аналитов. Датчики на основе FRET также ограничены временем, необходимым для разработки и определения характеристик каждого датчика, а также потенциальными помехами от автофлуоресценции и таких факторов, как pH. Рамановская спектроскопия, несмотря на свою способность обнаруживать сигналы от различных химических классов, часто испытывает трудности с точной аннотацией отдельных метаболитов. Тем не менее, эти методы могут дать целостное представление о клеточных функциях и состоянии болезни в естественном контексте. Будучи ортогональными методами sc-анализа, они могут быть мультиплексированы или выполняться параллельно для независимого подтверждения метаболических профилей, наблюдаемых с помощью MS. Такая взаимодополняемость повысит надежность данных sc и укрепит общие выводы, сделанные на основе исследований sc-метаболомики.

MRI, компьютерная томография (CT) и PET - мощные методы визуализации, широко используемые для изучения метаболической гетерогенности в различных тканях и системах органов, часто применяемые в исследованиях метаболической гетерогенности при раке. (287-289) Эти не-инвазивные методы позволяют фиксировать динамические изменения на клеточном и молекулярном уровнях у живых людей. MRI использует мощные магнитные поля и радиоволны для получения детальных изображений органов и тканей, превосходящих по контрастности мягкие ткани. CT использует рентгеновские лучи для создания изображений поперечного сечения, обеспечивая превосходное пространственное разрешение для структурных деталей. PET обладает высокой чувствительностью к метаболическим функциям, визуализируя распределение субстратов и продуктов метаболизма, меченных позитрон-излучающими изотопами. Часто используемые в комбинации, эти методы не только дополняют и подтверждают технологии sc, но и мотивируют к дальнейшему детальному исследованию с помощью технологий sc MS.

MRI в частности многопараметрическая MRI продемонстрировала пригодность для выявления метаболических изменений и обеспечения пространственного разрешения метаболических фенотипов. Например, при ясноклеточной почечно-клеточной карциноме (ccRCC) MRI выявила вариабельность гликолиза и цикла ТСА, подчеркнув значительные метаболические различия между опухолями и внутри них. (290) Кроме того, гиперполяризованная MRI с 13С-пируватом выявила гликолитическую зависимость в гепатоцеллюлярной карциноме, что позволило получить важные сведения для разработки стратегий лечения. (291) Протонная МР-спектроскопическая визуализация (МРСВ) - еще один метод MRI используемый для выявления метаболических различий в тканевых компонентах. При глиобластоме MRSI позволила провести неинвазивное метаболическое профилирование, выявив нагрузку на опухоль и гипоксию, что еще больше подчеркивает ее способность выявлять метаболическую гетерогенность. (292)

В качестве примера возможностей PET-изображения можно привести определение пространственного распределения радиоактивных трассеров в организме, что позволило получить функциональный обзор метаболических процессов в аденокарциноме легкого. PET-изображение зафиксировало гликолитическую гетерогенность, связав ее с агрессивными гистопатологическими характеристиками. (293) Кроме того, PET-визуализация в сочетании с метаболомикой ядерного магнитного резонанса (NMR) при раке молочной железы выявила метаболические вариации между подтипами и в различных областях опухоли, что позволило получить ценное представление о гетерогенности опухоли. (294)

Подобные исследования будут полезны при дальнейшем изучении с помощью специальных технологий метаболомики. Хотя MRI, CT и PET-изображения дают мощное представление о метаболизме всего организма и подчеркивают широкое присутствие клеточных гетерогенностей, их возможности ограничены тем, что они обнаруживают лишь несколько метаболитов и работают с низким пространственным разрешением. Напротив, sc MS и MSI могут обеспечить механистическое понимание, обнаруживая более широкий спектр метаболитов и обеспечивая превосходное разрешение. Полный научный потенциал раскрывается при использовании методов визуализации, не связанных с MS, в сочетании с MS, что позволяет понять метаболические процессы в различных биологических масштабах.

Ошеломляющий рост технологий sc в последнее время продемонстрировал интерес и потенциал для будущих применений. Чтобы обеспечить надежное отражение биологической гетерогенности, будущая работа должна быть направлена на решение пяти ключевых задач, связанных с метаболомикой: (1) обеспечение качества для сохранения метаболических состояний, (2) стратегии контроля и нормализации эффектов подавления ионов, (3) шаги по обеспечению происхождения аннотированных соединений в зависимости от образца, (4) улучшение интеграции мультиомики и (5) абсолютное количественное определение уровней метаболитов.

Чтобы оценить, как препараты sc влияют на состояние метаболизма, важно установить четкие критерии. В этом случае показатели энергетического метаболизма или окислительно-восстановительного состояния могут быть особенно информативными, поскольку они могут обеспечить динамическое считывание наиболее вероятных непосредственных метаболических нарушений, таких как окислительно-восстановительный стресс во время выделения клеток (100) или коллапс концентрации АТФ. (295) Простой способ их проверки может быть основан на измерениях проточной цитометрии. Например, активность митохондрий можно определить на уровне отдельных состояний с помощью красителей мембранного потенциала митохондрий (таких как MitoSOX), а уровень АТФ можно измерить с помощью генетически закодированного Форстеровского резонансного переноса энергии (FRET)-сенсора. (296) Помимо этого, ортогональные подходы, как обсуждается в разделе 6, могут подтвердить достоверность определенных измерений, например, возмущения NAD. В качестве дополнительного контроля можно сравнить объемные и объединенные образцы sc. Объединенные образцы sc готовятся путем выделения отдельных клеток и последующего их объединения. Затем они могут быть проанализированы параллельно с массой изолированных клеток, чтобы выделить значительные возмущения. Здесь также будет информативен контроль показателей энергетического и окислительно-восстановительного состояния, таких как соотношение АТФ/АДФ, NAD/NADH или соотношение окисленного и восстановленного глутатиона. Следует отметить, что из-за динамической природы этих возмущений их вряд ли можно зафиксировать на уровне транскриптомики или протеомики. В целом, требования к строгости, предъявляемые к метаболомическим исследованиям, выше и должны быть выше, чем к другим омическим технологиям.

Чтобы действительно принести пользу биологическим исследованиям, методы sc-метаболомики должны перейти от решения изолированных технических задач к разработке подходов с целостным взглядом, учитывающим их интеграцию в более широкие биологические цели и контексты. Действительно, мы можем различать типы клеток с помощью простого светового микроскопа, а технологии sc-метаболомики должны стремиться к сопоставлениям, выходящим за рамки анализа псевдобульб. Условия и контроль метаболомики sc, используемые при разработке методов, должны быть направлены на поиск ключевых переходных метаболитов, сообщающих о гетерогенности среди тесно связанных, возможно, транскрипционно сходных клеточных популяций. В этом отношении метаболические возмущения (с помощью лекарств или генетического спасения с помощью мутантов, лишенных ферментов) могут быть более информативными. Например, клетки, обработанные лекарством, можно смешивать в разных соотношениях после обработки, а затем наблюдать ожидаемые количественные изменения с помощью методологии sc. Таким образом, новые технологии sc-метаболомики смогут обеспечить слой информации, недоступный при использовании подходов sc-транскриптомики или sc-протеомики.

Создание общественных стандартов в протеомике, включая стандартизированные протоколы, форматы данных, меры контроля качества и минимальные требования к информации для отчетности об экспериментах, значительно улучшило воспроизводимость и сопоставимость исследований. (299) Рекомендации были предложены и специально для sc-протеомики, хотя они все еще ожидают широкого принятия сообществом. (300) Аналогичным образом мы должны стремиться к внедрению таких стандартов в метаболомике, чтобы повысить согласованность, надежность и воспроизводимость результатов экспериментов и лабораторий. Эти рекомендации и стандартизация помогут обеспечить более широкое внедрение новых методологий sc-метаболомики в исследовательском сообществе.

В развивающейся области sc-метаболомики технологические достижения продолжают расширять наши возможности по исследованию клеточной гетерогенности с все большим охватом и точностью. Однако такие проблемы, как эффекты ионизации, вопросы нормализации и уверенность в том, что измеренные молекулы действительно отражают биологические источники и состояния, остаются серьезными препятствиями. Нам необходимо добиваться количественных показаний, подтверждения метаболических различий и сохранения метаболических состояний. Наконец, актуальные биологические вопросы должны определять технологические разработки, обеспечивая выход за рамки простых сравнений между различными типами клеток и демонстрируя реальную возможность доступа к информации, выходящей за рамки массовых измерений.