Развитие технологий в области геномики за последнее десятилетие привело к появлению обширного набора методов секвенирования отдельных клеток и ядер, что позволило осуществлять высокопроизводительную молекулярную характеристику многих макромолекул^1-6. Однако в этих измерениях отсутствует цитоархитектурная организация профилируемых клеток. Технологии секвенирования с пространственным разрешением направлены на устранение этого недостатка путем штрихового кодирования макромолекул олигонуклеотидами, пространственные позиции которых известны^7-10. Однако прямой перенос принципов дизайна одноклеточных методов секвенирования в пространственно разрешенное профилирование часто невозможен, это требует повторного изобретения каждого молекулярного анализа (например, транскриптомики^8,9, мутаций⁷ или анализа хроматина, доступного для транспозазы, с помощью секвенирования (ATAC-seq)^11-13) в пространственном контексте. Кроме того, хотя вычислительные инструменты для работы с одноклеточными чрезвычайно развиты¹⁴, дополнительные источники шума в методах пространственной геномики также требуют их переработки, например, для решения проблем с перемешиванием клеток^15-17. Альтернативой стратегиям, основанным на захвате, является выделение отдельных клеток с сохранением информации о пространственном штрих-кодировании; на сегодняшний день это было продемонстрировано только в ограниченном пространственном разрешении и для редкой выборки тканей^18,19. Идеальная технология пространственной геномики должна (1) эффективно захватывать профили клеток из срезов тканей; (2) определять положение клеток с низким микрометровым разрешением; и (3) быть общеприменимой к любой методологии работы с одиночными клетками.

Здесь мы представляем Slide-tags - метод, при котором клеточные ядра из интактного свежезамороженного среза ткани "помечаются" олигонуклеотидами с пространственным штрих-кодом, полученными из ДНК-бусинок с известным положением. Затем изолированные ядра профилируются с помощью существующих одноклеточных методов с добавлением пространственных позиций. Мы демонстрируем тканевую универсальность метода Slide-tags, анализируя мозг взрослой и развивающейся мыши, кору головного мозга человека, миндалины человека и меланому человека. Мы импортируем пространственно меченые ядра в стандартные рабочие процессы для одноядерного РНК-секвенирования (snRNA-seq), одноядерного ATAC-seq (snATAC-seq) и TCR-секвенирования. Slide-tags также легко интегрируется в существующие вычислительные процессы для одноклеточных клеток, такие как вывод вариаций числа копий (CNV). При этом мы используем преимущества действительно одноклеточной, пространственно разрешенной, мультимодальной способности Slide-tags для выявления специфической для клеток пространственно изменяющейся экспрессии генов, пространственной контекстуализации рецептор-лиганд взаимодействий и изучения генетических и эпигенетических факторов, участвующих в микросреде опухоли.

Ранее мы разработали плотно упакованные пространственно индексированные массивы ДНК-штрихкодированных бусин (beads) размером 10 µm, созданные с помощью фосфорамидитного синтеза split-pool и индексированные методом секвенирования с помощью лигирования^7,9,20. В нашей оригинальной методике Slide-seq ДНК или РНК из тканей собирали и пространственно штрих-кодировали с помощью этих массивов. В нашей технологии Slide-tags мы фотографируем и диффундируем эти пространственные штрих-коды, полученные из бусин, в 20-футовые свежезамороженные срезы тканей, чтобы связать их с ядрами (рис. 1a). Мы предположили, что после того, как эти штрих-коды будут ассоциированы с ядрами, их можно будет использовать в качестве исходных данных для известных подходов к секвенированию отдельных ядер (Методы) с незначительными изменениями протокола.

Fig. 1: Slide-tags enables single-nucleus spatial transcriptomics in the mouse hippocampus.

a, Schematic of Slide-tags. A 20-?m fresh-frozen tissue section is applied to a monolayer of randomly deposited, DNA-barcoded beads that have been spatially indexed. These DNA spatial barcodes are photocleaved and associate with nuclei. Spatially barcoded nuclei are then profiled using established droplet-based single-nucleus sequencing technologies. The diagram was created using BioRender. b, Uniform manifold approximation and projection (UMAP) embedding of snRNA-seq profiles coloured by cell type annotations. DG, dentate gyrus; oligo, oligodendrocyte. c, The signal spatial barcode clusters after noise filtering by DBSCAN for selected cells, coloured according to cell type annotations (as in b) and the number of spatial barcode UMIs. Raw plots for these cells are plotted in Extended Data Fig. 2k. d, Slide-tags enables localization of nuclei to spatial coordinates in the mouse hippocampus; cells are coloured according to cell type annotation (as in b). e, Spatial expression of known marker genes compared with in situ hybridization data from the Allen Mouse Brain Atlas23. Colour scales, normalized average counts. f, The distance from the centroid for each of the spatial barcodes across all signal spatial barcode clusters; points are coloured by the two-dimensional kernel density estimation with an axis-aligned bivariate normal kernel, evaluated on a square grid. Kernel density estimates are displayed for x and y. For the plots on the outside, the centre lines show the median, and the adjacent lines show the upper and lower quartiles. g–i, Comparison metrics plotted for snRNA-seq compared with Slide-tags snRNA-seq, performed on consecutive sections. g, Cell type proportions and mean UMIs per cell are plotted by cell type. h, The normalized average UMI counts were determined per gene across all cells. i, Normalized average counts. Expression counts for each cell were divided by the total counts for that cell and multiplied by 10,000, this value + 1 was then natural-log transformed. r is the Pearson correlation coefficient. The error bands denote the 95% confidence intervals. For c–e, scale bars, 500 µm.

Итак, здесь мы разработали Slide-tags, технологию пространственной одноядерной геномики, которая широко применима к тканям, охватывающим различные масштабы, виды и состояния заболеваний. Мы профилировали ядра Slide-tags, выделенные из мозга мыши и взрослого человека, с помощью snRNA-seq, продемонстрировав неотличимое качество данных РНК и высокую точность пространственного позиционирования, а также выявив специфичные для клеточного типа пространственно изменяющиеся гены в разных слоях коры. Применение Slide-tags snRNA-seq к плотно упакованным человеческим миндалинам позволило пространственно контекстуализировать предсказанные взаимодействия рецептор-лиганд. Наконец, чтобы продемонстрировать мультимодальные возможности Slide-tags, мы одновременно профилировали транскриптом, эпигеном и репертуар TCR в тканях метастатической меланомы и сделали вывод о CNV по данным транскриптома. Мы определили изменения числа копий по данным транскриптома и выявили пространственные различия иммунных клеток между геномно отличными клонами. В цитогенетически однородном субклоне мы выявили два переходных состояния опухолевых клеток и, используя данные о пространственной доступности хроматина в одном ядре, определили пространственно автоскоррелированные мотивы транскрипционных факторов, которые, вероятно, участвуют в этом мезенхима-подобном переходе.

Slide-tags обладает рядом уникальных преимуществ в качестве технологии пространственной геномики. Во-первых, она легко импортируется в эксперименты по snRNA-seq замороженных тканей и позволяет добавлять пространственно установленные данные, не требуя специализированного оборудования и не жертвуя качеством данных. Во-вторых, метод генерирует данные с разрешением в одну клетку, не требуя деконволюции и сегментации, и обладает высокой чувствительностью (2 000-10 000 UMIs на клетку в наших наборах данных). Это существенно улучшает возможность непредвзятого обнаружения типов клеток и специфической для каждого типа клеток экспрессии генов в пространственных данных по сравнению с пиксельными пространственными транскриптомными технологиями. В-третьих, технология обладает высокой пропускной способностью, позволяя одновременно профилировать множество участков ткани, а также охватывать большие участки ткани за счет создания больших массивов бусин. В-четвертых, Slide-tags легко адаптируется к различным методологиям, использующим отдельные клетки и ядра. Помимо нашей демонстрации пространственного snRNA-seq + snATAC-seq, мы предполагаем, что будущие адаптации Slide-tags позволят профилировать ДНК^5,52, дополнительные эпигенетические модификации^6,53,54 и белки⁵⁵. Вычислительный анализ таких данных уникально возможен благодаря способности Slide-tags легко использовать многие существующие вычислительные процессы для работы с одиночными клетками (например, Seurat21, InferCNV43, ArchR56).

Несмотря на то, что Slide-tags сразу же пригодились во многих приложениях, их можно усовершенствовать по двум основным направлениям. Во-первых, наш метод оценивает только часть ядер в срезе ткани. По нашим оценкам, сочетание диссоциации и микрофлюидных потерь при штриховом кодировании ядер в совокупности составляет около 75 % потерянных ядер. Эти потери снижают эффективность обнаружения парных взаимодействий между клетками, а также молекулярных взаимодействий между клетками, что может быть преодолено за счет масштабируемости профилирования Slide-tags. Это представляет собой путь для существенного улучшения за счет оптимизации диссоциации для конкретных тканей, а также улучшения микрофлюидики капель или, потенциально, методов без микрофлюидики для отдельных ядер, которые могут штриховать ядра более эффективно⁵⁷. Во-вторых, в настоящее время Slide-tags ограничивается одноядерными методами секвенирования, в основном из-за простоты извлечения ядер из замороженных тканей. Некоторые методики очень выигрывают от использования одноклеточных данных, например, отслеживание линии развития с использованием митохондриальных геномных вариантов⁵⁸ и количественная оценка транскрипционной кинетики⁵⁹. Будущие итерации нашей технологии могут быть совместимы с маркировкой целых одиночных клеток. Тем не менее, в настоящее время для рутинного профилирования тканей мы по умолчанию используем snRNA-seq (в отличие от scRNA-seq), благодаря преимуществам в гибкости протокола, увеличению выхода ядер, уменьшению артефактов диссоциации тканей и улучшению смещения выборки клеток⁶⁰.

В последние годы сформировалась общая экспериментальная парадигма, которая объединяет сбор одноклеточных (или одноядерных) данных с пространственными данными для выявления типов клеток, сравнения между условиями и обнаружения пространственных закономерностей внутри и между этими типами. Slide-tags представляет собой метод слияния этих экспериментальных модальностей в единый подход, объединяющий определение цитоархитектурных особенностей со стандартным сбором данных секвенирования одиночных клеток. Благодаря включению инструментария одноклеточного секвенирования в пространственный репертуар, Slide-tags станет бесценным инструментом для изучения биологии тканей разных организмов, возрастов и заболеваний.