Эпитранскриптомика - это новая область исследований, которая используется для изучения химического разнообразия и биологической значимости модификаций РНК.^1-4 На сегодняшний день известно ~150 типов модификаций РНК в различных молекулах РНК из всех областей жизни,⁵ из которых транспортные РНК (tRNAs) содержат самое большое разнообразие и наибольшее количество изменений, составляя ~80% всех известных на сегодняшний день модификаций РНК.³ Физиологическая важность модификации tRNAs очевидна, учитывая различные заболевания человека, вызванные ее недостатком.^3,6,7

Разнообразные модификации РНК группируются в антикодоновой петле, особенно в положениях 34 и 37.³ Эти модификации играют критическую роль в стабилизации и модуляции кодон-антикодоновых взаимодействий на рибосоме, обеспечивая точный и эффективный синтез белка.⁸ Хотя tRNAs экспрессируются повсеместно, стабильный уровень каждой tRNAs и статус ее модификации динамически регулируются в различных клетках и тканях в ответ на различные клеточные условия и стрессы.^6,9,10 Изменение количества tRNAs и статуса ее модификации изменяет скорость прохождения рибосомы вдоль мРНК, влияя на стабильность мРНК и/или правильное сворачивание белка.^11,12

Queuosine (Q) - производное гуанозина (G) со структурой 7-deazapurine ядра, содержащего в боковой цепи cyclopentene diol мотив (рис. S1, рис. S10, рис. S11, рис. S12A), встречается в положении 34 (первое положение антикодонового триплета) бактериальных и эукариотических tRNAs, отвечающих за кодоны NAY (tRNAs для Tyr, His, Asp и Asn) (рис. 1A-1C и рис. S1, рис. S10, рис. S11, рис. S12B). ^13,14 Q был впервые обнаружен в tRNAs кишечной палочки¹⁵ и с тех пор широко встречается в tRNAs бактерий и эукариот, за исключением нескольких примеров, включая микоплазму, почкующиеся дрожжи и Arabidopsis thaliana.^16-18



Figure S1 Biogenesis of Q derivatives and reaction mechanisms of Q-glycosylations, related to Figures 1, 3, and 6

Figure 1. Glycosyl queuosines in mammalian cytoplasmic tRNAs

(A and B) Secondary structures of human tRNATyr (A) and tRNAAsp (B) harboring galQ and manQ at position 34, respectively. The Q side chain is colored blue, and galactose and mannose moieties are colored red and green, respectively.

(C) Biogenesis of Q-tRNAs and glycosyl-Q-tRNAs in eukaryotes. tRNAs for Tyr, Asp, His, and Asn are modified by the QTRT1/QTRT2 heterodimer to form Q34. Q34 of tRNATyr is further galactosylated to form galQ34 by QTGAL in the presence of UDP-galactose (UDP-gal), while Q34 of tRNAAsp is further mannnosylated to form manQ34 by QTMAN in the presence of GDP-mannose (GDP-man).

(D and F) Detection of QTGAL (D) or QTMAN (F) activity in rat liver lysates. Extracted-ion chromatograms (XICs) of Q-containing fragments (upper) and galQ-(D) or manQ-(F) containing fragments (lower) of human tRNATyr (D) or E. coli tRNAAsp (F) digested by RNase T1 in the presence of crude lysate with or without UDP-gal (D) or GDP-man (F).

(E and G) CID spectrum of galQ- (E) or manQ- (G) containing fragment. c and y series product ions are assigned. >p, 2', 3'-cyclic phosphate. m2A, 2-methyladenosine. See also Figure S1, Figure S10, Figure S11, Figure S12.

Q в положении 34 tRNAs (Q34) играет роль в поддержании точности и эффективности трансляции во время декодирования на рибосоме.^19,20 Более ранние исследования показали, что Q34 функционирует для предотвращения считывания стоп-кодона tRNAs^Tyr.21,22 Недавние исследования профилирования рибосом показали, что Q34 в цитоплазматических tRNAs контролирует скорость удлинения когнатных кодонов в клетках человека и мышей, тем самым обеспечивая правильное сворачивание зарождающихся белков для поддержания целостности протеома.^23-25 В митохондриях человека Q34 в митохондриальных tRNAs способствует эффективному декодированию UAU.²⁶

Несмотря на то, что Q34 высококонсервативен в разных царствах,¹³ его биогенез отличается у бактерий и эукариот.¹⁴ У эукариот Q34 синтезируется в результате уникальной реакции замены основания в положении 34 tRNAs (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12B). Queuine, свободная форма основания Q, заменяет основание гуанина в положении 34 посредством трансгликозилирования, катализируемого эукариотической tRNAs-гуанин-трансгликозилазой (TGT), гетеродимером каталитической субъединицы 1 (QTRT1) и вспомогательной субъединицы 2 (QTRT2) queuine-tRNAs-рибозилтрансферазы (Рис. 1С и Рис. S1, Рис. S10, Рис. S11, Рис. S12B). ^16,27 Поскольку queuine синтезируется только в бактериях, а у эукариот отсутствует биосинтетический путь для queuine и его предшественника, эукариоты получают queuine в качестве диетического питательного вещества и/или из микрофлоры (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12B).¹³ В бактериях 7-cyano-7-deazaguanine (preQ1) основание, предшественник queuine, синтезируется из гуанозинтрифосфата (ГТФ) в ходе многоступенчатых реакций (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12B). ^28-30 Затем основание preQ1 включается в tRNAs посредством трансгликозилирования, опосредованного бактериальной TGT, после чего происходит дальнейшее превращение в Q34 в tRNAs (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12B).28,31,32,33 Когда бактериальные tRNAs деградируют, образуется queuine в качестве микроэлемента, который служит для биосинтеза Q34 у эукариот (Рисунок 1C и Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12B). Поскольку Q-модифицированные tRNAs сохраняются в условиях ограниченной доступности queuine,^34,35 механизм спасения queuine играет критическую роль в поддержании Q34 в tRNAs. Генетические исследования выявили домен неизвестной функции 2419 (DUF2419) в качестве потенциального белка спасения Q (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12B)³⁶.

Физиологическое значение Q34 было впервые продемонстрировано в классических исследованиях питания мышей.^34,37 У зародышей мышей, которых кормили диетой с дефицитом Tyr, наблюдались различные нарушения развития, включая неврологические аномалии, и они погибали в течение 2 недель после рождения, это свидетельствует о том, что для выживания зародышей мышей в условиях Tyr-голодания необходимы специфические питательные вещества, обеспечиваемые микрофлорой кишечника. Поразительно, но летальный исход зародышей мышей был полностью восстановлен при кормлении диетой, дополненной 100 нМ queuine.³⁷ Однако молекулярная основа фенотипов, вызванных истощением queuine и/или Q34, остается неизвестной.

Гипермодификации Q34 еще больше усложняют влияние этого уникального украшения. У позвоночных животных Q34 дополнительно гликозилирован (рис. 1A-1C и рис. S1, рис. S10, рис. S11, рис. S12A). В цитоплазматических tRNAs^Tyr галактоза присоединяется к циклопентеновой гидроксильной группе Q34 через β-гликозидную связь, образуя галактозил-Q (galQ) (рис. 1А и рис. S1, рис. S10, рис. S11, Рисунок S12A),^38,39 в то время как в цитоплазматической tRNA^Asp манноза присоединяется к циклопентеновому мотиву Q34 с образованием маннозил-Q (manQ) (Рисунок 1B и Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12A).^38,39 galQ и manQ - уникальные модификации tRNAs, содержащие гексозный сахарный мотив. Было предсказано, что в обоих случаях гликозилирование происходит по β-конфигурации, связанной с 11-гидроксигруппой (или homoallyl galQ) циклопентенового кольца³⁸. Хотя предложенная структура galQ (рис. 1А и рис. S1, рис. S10, рис. S11, рис. S12A) была подтверждена сравнением с химически синтезированным galQ (β-homoallyl galQ)⁴⁰ , стереоструктура manQ была пересмотрена; природный manQ был тщательно сравнен с синтетическими изомерами manQ, показав, что манноза присоединена к Q по 12-гидроксигруппе циклопентенового кольца с α-конфигурацией (α-allyl manQ) (рис. 1B и рис. S1, рис. S10, рис. S11, рис. S12A). ⁴¹ Несмотря на исследования характерных структур, биогенез и физиологическое значение Q-гликозилирования оставались неизвестными на протяжении более четырех десятилетий. Идентификация tRNAs-модифицирующих ферментов, ответственных за биогенез galQ и manQ, необходима для дальнейшего выяснения биохимической и физиологической роли этих гликозил-Q.

Олигосахаридные цепи часто соединяются с белками и липидами путем ферментативного гликозилирования. Гликопротеины и гликолипиды играют разнообразную роль в клеточных функциях.^42,43 Гликозилтрансферазы - это большая группа ферментов, которые переносят молекулу сахара от активированного донора сахара на различные акцепторы, включая белки и липиды. В геноме человека закодировано около 230 генов гликозилтрансфераз.^44,45 Согласно базе данных Carbohydrate-active enzymes (CAZy),⁴⁶ гликозилтрансферазы человека классифицируются на 45 семейств.⁴⁷ На основании прогнозируемого сворачивания белков, выведенного из их аминокислотных последовательностей, они в основном делятся на три группы: GT-A, GT-B и GT-C.^44,47 Для всех структур нуклеотидных сахарозависимых гликозилтрансфераз были обнаружены только группы сворачивания GT-A и GT-B.⁴⁴ После гликозилирования в продуктах образуются две стереохимические конфигурации аномерного углерода, обозначаемые как α или β, что обусловлено различными механизмами действия двух классов гликозилтрансфераз. Аномерная конфигурация продукта может быть либо сохранена, либо инвертирована по отношению к донорному субстрату (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12C).

В данном исследовании мы провели очистку еще неизвестных РНК-гликозилаз по активности с помощью обычной колоночной хроматографии и выявили два неизвестных tRNAs-модифицирующих фермента - Q-tRNAs-galactosyltransferase (QTGAL, формально известная как β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза-подобный белок 1 [B3GNTL1]) и Q-tRNAs mannosyltransferase (QTMAN, формально известная как гликозилтрансфераза-подобный домен, содержащая 1 [GTDC1]) (рис. 1С). Мы успешно восстановили galQ в tRNA^Tyr и manQ в tRNA^Asp с помощью соответствующих рекомбинантных белков в присутствии уридиндифосфат (UDP)-галактозы (UDP-gal) и гуанозиндифосфат (GDP)-маннозы (GDP-man), соответственно. QTGAL, член семейства гликозилтрансфераз 2 (GT2), принадлежащий к группе GT-A, катализирует реакцию инвертирующего переноса сахара SN2 для синтеза β-гомоаллилгалактозы (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12D), в то время как QTMAN, гликозилтрансфераза семейства 4 (GT4), принадлежащая к группе GT-B, катализирует реакцию удерживающего переноса сахара для синтеза α-аллил manQ (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12E). Кинетический анализ показал, что Q-гликозилирование может регулироваться концентрацией внутриклеточных доноров сахара. Профилирование рибосом показало, что galQ и manQ замедляют элонгацию на когнатных кодонах, UAC и GAC (GAU), соответственно. Мы также обнаружили, что галактозилирование Q34 имеет функцию подавления считывания стоп-кодона. Кроме того, мы обнаружили, что в нокаутных по Q-гликозилированию клеточных линиях значительно увеличивается количество белковых агрегатов. Более того, структурные исследования человеческой 80S рибосомы в комплексе с tRNAs с гликозилом Q дают представление о молекулярной основе распознавания кодонов, регулируемого Q-гликозилированием. Кроме того, мы обнаружили, что нокаутные линии рыбок данио qtgal и qtman демонстрируют укороченную длину тела. Наша работа подтвердила ключевую роль QTGAL и QTMAN в Q-гликозилировании, синтезе белка, целостности протеома и физиологическом значении позвоночных.

QTGAL (B3GNTL1) является членом GT2, относящимся к группе GT-A складок. Согласно базе данных Pfam⁶⁰ , N-концевая часть (остатки 22-189) QTGAL включает домен, названный семейством гликозилтрансфераз 2 (pfam00535) (рис. S10A и S10B). Ферменты семейства GT2 катализируют реакцию инвертирующего переноса сахара SN2.⁴⁴ Фактически, galQ демонстрирует β-гомоаллильную конфигурацию, образующуюся в результате инвертирующего переноса галактозы из UDP-gal, катализируемого QTGAL (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12D). Ферменты сложения GT-A обладают консервативным мотивом Asp-X-Asp (DXD) (Рисунок S10A), в котором ион двухвалентного металла (Mn2+ или Mg2+) взаимодействует с карбоксилатом для стабилизации нуклеотидного дифосфатного сахара и облегчения нуклеофильной атаки SN2-типа на аномерный углерод акцепторной группой для формирования инвертирующей конфигурации, высвобождая при этом нуклеозиддифосфат в качестве уходящей группы (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12D).⁴⁴ Мы обнаружили сильную консервацию мотива DXD в QTGAL позвоночных и нематод (Рисунок S10A). Третичная структура QTGAL человека (Рисунок S10C) была предсказана с помощью AlphaFold.^61,62 Поиск известной гликозилтрансферазы с наибольшим сходством с N-концевым доменом (NTD) (pfam00535) QTGAL человека был проведен на сервере Dali,⁶³ в результате чего была найдена хондроитинполимераза E. coli (K4CP) (Рисунок S10C),⁶⁴ гликозилтрансфераза GT2, комплексирована с UDP-глюкуроновой кислотой (UDP-GlcUA). С-концевой домен (CTD) K4CP хорошо накладывается на NTD человеческого QTGAL (рис. S10C), выявляя остатки, критические для активности гликозилирования. Мы заметили, что шесть аминокислотных остатков, окружающих UDP-GlcUA, лиганд, связанный с K4CP, присутствуют в предсказанной структуре QTGAL (Рисунок S10D), и все шесть остатков хорошо сохранились в гомологах QTGAL (Рисунок S10A). В структуре K4CP ион Mn2+ координируется D521 (D115 в QTGAL) в мотиве DXD и H631 (H232 в QTGAL) для стабилизации UDP-GlcUA. D519 (D113 в QTGAL) в мотиве DXD и D469 (D56 в QTGAL) распознают урацил UDP-GlcUA. D605 (D205 в QTGAL) играет важную роль в облегчении нуклеофильной атаки акцепторного субстрата в качестве общего кислотно-основного катализатора (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12D). Заменив лиганд на UDP-gal, QTGAL, предположительно, катализирует ту же SN2-инвертирующую реакцию, основываясь на структурном анализе K4CP. В С-концевой области QTGAL (рис. S10C) мы обнаружили мотив Rossman-fold, который тесно связан с N-концевым гликозилтрансферазным доменом. Мы также обнаружили положительно заряженную поверхность в С-концевой области с той же стороны, что и мотив DXD (рис. S10E). Эти основные остатки консервативны у гомологов QTGAL (рис. S10A), что предполагает распознавание tRNAs путем электростатического взаимодействия.

Напротив, QTMAN (GTDC1) относится к ферментам GT4, входящим в группу GT-B-fold. В состав GT-B-fold входят два Rossman-подобных β/α/β домена.⁴⁴ Человеческий QTMAN имеет DUF3524 (PF12038) в N-концевой части (остатки 2-167) и гликозилтрансферазную группу 1 (PF00534) в C-концевой части (остатки 279-457) (рис. S11A и S11B). Нуклеотидный дифосфатный сахар связывается с CTD ферментов семейства GT4, а реакция переноса удерживающего сахара катализируется независимым от ионов металлов образом.^44,46 В подтверждение этого факта manQ имеет α-аллильную стереохимическую конфигурацию⁴¹ , возникающую в результате переноса удерживающей маннозы с GDP-man, катализируемого QTMAN (Рисунок S1, Рисунок S10, Рисунок S11, Рисунок S12E). Третичная структура человеческого QTMAN была предсказана с помощью AlphaFold (рис. S11C). Мы провели поиск известных ферментов семейства GT4, имеющих сильное сходство с QTMAN человека, и обнаружили бактериальную BshA, комплексирующуюся с UDP и малил-N-ацетил-D-глюкозамином (GlcNAc-mal) в качестве лигандов.⁶⁵ Когда структура BshA была наложена на QTMAN человека (Рисунок S11C), размещение UDP и GlcNAc-mal между двумя доменами предсказало лиганд-связывающий сайт для GDP-man в QTMAN человека. Мы идентифицировали девять аминокислотных остатков, окружающих UDP и GlcNAc-mal в BshA (рис. S11D), и обнаружили, что почти все остатки хорошо сохранились в QTMAN (рис. S11D). В случае BshA, H121 и K212 являются критическими остатками для катализа SNi-подобной реакции присоединения, необходимой для переноса GlcNAc из UDP-GlcNAc в малат.⁶⁵ В человеческом QTMAN, H90 и K296, предположительно, являются соответствующими остатками, участвующими в переносе маннозы из GDP-man в tRNAAsp во время образования manQ34 (Рисунок S11D). Анализ электростатического поверхностного потенциала выявил положительно заряженную область в NTD вблизи лиганд-связывающего сайта (рис. S11E), что предполагает связывание tRNAs для образования manQ.

Характеристика кинетики Q-гликозилирования с помощью QTGAL и QTMAN показала, что значения Km для доноров сахара были относительно высокими: 14 и 69 мкМ для UDP-gal и GDP-man, соответственно (рис. 3C и 3D). Учитывая приблизительные оценки внутриклеточных концентраций доноров сахаров: 7-65 мкМ для UDP-gal^66-69 и 0,9-11 мкМ для GDP-man,⁶⁹, вероятно, что Q-гликозилирование динамически регулируется внутриклеточными концентрациями доноров сахаров. В частности, на образование manQ, опосредованное QTMAN, могут влиять низкие концентрации GDP-man, это указывает на то, что уровень manQ динамически меняется, реагируя на питательные условия в клетке. Известно, что клеточный уровень GDP-man значительно снижен у пациентов с врожденными нарушениями гликозилирования, вызванными патогенными мутациями в PMM2 (PMM2-7-carboxy-7-deazaguanine [CDG]).^70,71 Помимо дефицита N-гликанов и маннозилирования белков, в патогенез может быть вовлечена гипомодификация manQ. Клеточная концентрация UDP-gal также нарушается у пациентов с галактоземией, врожденным нарушением метаболизма галактозы.⁷² В частности, уровень galQ может быть нарушен у пациентов с галактоземией, несущих мутации потери функции в галактозо-1-фосфат уридилтрансферазе (GALT).

Хотя в генах QTGAL (B3GNTL1) и QTMAN (GTDC1) не было обнаружено очевидных патогенных мутаций, генетические и эпигенетические исследования предполагают, что они связаны с заболеваниями человека. Эпигеномный анализ выявил уникальный CpG-сайт в B3GNTL1, сильно ассоциированный с раком легких.⁷³ Гиперметилирование другого CpG-сайта в этом же гене наблюдалось в опухолях толстой кишки.⁷⁴ Кроме того, высокая экспрессия B3GNTL1 ассоциирована с раком толстой кишки.⁷⁵ Нарушение работы GTDC1 было обнаружено в клетках пациентов с заболеваниями нейрального развития, это указывает на то, что QTMAN-опосредованное образование manQ участвует в развитии центральной нервной системы.⁷⁶ Геномные делеции, охватывающие ZEB2 и GTDC1, связаны с синдромом Mowat-Wilson.⁷⁷ Однако значимость Q-гликозилирования для заболеваний остается неясной.

Известно, что скорость декодирования при трансляции, зависящая от доступности внутриклеточных tRNAs и смещения синонимичных кодонов, влияет на стабильность мРНК^78-80 и сворачивание белков.⁸¹ Эта концепция, известная как смещение использования кодонов или оптимальность кодонов, важна для поддержания клеточного протеостаза.^11,12 Модификации tRNAs в антикодоновой области играют важную роль в модуляции скорости декодирования для поддержания целостности протеома.^82-84 На самом деле, гипомодификация Q-обладающих tRNAs приводит к образованию белковых агрегатов, вызывает стресс ER и активирует UPR в клетках человека.^24,26 Здесь мы показали, что Q-гликозилирование также подавляет белковые агрегаты, тем самым поддерживая клеточный протеостаз (Рисунок 5F). Мы также наблюдали явное усиление интегрированного стрессового ответа у мутантов рыбок данио, лишенных Q34 или galQ34 (рис. 7D). Механистически анализ профилирования рибосом показал, что Q34 способствует эффективному декодированию всех кодонов NAU, но замедляет декодирование NAC (за исключением кодона AAC) (Рисунок S3A). Более того, Q-гликозилирование замедляло элонгацию на когнатных кодонах, UAC и GAC (GAU), соответственно (рис. 5A-5D). Крио-EM анализ серии рибосомных комплексов выявил молекулярную основу распознавания кодонов, регулируемого Q34 и glycosyl-Q34 на А-сайте рибосом (рис. 6). Мы обнаружили, что циклопентеновое кольцо Q34 функционирует как связующее звено основной бороздки, которое стабильно распознает первую и вторую пары оснований в кодон-антикодоновой спирали со стороны основной бороздки (рис. 6А). Любопытно, что циклопентеновое кольцо Q34 отсоединяется от основной бороздки кодон-антикодоновой спирали, когда Q34 узнает С-концевой кодон по геометрии Уотсона-Крика, поскольку Q34 перемещается в сторону основной бороздки относительно wobble pairing Q34-U3 (рис. 6D). Это структурное наблюдение объясняет, почему Q34 облегчает декодирование NAU, но замедляет декодирование NAC. Однако почему Q34 декодирует кодон NAC гораздо медленнее, чем G34, остается неизвестным. Большая боковая цепь Q34 может скорее дестабилизировать сопряжение спирали Уотсон-Крика из-за ее высокой подвижности во время декодирования.

Циклопентеновое кольцо manQ34 после маннозилирования поворачивается примерно на 160° (рис. 6F), что приводит к потере Н-связей между циклопентеновым кольцом и кодон-антикодоновой спиралью, ослабляя тем самым распознавание кодона GAU. Однако циклопентеновое кольцо manQ34 по-прежнему сохраняет свою функцию связывания основной бороздки за счет Ван-дер-ваальсовых взаимодействий с основной бороздкой. Аналогичное структурное изменение наблюдалось и при конверсии Q34 в galQ34. Однако значительных изменений в декодировании UAU не наблюдалось (рис. 5A и 5B). Поэтому мы считаем, что циклопентеновое кольцо galQ34 работает как связующее звено мажорной бороздки сильнее, чем у manQ34. С другой стороны, и manQ34, и galQ34 замедляют декодирование С-концевого кодона, поскольку циклопентеновое кольцо перемещается в сторону большой бороздки.

Низкая плотность сахарных молекул гликозилированного Q34 указывает на большое пространство в декодирующем центре рибосомы (рис. S12). Хотя мы не можем подробно обсуждать конформацию сахарных молекул из-за их низкой плотности, несколько остатков рРНК присутствуют вблизи сахарных молекул. В структуре manQ34 на А-сайте (рис. S12A и S12B) C1701 (C1400) и C1698 (C1397) находятся на расстоянии H-связи с мотивом маннозы. Кроме того, мотив маннозы приближается к фосфатной основе между кодонами Р- и А-сайта. Вполне вероятно, что O11 из manQ34 может образовывать H-связь с O6 из G4 (рис. S12A) или N1 из A4 (рис. S12B), 4-м остатком мРНК, расположенным в 3' рядом с кодоном А-сайта. Напротив, в структуре galQ34 на А-сайтах (рис. S12C и S12D) мотив галактозы приближается к C1698 (C1397). Мотив галактозы может взаимодействовать с 4-м остатком мРНК. Мы полагаем, что эти дополнительные взаимодействия между сахарным мотивом и окружающей средой могут быть вовлечены в регуляцию декодирования. В структурах Р-сайта (рис. S12E-S12G) мы наблюдаем большое пространство для размещения сахарных молекул manQ34 и galQ34. Маннозный мотив manQ34 приближается к третьему остатку кодона E-сайта, G1207 и C1700 (рис. S12E), тогда как галактозный мотив galQ34 расположен вблизи U1685 и m¹acp³Ψ1248 (рис. S12F и S12G).

В заключение мы идентифицировали tRNAs-модифицирующие ферменты QTGAL и QTMAN, которые катализируют галактозилирование и маннозилирование Q-модифицированных tRNAs, соответственно. Q-гликозилирование модулирует скорость декодирования во время трансляции и способствует правильному сворачиванию белков и клеточному протеостазу. Структурные исследования рибосом в комплексе с tRNAs человека выявили молекулярную основу распознавания кодонов, модулируемого Q-гликозилированием. Мы также наблюдали фенотипы постэмбрионального роста у рыбок данио, лишенных galQ или manQ, демонстрируя физиологическую важность Q-гликозилирования у позвоночных.

Чтобы более четко оценить оптимальную трансляцию из-за отсутствия Q-гликозилирования, необходимо оптимизировать профилирование рибосом в присутствии ингибиторов трансляции и определить реальную скорость элонгации в каждом мутантном штамме. В противном случае нам придется применить другой параметр, такой как кодон-оптимально-опосредованная деградация мРНК (COMD).¹¹ Необходимо тщательно разработать и создать экспериментальную систему для измерения стабильности мРНК в мутантных штаммах в масштабе всего транскриптома. Что касается физиологических аспектов у млекопитающих, мы более подробно изучаем биологическую роль Q-гликозилирования на мышиных моделях.