Посещений:
Киназы Aurora A и В

Роль в Клеточном Цикле

Mitotic mechanics: the auroras come into view
Paul D Andrews, Elena Knatko, William J Moore and Jason R Swedlow
Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:672–683

Aurora kinases have recently taken centre stage in the regulation of key cell cycle processes. Aurora A is emerging as a critical regulator of centrosome and spindle function. Aurora B mediates chromosome segregation by ensuring proper biorientation of sister chromatids, possibly through the regulation of microtubule dynamics. This enzyme also functions in cytokinesis apparently by interacting with a critical GTPase and a kinesin-like protein. Recent work on both kinases has revealed functional links between Aurora kinase activity and the mechanics of cell division.
Протеин киназы Aurora являются одним из наиболее интенсивно изучаемых семейств протеин киназ. У позвоночных они представлены Aurora A, Aurora B и Aurora C, с одним или более высоко законсервированными ортологами, найденными у дрожжей, мух, червей и др. беспозвоночных. Влияние их регулятора распространяется с G2 и на весь цитокинез, сопровождаемый ключевыми для клеточного цикла событиями, такими как удвоение центросом, би-ориентация и сегрегация хромосом и позиционирование и углубление (ingression) борозды деления. Их локализация в критических точках клеточного цикла тесно связана с их активностью и функцией .

Aurora A




Aurora A and spindle formation


Aurora A располагается на полюсах веретена начиная с профазы и во всей телофазе(Рис. 1a) и считается критическим фактором в сборке митотического веретена у metazoans. Истощение Aurora A с помощью RNA-mediated interference (RNAi) нарушает рекрутирование в центросомы γ-tubulin у Caenorhabditis elegans [1] и D-TACC, centrosomin и γ-tubulin у Drosophila [2,3], что ведет к различным дефектам микротрубочек и и морфологии центросом во время митозов у этих животных [1,2]. D-TACC, который взаимодействует с Drosophila гомологом XMAP215, соединяется и фосфорилируется с помощью Aurora A, указывая тем самым, что Aurora A м. рекрутировать некоторые факторы на центросомы с помощью прямого фосфорилирования [2]. Однако, рекрутирование с помощью Aurora A centrosomin не зависит от киназной активности, это говорит о томя, что Aurora A играет структурную роль в этом случае [2,3]. Мутации Aurora A устраняют асимметричные клеточные деления клеток предшественников сенсорных органов у Drosophila независимо от одновременных дефектов центросом, указывая тем самым, что Aurora A м. регулировать клеточные деления с помощью дополнительных, ещё не установленных путей [4].
Исследования экстрактов яиц Xenopus выявили фактор сборки веретена TPX2 в качестве регулятора Aurora A фосфорилирования in vitro [5,6]. TPX2, по-видимому, соединяется с Aurora A [7], способствуя её фосфорилированию путём блокирования доступа protein phosphatase 1 (PP1) к Aurora A, тем самым становится возможным накопление активной Aurora A киназы с помощью аутофосфорилирования [5,6]. Истощение TPX2 или добавление не-фосфорилированной формы Aurora A ингибирует сборку биполярного веретена, но не формирование звездочек (aster) в митотических экстрактах Xenopus, демонстрируя, что TPX2- регулируемое аутофосфорилирование Aurora A является ключевым событием в сборке митотического веретена [6]. Это указывает на то, что аутофосфорилирование Aurora A м. представлять собой преимущественный путь активации in vivo.

Aurora A and tumorigenesis


Ген Aurora A расположен в области хромосомы 20q13 человека, которая амплифицируется при многих формах рака. Кроме того, Aurora A избыточно экспрессируется в некоторых solid опухолях [8]. Избыточная экспрессия Aurora A вызывает увеличение количества центросом и анеуплоидий, ведущих к трансформации клеток млекопитающих. Такие эффекты, по-видимому, обусловлены нарушениями цитокинеза и усиливаются в p53-дефицитных клетках [9]. Насколько известно Aurora A не участвует непосредственно в цитокинезе, но возможно вызывает дефекты выхода из митоза, позволяя клеткам преждевременно проходить КПП (checkpoint) сборки веретена [10].
Определенные аллели Aurora A обнаруживаются на более высоких уровнях в выборках опухолей и как было установлено вызывают



Comparison of Aurora A and Aurora B localisation during the cell cycle. (a) Upper row: Aurora A localisation (red) at the spindle poles of Xenopus tissue culture cells, with microtubules shown in green and DNA in blue. Lower row: Aurora B, shown in red, localises to centromeres in prometaphase and metaphase and then the spindle midzone from anaphase. Both rows show a prophase cell (left), metaphase cell (middle) and anaphase cell (right). (b) Aurora B localisation (green) in the inner centromere of human metaphase chromosomes (white). Centromeres, stained for the ACA antigen, are shown in blue and microtubules shown in red.

усиление туморогенности и генетической нестабильности, когда экспрессируются в клеточных линиях [11], подтверждая, что мутации Aurora A м. оказывать доминантно-негативный эффект на динамику митотических микротрубочек и checkpoint веретена.

Aurora A structure and regulation


Aurora A единственная из семейства Aurora киназ кристаллизована, а структура её каталитического домена обнаруживает множество конформационных сходств с SRC тирозин киназами и AGC семейством киназ [12]. Однако, отмечены некоторые уникальные свойства сайта связывания АТФ Aurora A, включающие глубокий карман проксимальнее шестой амино группы аденозина. Это м. использоваться в создании специфических Aurora киназных ингибиторов в качестве потенциальных агентов для химиотерапии рака.
Aurora A, по-видимому, регулируется с помощью как фосфорилирования, так и деградации. Aurora A становится фосфорилированной во время митоза по законсервированному остатку в T-петле (T288 у людей) внутри её каталитического домена [13], при этом фосфорилированная форма Aurora A обладает повышенной киназной активностью. Фосфорилирование Aurora A T-петли м.б. устранено с помощью активности PP1, по крайней мере, in vitro [13]. Уровни Aurora A в клетках регулируются с помощью протеасомами обеспечиваемой деградации. Ингибирование протеасом в клетках HeLa ведет к повышению уровней poly-ubiquitinated Aurora A и одновременно к накоплению Aurora A, фосфорилированных по T288, это указывает на то, что данная форма Aurora A направляется на деградацию [13,14]. Aurora A деградирует, когда клетка выходит из митоза и убиквитинируется с помощью anaphase-promoting complex (APC) in vitro [14].

Aurora B


Aurora B является белком хромосомным пассажиром, локализующимся на центромерах с профазы и в течение всего метафазно-анафазного перехода. Затем она релокализуется в анафазе в среднюю зону и кортекс веретена в месте ингрессии борозды (Рис. 1a). Перед анафазой Aurora B концентрируется в 'inner centromere', в богатой хроматином области между центромерами (Рис. 1b). Членом основателем chromosome passenger белков является INCENP, который многие годы был известен как участник сегрегации хромосом и цитокинеза [15]. INCENP, который имеет ортологов у всех эукариот, тесно ассоциирует с Aurora B [16] и м. регулировать её активность и локализацию. Survivin, законсервированный inhibitor of apoptosis (IAP)-подобный белок и третий член Aurora B комплекса, участвует различным образом в ингибировании апоптоза, хода митоза и цитокинеза [15]. Недавно, как было показано на C. elegans, новый белок CSC-1 соединяется с survivin/BIR-1 и INCENP/ICP-1 [17]. Aurora B нуждается в INCENP и survivin (а у червей и в CSC-1) для своей локализации [15,17,18]. В целом, удаление или разрушение комплекса Aurora B вызывает дефекты в расположении хромосом на митотическом веретене, потерю фосфорилирования белков хроматина (особенно гистона H3) и неспособность к цитокинезу. Список белков chromosome passenger, которые потенциально взаимодействуют с комплексом продолжает расти, подчёркивая множественные уровни его регуляции и функции [19].

Aurora B in budding and fission yeast


Почкующиеся дрожжи имеют единственную Aurora kinase, Ipl1p [20], которая ассоциирует с Sli15p и Bir1p, ортологами INCENP и survivin,соотв. [21,22]. У почкующихся дрожжей, ipl1 и sli15 мутанты не способны сегрегировать сестринские хроматиды в анафазе несмотря на собственно потерю слипчивости сестринских хроматид [21,23], т.к. они не способны собственно ориентировать свои хромосомы на митотическом веретене и вместо этого формируют моно-ориентированные хромосомы [24,25]. Для правильно сегрегации в митозе сестринские хроматиды д.б. прикреплены к противоположным полюсам веретена (bi-oriented) перед началом анафазы, так что все моно-полярные прикрепления д.б. откорректированы (Рис. 2). В ipl1 и sli15 клетках такой коррекции не происходит и это ведет часто к неразделяемым моно-ориентированным хромосомам [25]. Ассоциированный с центромерой Ipl1 комплекс м. способствовать би-ориентации хромосом путём дестабилизации прикрепления микротрубочек к моно-ориентированным кинетохорам [25]. Если Ipl1p комплекс дестабилизирует прикрепления микротрубочек, то становится возможным различать моно- и би-ориентированные кинетохоры, т.к. прикрепления микротрубочек на би-ориентированных кинетохорах остаются интактными. Следовательно,



Functions of Aurora B in kinetochore–microtubule attachment. Schematic representation of different attachment modes for chromosomes in mitosis. Monotelic (one kinetochore attached to a microtubule from only one pole), syntelic (each kinetochore attached to microtubules emanating from one pole), merotelic (both kinetochores attached to microtubules derived from both poles) and amphitelic (bi-polar bioriented attachment) forms of kinetochore-microtubule attachment can be found in mitotic chromosomes (at least in vertebrates). The interchange between these states is inferred but not proven. Aurora B appears to be required for correction of syntelic (and potentially merotelic) attachments to generate the amphitelic attachment state required for accurate chromosome segregation.

кажется объяснимым, что комплекс каким то образом ощущает натяжение, создаваемое прикреплением сестринских кинетохор к противоположным полюсам веретена. Становление стабильного биполярного прикрепления нуждается в координации и балансе между активностями Ipl1p киназы и Glc7p/PP1 фосфатазы на кинетохорах [22,26-28], при этом фосфатазная активность возможно регулирует Ipl1p, а также дефосфорилирует Ipl1p субстраты. Несколько Ipl1p мишеней потенциально участвует в регуляции прикрепления к веретену, они были идентифицированы в Dam1p outer-kinetochore microtubule-binding комплексе (Dam1p, Ask1p, Spc34p и Spc19p) и в Ndc80p комплексе [22], как показано на Рис. 3a. Dam1p является важным компонентом кинетохор, который взаимодействует с Ipl1p комплексом [22,24,29-32,33]. В частности, он фосфорилирует Dam1p (и возможно также Ndc80p и Spc34p) ослабляет Dam1p-Ndc80p и Dam1p-Spc34p взаимодействия и дестабилизирует ассоциацию комплекса Dam1p с центромерами [34]; этот эффект м.б. ответственным за отсоединение кинетохор. В дополнение к Ndc80p и Dam1p комплексам, описан ключевой компонент Ndc10p внутренней части кинетохор, являющийся скорее всего мишенью для Ipl1p [23].
Комплекс Ipl1p также существенен и в аспекте checkpoint митотического веретена. Такой КПП (checkpoint) ингибирует анафазу в клетках, в которых кинетохоры не прикреплены или моно-прикреплены, так что, по-видимому. отсутствует натяжение. У мутантов ipl1 checkpoint остаётся функциональным, если запускается с помощью разрушений веретена (напр., nocodazole) [35]. Однако, ipl1 мутантные клетки неспособны активировать checkpoint веретена в ответ на отсутствие натяжения или на избыточную экспрессию вышестоящего регулятора checkpoint, Mps1p [35]. Этот результат подтверждает бифуркацию в ответе checkpoint веретена, когда Ipl1p комплекс вовлекается в мониторинг натяжения сестринских кинетохор, но он не нужен для мониторинга прикрепления микротрубочек к кинетохорам. Эта функция м.б. эволюционно законсервирована.
Члены комплекса Aurora B complex в делящихся дрожжах, Ark1p (Aurora B), Pic1p (INCENP) м Bir1p (survivin), охарактеризованы и было показано, что они выполняют сходные функции со своими ортолагами у почкующихся дрожжей и в клетках животных [36-39]. Однако, в отличие от почкующихся дрожжей мутанты по Ipl1p-комплексу, Ark1p-истощенные клетки S. pombe не способны активировать checkpoint в ответ на деполимеризацию микротрубочек, т.к. они не способны рекрутировать Mad2p на кинетохоры или формировать Mad2p-Mad3p комплексы [39]. Обе эти функции являются критическими для checkpoint митотического веретена. Ark1p и возможно весь Aurora B комплекс делящихся дрожжей функционирует как критический компонент в рекрутировании кухни checkpoint веретена на кинетохоры.



Aurora B substrates within the kinetochores and centromere domains: yeast vs. vertebrates. (a) The budding yeast centromere–kinetochore is schematically shown, highlighting known Ipl1p substrates within different kinetochore complexes. Black arrows show Ipl1 substrates. (b) The organisation of the vertebrate inner centromere, centromere and kinetochore is schematically shown. Known Aurora B substrates are shown in yellow.



Aurora B functions in chromosome alignment and segregation in metazoans


Комплекс Aurora B в клетках животных имеет несколько законсервированных функций, несмотря на некоторые структурные различия в кинетохорах и центромерах (Рис. 3 для сравнения). Использование высокого разрешения и наблюдения на живых клетках позволяют пролить новый свет на то, как работает комплекс Aurora B. Два более ранних исследования на Drosophila использовали INCENP и Aurora B RNAi и показалия, что истощение комплекса Aurora B ведет к дефектам congression хромосом,расхождения хромосом, течения анафазы и циокинеза [40,41]. У C. elegans, использование RNAi и генетических техник показало, что комплекс Aurora B необходим для нормальной конденсации, расположения, разделения и сегрегации хромосом [18,42,43].
Недавно два исследования на клетках млекопитающих подтвердили, что Aurora B регулирует движения и congression хромосом путём изменения динамики микротрубочек [44,45]. Микроинъекции anti-Aurora-B антител блокировали расположение и сегрегацию хромосом и устраняли spindle-attachment checkpoint [44]. Драматическое увеличение стабильности астральных микротрубочек и снижение плотности микротрубочек веретена были отмечены после инъекции anti-Aurora-B антител; однако осталось неясным, обусловлено ли это потерей функции Aurora B, т.к. не получено доказательств, что антитела действительрно ингибируют активность Aurora B activity, и что это ведет к её делокализации. Однако, в соответствии с этими результатами избыточная экспрессия ‘kinase-dead’ Aurora B K/R мутации в NRK клетках способствует однонаправленному движению центромер и снижению скорости движения хромосом, что приводит к дефектам congression хромосом [45]. Клетки трансфицированные мутацией Aurora B K/R также ведут к удлиннению веретена с хромосомами, образующими кластеры по периферии. В таких клеткках dynein и CENP-E были истощены из кинетохор, а Mad2 не находил болльше кинетохоры. Неясно, играет ли Aurora B структурную, а также каталитическую роль на центромере, т.к. избыточная экспрессиия kinase-dead Aurora B нарушает локализацию эндогенных ферментов. Однако, эти результаты, по крайней мере, концептуально согласуются с теми, что получены на почкующихся дрожжах, подтверждая, что Aurora B комплекс взаимодействует с митотическими молекулами, которые генерируют силы посредством микротрубочек.
Выявлены эффекты Aurora B комплекса на динамику микротрубочек в клетках млекопитающих [46,47]. Hesperadin, первоначально идентифицированный как новый indolinone, индуцирующий анеуплоидию, вызывает дефекты митозов и цитокинеза и ингибирует Aurora B in vitro. Однако, неясно, является ли Hesperadin строго Aurora-B-специфичным, т.к. он не был тестирован в отношении Aurora A или C [47] и было установлено, что он является эффективным ингибитором 6 различных киназ (AMPK, Lck, MKK1, MAPKAP-K2, CHK1 и PHK2) из тестированных 25. Второй ингибитор Aurora B, ZM447439, является модифицировнной версией ингибитора Aurora A и ингибирует и Aurora A и B в 100 nM пределах [46]. Оба соединения фенокопитруют Aurora B RNAi, вызывая дефекты в расположении и сегрегации хромосом и потерю фосфориляции H3 serine 10 и т.о. они кажутс пригодными для изучения ингибирования Aurora B inhibition в клетках человека. Важно, что в живых PtK1 клетках воздействие Hesperadin вызывает неспособность коррекции моно-ориентации хромосом, а в фиксированных обработанных Hesperadin клетках авт. нашли небольшое, но достоверное увеличение syntelic прикреплений и снижение monotelic прикреплений, что согласуется с дефектами би-ориентации хромосом, описанными у дрожжей [25]. Обработка Hesperadin, по-видимому, не нарушает подвижность хромосом per se, указывая тем самым, что факторы кинетохор, генерирующие силы, были всё ещё в основном интактными, т.к. они преодолевали арест checkpoint, индуцированный taxol и monastrol, но не nocodazole. Сходным образом кратковременная обработка ZM4474394, блокировала таксолом индуцированный арест клеточного цикла, но не nocodazole-индуцированный арест [46]. Интересно, что ZM4474394 не меняет локализации Aurora B или survivin на центромерах, но вызывает существенное снижение загрузки CENP-E, Mad2 и BubR1 на кинетохоры. Кратковременное воздействие ZM4474394 ведет к снижению средних расстояний между кинетохорами, что указывает на потерю натяжения сестринских центромер. В nocodazole-арестованных клетках, обработанных Hesperadin, уровни в кинетохорах Mad2 и CENP-E не меняются, тогда как уровни BubR1 и Bub1 в кинетохорах снижаются. Сходные эффекты наблюдались, когда survivin истощался с помощью RNAi [48,49]. Это важно, т.к. и таксол, которые сталибизирует микротрубочки, и monastrol, вызывающий образование монополярного веретена с моно-ориентированными хромосомами, как полагают активирует грань КПП веретена, которая м. отслеживать натяжение между сестринскими центромерами. Напротив, nocodazole деполимеризует все микротрубочки и м. активировать разные аспекты checkpoint, которые отслеживают оккупацию микротрубочками кинетохор. Эти данные строго подтверждаеют мнение, что Aurora B играет важную роль в коррекции ошибок присоединения микротрубочекe и возможно в отслеживании checkpoint веретена натяжения плеч.
Эти новые данные о функциях metazoan Aurora B комплекса подчеркивают множественные роли комплекса в регулировании митотических событий. В отдельности эти функции нуждаются в идентификации, как мириады субстратов для комплекса Aurora B д. участвовать в генерации сил и в checkpoint ответе на кинетохорах. Одним из кандидатов является microtubule-destabilising Kin I kinesin MCAK, который, как недавно было показано, является субстратом для Aurora B в клетках человека (PD Andrews and JR Swedlow, unpublished data). Aurora B фосфорилирование 5 высоко законесервированных серинов в MCAK’s N-конце ингибирует его активность по деполимеризации микротрубочек in vitro. При анализе phospho-mimic мутантов MCAK было выявлено снижение активности деполимеризации микротрубочек in vivo и существенное увеличение монопоярных хромосом с monotelic и syntelic прикреплениями. Кроме того, FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) анализ выявил, что мутации сайтов фосфорилирования с помощью Aurora B в MCAK меняют турновер MCAK на центромерах. Истощение Aurora B с помощью RNAi или экспрессии kinase-dead Aurora B блокируют загрузку MCAK на центромеры, это подтверждает данные, что разрушение Aurora B с помощью KR мутаций ведет к потере CENP-E и dynein из кинетохор [45]. Всё это вместе с данными по Dam1 комплексу у почкующихся дрожжей [22,34], деллает возможным, что фосфорилирование с помощью Aurora B скоординированно понижает сродство ключевых игроков, участвующих в прикреплении и турновере микротрубочек на кинетохорах и центромерах, тем самым способствуя потере прикрепления. Более того, новый inner-centromere белок, названный ICIS, стимулирует активность MCAK по деполимеризации микротрубочек in vitro [50]. ICIS ко-иммуноперципитируется вместе с Aurora B, INCENP и Skp1, как F-box-binding белок; однако, точные взаимоотношения между Aurora-B–INCENP и ICIS–MCAK неясны, принимая во внимание тот факт, что MCAK сам по себе является субстратом для Aurora B и ингибируется фосфорилированием с помощью Aurora B in vitro и in vivo [50]. Взаимодействие ICIS с Skp1 интересно, учитывая присутствие F-box внутри последовальностей ICIS. Остаётся установить, является ли присутствие F-box указыанием на то, что ICIS–MCAK комплекс является объектом дальнейшего уровня регуляции с помощью фосфорилированием управляемой ubiquitination и протеолиза.
Функция Aurora B в регуляции динамики микротрубочек м.б. законсервирована в эволюции [51]. Точная природа взаимоотношений между комплексом Aurora B, прикреплением микротрубочек к кинетохорам, генерацией натяжения с помощью регулируемого оборота микротрубочек и как это всё отслеживается (‘sensed’) с помощью различных аспектов механизма надзора за веретеном остаётся неясным.

Aurora B and cytokinesis


Цитокинез начинается в анафазе с углубления борозды, которое в конечном счёте разделяет делящиеся клетки на две отдельные дочерние клетки. Цитокинез д.б. скоординирован с расхождением хромосом, чтобы гарантировать сохранение интактных геномов. Aurora B комплекс ведет себя как критический координатор событий цитокинетического пути (обзор Glotzer). INCENP участвует в регуляции цитокинеза, т.к. локализуется в кортексе во время поздней анафазы, в телофазе перед углублением борозды деления и перед рекрутированием миозина [15,52]. Комплекс Aurora B существенен для цитокинеза у поозвоночных [16,53–55,56,57], C. elegans [18,42,58–60], Drosophila [40,41] и делящихся дрожжей [38]. У C. elegans комплекс Aurora B необходим для стабильного рекрутирования CeMKLP1/ZEN-4, кинезин-подобного белка, который действует, чтобы стабилизировать и связывать в пучки перекрывающиеся антипараллельрные микротрубочки в срединной зоне [43,59–61]. Комплекс между CeMKLP1/ZEN4 и Rho-GAP CYK4/MgcRacGAP законсервирован у людей и червей и дублирует centralspindlin [61]. MgcRacGAP является субстратом для Aurora B [62]. Фосфорилирование с помощью Aurora B усиливает его GAP активность особенно в отношении RhoA скорее, чем Cdc42 или Rac. Aurora B сайт, идентифицированный в этом иссоледовнии, не консервативен у MgcRac-GAP ортологов, так что сегодня неясно, каков генеральный механизм. Характер действия Aurora B’s распространяется за границы регулируемой динамики микротрубочек посредством kinesin-подобных белков: она также сильно фосфорилирует type-III промежуточные филаменты, такие как vimentin, GFAP и desmin [63,64]. Мутации Aurora B сайтов в этих белках промежуточных филамент ведут к дефектам формирования м сегрегации филамент и к блокированию финальной стадии цитокинеза [63,64]. Aurora B фосфорилирует также myosin II регуляторную лёгкую цепь [65]. Лекарственное ингибирование Aurora B вызывает потерю локализации myosin II нарушения организации срединной зоны [66]. Aurora B м. скоординировнано регулировать многие аспекты цитокинеза, включая выбоор плоскости деления посредством регуляции динамики кортикальных микротрубочек [67], углубления борозды с помощью регуляции генерации акто-миозиновых сил, стабильность срединной зоны веретена и возможно разделение клеток посредством регуляции активности малых GTPases и промежуточных филамент.

Aurora B and Chromatin


Многие из крупных мишеней для Aurora B киназы являются хромосомными белками. Гистон H3, один из стрежневых компоенентов нуклеосом, и специфичный для центромер H3 вариант CENP-A фосфорилируются во время митоза благодаря действию комплекса Aurora B [27,68–70]. Кроме того, продемонстрировано in vitro Aurora B фосфорилирование двух негистоновых хромосомных белков, ДНК topoisomerase II [71] и хроматин ремоделирующего фактора ISWI [72]. Специфическое для клеточного цикла фосфорилирование H3 законесервировано у эукариот, хотя функция этой модификации вызывает споры [73]. Простое стимулирование фосфорилирования H3 за счёт ингибирования PP1, фосфатазы, которая противодействует активности Aurora B комплекса, оказывается недостаточным для управления таргетингом condensin, важного фактора конденсации хромосом, или для индукции каки-либо видимых конденсаций хромосом [69]. Фосфорилирование гистона H3 м.б. критическим в организме с длинными хромосомами: Tetrahymena, несущая гистон H3 с мутацией в митотическом сайте фосфорилирования (S10A), обнаруживат дефекты конденсации и собственно не сегрегрирует митотические хромосомы [74], та же самая мутация у почкующихся дрожжей не обнаруживет фенотипических проявлений [27]. У червей истощение Aurora B с помощью RNAi вызывает дефекты конденсации хромосом и ингибирует фосфорилирование гистона H3, возможно из-за того, что condensin не попадает на соответ. хромосомы [59,75]. До некоторой степени сбивающие с толку дефекты конденсации наблюдались [40] и объявлялись необнаружимыми [41] в клетках тканевой культуры у Drosophila после Aurora B RNAi. Дефекты в конденсации хромосом обычно вызывают ‘cut’ фенотип, при котором хромосомы не способны сегрегировать соотв. образом в митозе и затем разрываются во время цитокинеза. У почкующихся дрожжей ‘cut’ фенотипы не обнаруживаются в ipl1 или sli15 клетках [24,25,27,76]. Мутанты Aurora B комплекса у делящихся дрожжей, по-видимому. ведут себя по другому, клетки ark1 обнаруживают дефекты конденсации и дефекты цитокинеза [38], а bir1 клетки обнаруживают cut фенотип [36,39]. Хромосомы формируются правильно in vitro в митотических экстрактах яиц Xenopus, истощенных по Aurora B комплексу [77]. Однако, если хроматин сначала реплицируется in vitro а затем втсупает в митоз в отсутствие Aurora B, то наблюдается частичный дефект в высвобождении cohesin (белкового комплекса, который обеспечивает ассоциацию сестринских хроматид) из хромосомных плеч. Этот эффект наиболее выражен, когда второго клеточного цикла протеин киназа Plx1, гомолог Xenopus polo киназы, также истощена [77]. Интересно, что у C. elegans мейозисные, AIR-2 (Aurora B) мутанты не способны высвобождать cohesin REC-8 из хромосом [78]. AIR-2 фосфорилирует REC-8 in vitro по нескольким сайтам. RNAi PP1/CeGLC-7 вызывает релокализацию AIR-2 и преждевременную потерю REC-8 из митотических бивалентов, подтверждая мнение, что динамика фосфорилирования и дефосфорилирования REC-8 является важной для мейоза. Незначительные различия в функции комплекса Aurora B м. указывать на то, что детали динамики хромосомной структуры отличаются в зависимости от количества и размеров хромосом, стадии развития, типа клеток и т.д.
Если комплекс Aurora B локализован в центромерах, то как он м. фосфорилирровать гистон H3 и др. хромосомные белки по всей длине хромосомных плеч? Уже первые сообщения по локализации INCENP иденифицировали существенное накопление белка доль хромосомных плеч [52]. Наши собственные наблюдения подтвердили это, а иногда выявляется сама Aurora B вдоль хромосомных плеч (PD Andrews and JR Swedlow, unpublished data). Эта локализация пока ещё непонятна, но м. отражать динамичный пул Aurora B комплекса, который присутствует на низких устойчивых уровнях на хромосомных плечах. Митотические клетки, обработанные ZM447439 быстро теряют фосфорилирование гистона H3 возможно из-за того, что активность Aurora B необходима для поддержания этой модификации в её митотическом состоянии [46].

Aurora B regulation


Активность киназы в отношениит столь многих критических субстратов д. тонко регулироваться. Фактически уровни Aurora B белка регулируются во время клеточного цикла, достигая пика в G2/M. Хотя точное время деградации Aurora B белка ещё не установлено, имеется , по-видимому, существенная потеря энзима после телофазы в культивируемых клетках [79]. Эта деградация м. обеспечиваться с помощью последовательностей в N конце Aurora B, хотя роль survivin и INCENPв стабильности комплекса Aurora B ещё не изучена в деталях. Ферментативная активность Aurora B м. также регулироваться внутри комплекса. IN-box, законсервированный мотив в С конце INCENP, обеспечивает связывание INCENP с Aurora B и стимулирует активность киназы in vitro [30]. In vitro исследования идентифицировали некоторые сайты фосфорилирования с помощью Aurora B в INCENP, хотя их число и функция in vivo ещё не определены [30,80,81]. Survivin также м. играть роль в регуляции активности киназы, снова возможно посредством фосфорилирования [82]. Являются ли эти модификации просто изменениями в сродстве связывания этих белков или вызываются конформационными изменениями, которые затргивают общую активность киназ, неясно. Более того, возникают ли эти модификации внутри комплекса или посредством взаимодействия отдельных молекул комплекса, ещё предстоит установить. Важным компонентом регуляции Aurora B м.б. его динамическое поведение в клетках. Aurora B покидает innercentromere домен в начале анафазы и затем ассоциирует с срединной зоной веретена в телофазе и с midbody



Spatial control of tension: a speculative model for the role of Aurora B–MCAK–PP1 in metaphase chromosome congression. (a) A metaphase cell with INCENP (red) at the inner centromere, PP1 (green) at the outer kinetochore and microtubules (blue) showing distinct spatial separation of the Aurora B complex and PP1 in sister chromatids under tension. YFP-PP1-g cell line kindly provided by Laura Trinkle-Mulcahy. (b) A speculative model postulating that the dynamic interplay between Aurora B, the microtubule destabilizing Kin I kinesin (MCAK) and PP1 could constitute a phosphorylation-dependent tensiometer and could in part explain the dynamic oscillatory behaviour of chromosomes during congression to the metaphase plate. The key to this model is a dynamic, metastable localization of Aurora B. In I and III, the asymmetric localisation of Aurora B on the centromere axis results in asymmetric phosphorylation of factors that promote microtubule dynamics (MCAK?), causing asymmetric force production and thus directional movement of the chromosome. When Aurora B localization shifts, force generation through microtubule depolymerization shifts as well. In the model, Aurora B phosphorylation inhibits microtubule depolymerisation, so the kinetochore distal to Aurora B generates most force. A force-balanced stationary chromosome can occur only transiently (II), unless Aurora B localization becomes fixed between the middle of centromeres or the its kinase activity is inhibited. At anaphase, Aurora B leaves the centromere and force generation can proceed unhindered.

во время циитокинеза [56]. Что запускает эти движения, пока неизвестнро; однако, деградация cyclin B м. играть роль в высвобождении Aurora B [83,84]. Оборот Aurora B на центромере довольно быстрый в прометафазе, но очень медленный в телофазе [57]; что управляет этим сдвигом в сродвтсе связыания, неизвестно. Наблюдаемые эффекты потери cohesin/condensin на локализацию комплекса Aurora B [36,85–87] и наблюдаемые взаимодействия между INCENP и HP1 [88] и INCENP и перицентромерным гистоном H2A.Z [89] указывают на интересное взаимодействие между Aurora B и белками хроматина, которые нуждаются в последующем изучении.
Если Aurora B комплекс дестабилизирует прикрепления микротрубочек к кинетохорам, то его активность д. каким-то образом направляться на моно-ориентировнные хромосомы. Механистическая основа для этого ещё не определена, но она м. б. связана с локальной регуляцией киназной активности. Согласно этой модели киназная активность на моно-ориетированных хромомсомах повышена, тогда как на би-ориентированных хромосомах супрессирована. Т.к. PP1 как известно. противодействует активности Aurora B [22,26–28] и ингибирует её киназную активность [69,90] а также локализуется на кинетохорах [91], то возможно, что эта локальная регуляция м. использовать коммуникации между Aurora B комплексом на внутренних частях центромер и PP1 на кинетохорах. Эта модель представлена на Рис. 4 здесь м. использоваться просто изменения в близости двух энзимов, когда формируется натяжение через кинетохоры [25], приводящие в результате к изменениям в сети фосфорилирования центромерных или кинетохорных субстратных белков или даже к перекрёстной регуляции Aurora B и PP1. Кроме того, точная локализация комплекса внутри центромер м.б. динамической, меняющей динамику микротрубочек асимметрично за счёт кратковременной концентрации ближе к одной из сестринских кинетохор. Если комплекс регулирует активность моторных белков, которые затрагивают динамику микротрубочек, то асимметричная локализация Aurora B м. генерировать асимметрию динамики микротрубочек поперек и тем самым генерировать направляющие силы. Если эта локализация осциллирует, то результатом будут осциллирующие движения хромосом. Правильность идеи нуждается в проверке.

Conclusions


The Aurora kinases represent a fascinating family of molecules whose activities impinge on a large number of critical cell functions. Their discovery has coincided with the development of many new technologies (RNAi, live cell imaging, etc.) that provide functional analyses in many different experimental systems. Experimental progress, especially with the Aurora B complex, has been rapid over the past two years and, if anything, the pace in this exciting field is increasing. These fascinating molecules are revealing not only the intricate details of their own activities, but also critical cellular functions that were previously either unknown or not understood. As we look to the horizon, we see the Auroras shining brightly and coming into focus.
Сайт создан в системе uCoz