Functional stoichiometry and local enrichment of calmodulin interacting with Ca2+ channels. Science 304, 432–435 (2004) | |
The figure shows a cartoon that illustrates the principle of a genetically encoded biosensor for calmodulin situated locally at the very mouth of a Ca2+ ion channel. Calmodulin is a key Ca2+ feedback sensor in human biology, and Ca2+ fluctuations are a lingua franca of life at the molecular/cellular level. The sensor detects a surprisingly elevated concentration of calmodulin within the nanodomain of Ca2+ near single Ca2+ ion channels. The implication is that there may be a ‘school’ of calmodulin molecules within earshot of the local Ca2+ signal of a single channel. This arrangements could substantially diversify or amplify local channel signaling to intracellular processes like gene transcription.  (Рис.1.Рисунки из статьи Budde, T.et al. , 2002) | Electrophysiological hallmarks of the CDI of VGCCs.  (Рис.2.) | Inactivation profile of VGCC subtypes in central neurons.  (Рис.3.) | Regulation of L-type Ca2+ channels by Ca2+ and phosphorylation–dephosphorylation reactions.  (Рис.4.) | Model of CDI induction by CaM in CaV1.2 Ca2+ channels.  (Рис.5.) | Model of CDI and CDF induction by CaM in CaV2.1 Ca2+ channels.  (Рис.6.) | Schematic overview of the main mechanisms leading to and influencing CDI in central neurons. |
Сколько молекул калмодулина calmodulin (CaM) выключают кальциевые каналы? Это похоже на плохую шутку, но авторы работы взялись за решение этого вопроса, используя каналы, соединенные с CaM молекулами и получили ответ.
CaM взаимодействует с кальциевыми каналами, выполняя две функции: он опосредует кальций зависимую инактивацию каналов и преобразует сигнал от входящего кальция через каналы в различные внутриклеточные сигнальные пути. Авторы слили CaM молекулы с L-типом кальциевых каналов для изучения стехиометрии этих процессов.
В отсутствии кальция CaM молекулы связывались с L-типом кальциевых каналов. Когда позже кальций входил через канал и взаимодействовал с CaM, канал инактивировался.
Авторы использовали полиглициновые линкеры для соединения инактивированного мутантного CaMmut с каждым кальциевым каналом L-типа, основываясь на том принципе, что CaMmut будет действовать доминантно-негативно и предотвращать CaM дикого типа от соединения с каналом. Channal-CaMmut химеры не подвергались кальций-зависимой инактивации, но каналы сливались с CaM дикого типа, указывая на то, что слившийся CaM важен для инактивации.
Для проверки того, нужны ли другие CaM молекулы для инактивации, авторы подвергли сверхэкспрессии свободный CaMmut вместе с L-типом кальциевых каналов. Неслившиеся каналы не обнаружили инактивации при таких условиях, из-за того, что CaMmut закрывал участок связывания и предотвращал CaM дикого типа от инактивации канала. Однако каналы, которые сливали с CaM дикого типа имели нормальную инактивацию, что свидетельствует о том, что единственной CaM молекулы достаточно и необходимо для кальций-зависимой инактивации.
Далее авторы исследовали локальную концентрацию эндогенного CaM вокруг каналов. Они использовали особенности и преимущества вариабельной длины полиглициновых линкеров. При использовании короткого линкера CaMmut полностью перекрывала пре-ассоциативные сайты и кальций-зависимая инактивация блокировалась. При использовании длинного линкера локальная концентрация CaMmut падала, позволяя эндогенному CaM достичь пре-ассоциативного сайта и опосредовать кальций-зависимую инактивацию. Такой эффект можно использовать для установления локальной концентрации эндогенного CaM вблизи каналов. Авторы подсчитали, что уровень локального эндогенного CaM в пре-ассоциативном локусе был около 2.5 mM – гораздо выше, чем в клетке целиком.
Такое локальное обогащение CaM вблизи кальциевых каналов L-типа позволяет кальцию вливаться в один канал, чтобы активировать много CaM молекул. Поэтому либо многие сигнальные пути могут быть активированы, либо единственный путь может быть амплифицирован.
Эти взгляды на стехиометрию регуляции каналов и сигнализирование посредством CaM будет способствовать нашему пониманию механизмов, посредством которых CaM выполняет эти функции. Подход с использованием связывания молекул для изучения их взаимодействия может также быть ценным методом для исследований в других областях. Budde, T.et al. Calcium-dependent inactivation of neuronal calcium channels. Nature Rev. Neurosci. 3, 873–883 (2002) (См. рисунки из этой статьи) |