Посещений:
Аппарат Гольджи

Субкомпартментализация

Subcompartmentalizing the Golgi apparatus
Manojkumar A Puthenveedu and Adam D Linstedt
Current Opinion in Cell Biology 2005, 17:369–375

The sub- compartmentalized structure of the Golgi apparatus contributes to efficient glycosylation in the secretory pathway. Sub- compartmentalization driven by maturation relies primarily on constant and accurate vesicle-mediated local recycling of Golgi residents. The precision of this vesicle transport is dependent on the interplay between the key factors that mediate vesicle budding and fusion — the coat proteins and the SNARE fusion machinery. These alone, however, may not be sufficient to ensure establishment of compartments de novo, and additional regulatory mechanisms operate to modify their activity.
Стабильность и функциональное разнообразие многих вновь синтезированных белков в секреторном пути зависит от аккуратных реакций гликозилирования, осуществляемых энзимами, расположенными в аппарате Гольджи. Аппарат Гольджи млекопитающих представляет собой субкомпартмернтализованную структуру, которая оптимизирует условия этих реакций.

Subcompartmentalization ensures optimal processing conditions in the Golgi apparatus


Добавление боковых цепочек glycan является упорядоченным процессом, в котором каждая ступень зависит от успешного завершения предыдущей ступени. Локализация ответственных энзимов отражает это. Golgi энзимы присутствуют в биохимически самостоятельных мембранных компартментах, называемых цистернами, которые уложены в штабеля (stacked) определенным образом. Рано действующие энзимы концентрируются в cis cisternae, a позднее действующие энзимы последовательно увеличены в количестве в медиальных и транс цистернах. Это напоминает конвейерную линию сборки, которая позволяет проходящим белкам встречаться с энзимами последовательно.
Относительная локализация Golgi энзимов по отношению др. к др. влияет на их доступ к субстратам и диктует структуру glycans, формируемых in vivo [1]. Степень, с которой последовательное воздействие увеличивает эффективность процессинга, однако, неясна. In vivo, Golgi субкомпартментализация может быть расстроена с помощью насильственного перераспределения Golgi энзимов в endoplasmic reticulum (ER). В этих условиях гликозилирование сильно нарушается, даже если энзимы сами по себе остаются активными [2]. Заслуживает внимания, однако, то, что перераспределенные Golgi энзимы оказываются существенно разбавленными по сравнению с огромным большинством энзимов ER мембран. Более того, когда субстраты подвергаются воздействию смеси энзимов in vitro, гликозилирование достигает в конечном итоге своего завершения, хотя и очень медленно [3]. Т.о., помимо гарантии последовательного воздействия, распределение Golgi энзимов по субкомпартментам может позволять каждому субкомпартменту достигать высоких концентраций индивидуальных наборов энзимов. необходимых для эффективной активности. Субкомпартментализация делает также возможными градиенты pH, липидов и ионов поперек штабелей Гольджи. По отношению к процессингу, такие градиенты создают определенные преимущества, т.к., напр., cis-Golgi энзимы могут оперировать в оптимизированных условиях, которые далеки от того, чтобы быть оптимальными для trans-Golgi энзимов. Итак, субкомпартментализация, по-видимому, гарантирует оптимальные условия для биосинтетического процессинга in vivo потом обеспечения последовательной обработки субстрата, оптимизированных концентраций энзимов и самостоятельных реакционных условий. Т.к. белки проходят через аппарат Гольджи быстро, то имеется лишь ограниченное время для контакта с энзимами, и высокая эффективность процессинга, обеспечиваемая субкомпартментализацией важна для предупреждения серьёзных изменений профилей гликозилирования биосинтетических белков.

Subcompartmentalization depends on accurate inter-cisternal vesicle transport mediated by coats and SNAREs


Были предложены две модели для объяснения, как субкомпартментализация Golgi поддерживается. Первая, названная моделью стабильных компартментов, предполагает, что цистерны являются стабильными единицами, содержащими энзимы и что пузырьки избирательно транспортируют проходящие белки вперед через Гольджи [1]. Вторая модель, названная моделью созревания, предполагает, что цистерны Golgi постоянно зреют в более поздние компартменты путём диспозиции своих энзимов, благодаря приёму новых кагорт энзимов из дистальных цистерн [4]; транспорт энзимов между цистернами осуществляется посредством активной сортировки в пузырьки. Молекулы груза могут в таком случае последовательно подвергаться воздействию энзимов, так что путешествие вперед осуществляется не покидания цистерны, в которыую они поступили в начале.
Имеются существенные повреждения обеих моделей, которые хотя концептуально и различны, не являются взаимно исключающими [5]. Независимо от этого, однако, ключевым событием, которое поддерживает субкомпартментализацию, является аккуратный перенос специфических компонентов между цистернами. Это начинается с обеспечиваемой покровными белками сортировки необходимых белков в пузырьки, которые формируются в донорском компартменте. Просто предположим, что белки, которые обладают сродством к оболочечным белкам, будут концентрироваться в отпочковывающихся пузырьках, тогда как др. будут относительно менее многочисленны.
Имеются две самостоятельные оболочки (coats) в ранних секреторных путях, обе из которых существенно влияют на субкомпартментализацию Golgi [6]. Coatomer protein II (COPII) оболочки формируется за счёт последовательного привлечения GTP-связанного Sar1, Sec23/Sec24 комплекса и Sec13/Sec31 комплекса, обеспечиваемого экспортом из ER путём образования пузырьков из ER мембран. Coatomer protein I (COPI) оболочки обеспечивает большую часть везикулярного транспорта между Golgi цистернами. GTPase Arf1 инициирует образование COPI пузырьков, т.к. она рекрутирует 7 COPI субъединиц, необходимых для образования почек пузырьков. В обоих случаях отшнуровка пузырьков сопровождается гидролизом GTP с помощью соотв. GTPases, обеспечивая в результате uncoating пузырьков. Пузырьки затем подвергаются целенаправленному воздействию для специфического слияния с их акцепторными компартментами, которое осуществляется посредством образования комплекса между локализованном на пузырьке v-SNARE и целенаправленно локализованным t-SNARE [1]. Плотный из 4-х спиралей SNARE пучок, который обусловливает притягивание пузырька и мембран мишени др. к др. и обеспечивает энергией для перестройки липидных бислоёв во время слияния. Он также вносит вклад в обязательную специфичность слияния, т.к. это базируется на специфическом распознавании и связывании родственных v- и t-SNAREs [7].
Взаимодействия между оболочками и SNAREs гарантируют потенциал слияния пузырька во время его собственного отшнуровывания. Хотя COPII и COPI оболочечные комплексы структурно и функционально отличны, но оба действуют, концентрируя v-SNAREs в пузырьках. Мутационный анализ COPII оболочки идентифицировал самостоятельные сайты связывания для разных белков, включая SNAREs, в его sec24 субъединице [8]. Далее структурные исследования SNARE-sec24 взаимодействий показали, что sec24-связывающие мотивы на SNAREs могут быть спрятаны в four-helical SNARE пучке, который образуется во время слияния. Это приводит в результате к тому, что sec24 имеет более высокое сродство к свободным (и , следовательно, fusogenic) SNAREs [9,10]. В случае COPI оболочки, SNAREs могут формировать часть кухни (machinery), которая рекрутирует оболочечные белки и инициирует отпочкование пузырьков. Golgi-локализованные SNAREs связывают GTPase активирующий белок ARFGAP и затем задействуют GTPase Arf1 [11,12]. Соединение SNAREs с активированным Arf1-GTP может помочь стабилизировать последний на мембранах, чтобы рекрутировать COPI компоненты оболочки. Включение v-SNAREs в пузырёк может затем обеспечиваться с помощью непосредственного взаимодействия с оболочечными белками [11]. Т.о., сортировка факторов слияния с помощью оболочки может детерминировать судьбу и мишень пузырьков и влиять на перенос белков между компартментами.

A subcompartmentalized Golgi may be generated de novo from the ER


Хотя точная степень, с которой созревание вносит вклад в forward транспорт груза in vivo всё ещё не установлена, однако недавние данные указывают на то, что постоянное созревание является критическим для поддержания субкомпартментализации Golgi. Интересны эксперименты, которые анализируют взаимоотношения Golgi к ER. Блокирование экспорта из ER приводит к перераспределению всех Golgi residents, изученных в этом отношении, в ER, это указывает на то, что Golgi участвует в поддержании динамического равновесия с ER скорее, чем выступает в качестве стабильной единицы [13]. Интересно, что обратный ER экспорту блок позволяет клетке генерировать субкомпартментализованный аппарат Гольджи de novo [14]. Этот процесс может представляться как продолжение дискретных ступеней с отдельными молекулярными потребностями. Во-первых, Golgi белки концентрируются и экспортируются из ER с помощью COPII пузырьков, которые образуют pleiomorphic мембранные структуры, называемые vesicular tubular clusters (VTCs), известные также как ER Golgi промежуточный компартмент. Во-вторых, субкомпартменты генерируются из не компартментализованных VTC, как это было показано с помощью сегрегации cis, medial и trans Golgi белков. В-третьих, эти компартментализованные структуры затем транспортируются вдоль микротрубочек к центру клетки, где на четвертой ступени они сцепляются, чтобы сформировать одиночную околоядерную Golgi ленту. Т.к. две первые ступени непосредственно участвуют в субкомпартментализации, то необходимо сконцентрироваться на механизмах, которые обеспечивают эти реакции.

Generation of Golgi subcompartmentalization by maturation and local recycling


Во время de novo биогенеза Golgi, COPII пузырьки обеспечивают инициальную концентрацию и экспорт Golgi белков из ER. Повторяющиеся раунды слияний COPII пузырьков генерируют VTCs, которые далее концентрируют Golgi белки путём рециклинга заловленных ER белков обратно в ER [15,16]. Компартментализация может стартовать с сортировки cis Golgi белков от др. с помощью COPI пузырьков. Эти пузырьки сливаются с вновь организованными COPII пузырьками или VTCs, и тем самым обогащают их cis элементами. Затем, medial Golgi белки отсортировываются в пузырькит, которые сливаются с цис-обогащенными VTC, что позволяет им созревать. Как показано на Рис. 1, такой повторяющийся локальный рециклинг постояльцев (residents), индуцированный с помощью COPI покровов имеет высокое сродство к ранним Golgi белкам и пониженное сродство к более поздним компонентам, может инициировать компартментализацию [16-18]. Недавние морфологические доказательства подтверждают, что экспорт из ER может происходить даже в зонах, лишенных COPII пузырьков посредством тубулярных выростов, которые дифференцируются в зрелые VTCs [19]



De novo generation of Golgi subcompartments by iterative local recycling. The model assumes that cis enzymes are the most efficiently recycled while trans enzymes are the least. Local recycling, as opposed to recycling via the ER, allows maintenance of Golgi subcompartments [17].

Компартментализация, управляемая с помощью созревания, может в дальнейшем получить помощь в виде склонности сродства COPII к разным Golgi белкам. Ранние (cis) Golgi белки, по-видимому, первыми экспортируются, а инициальные VTCs генерируются обогащенные ими [20,14]. Это указывает на то, что cis компартменты генерируются рано во время биогенеза, за ними следуют более поздние компартменты. Согласуется с этим и сегрегация между cis Golgi белком GM130 и medial Golgi энзимом Mannosidase-II , наблюдаемая очень рано во время биогенеза Golgi biogenesis [14].
Непрерывное созревание и локальный рециклинг могут также поддерживать субкомпартментализацию в устойчивом состоянии. В самом деле, т.к. VTCs д. быть обеднены (de-enriched) по Golgi компонентам, то этот процесс скорее всего будет наиболее эффективным. Далее, COPII, склонные в отношении cis-Golgi residents будут гарантировать, что приток в Golgi из ER будет обогащен ранними компонентами, которые способствуют субкомпартментализации.

Mechanisms of local recycling


Как поддерживается точность локального рециклинга? Одной из возможностей является то, что разные оболочки обладают разным сродством к разным SNAREs [10]. Разнообразие в специфичности грузов для COPII и COPI оболочек может быть достигнуто за счёт их существования как мультимерных самостоятельных гетеромеров, отличающихся своими субъединицами, связывающими груз. Согласуется с этим то, что клетки млекопитающих имеют, по крайней мере, 4 изоформы субъединицы sec24 для COPII [21]. Также белки Lst1p и Sfb2p, как было установлено, замещают Sec24p у дрожжей, чтобы сформировать COPII пузырьки с разными специфичностями к грузам [22-24]. Сходные замены изоформ были постулированы для образования COPI coat комплексов [25]. Будучи скоординированной дифференциальная сортировка достигаемая с помощью таких гетеромеров, д. служить концентрации специфических SNAREs в разных компартментах и генерировать градиенты концентраций SNARE вдоль секреторного пути. Это в свою очередь д. диктовать специфичность белка, переносимого через компартменты и помогать поддерживать субкомпартментализацию Golgi (Figure 2).
В соответствии с предсказаниями модели, по крайней мере, три специфических набора SNAREs д. участвовать в трафике между ER и Golgi. Во всяком случае, t-SNARE состоит из трех отдельных белков, которые образуют три из 4-х спиралей. Syntaxin5, если комплексуется с sec22 и membrin, то формирует t-SNARE, который взаимодействует специфически с v-SNARE bet1. Если же комплексуется с GOS28 и Ykt6, то Syntaxin5 формирует t-SNARE, который соединяется с GS15 [26,27]. Эти два набора v-t-SNARE могут обеспечивать слияние COPII, чтобы формировать VTCs, и слияние локально recycling COPI пузырьков, соотв. [27,28]. Ретроградные пузырьки, которые сливаются с ER, как полагают, содержат v-SNARE Sec20, который соединяется с t-SNARE комплексом из Ufe1, Sec22 и Slt1 [29]. Тщательный анализ сортировки этих SNAREs с помощью разных оболочек позволит нам пролить свет на обоснованность градиентной модели SNARE.
В Golgi, локальный рециклинг может быть усилен за счёт удержания пузырьков в локальной среде путём дополнительного слоя белковых взаимодействий, которые закрепляют эти пузырьки в акцепторном компартменте. Т.к. предполагается, что длины таких 'привязей' пузырьков больше, чем расстояние между цистернами, то вполне возможно, что привязи устанавливаются еще до завершения отшнуровки пузырьков. Привязи могут т.о. делать возможным направленный транспорт между цистерн, используя одиночный набор SNAREs.
Два класса белков, как было предположено, формируют привязи COPI пузырьков. Первый принадлежит к семейству golgin длинных супер-скрученных белков. Исследования белковых взаимодействий и закрепления пузырьков в доках, осуществленные in vitro подтверждают, что giantin, который присутствует на пузырьках, может быть сцеплен с ассоциированным с мембраной GM130 посредством docking фактора p115, и что формирование таких привязей является предварительным условием для слияния [30-32]. Недавно было также отмечено, что



Hypothetical scheme for compartmentalization based on different affinities of coats for various SNARES and guanine nucleotide exchange factors (GEFs), resulting in distinct concentration gradients of proteins. Each compartment (ER, cis, trans, PM) is marked by an enriched GEF (labeled G1-G5), and an enriched t-SNARE (T1-T5). The GEF determines coat formation by a corresponding coat (C1-C5), which mediates the sorting of specific v-SNAREs (V1-V5) into vesicles. Cognate t-SNAREs define the acceptor compartment for vesicles. Homotypic fusion, recycling and homeostatic mechanisms, defined by the same rules, allow, in principle, the de novo generation of the cis and trans compartments from the ER and PM. This requires that the coats sequester SNAREs on compartments and activate specific SNAREs for fusion during vesicle formation. Concentration gradients of the components that will be generated by such a system are indicated at the top of the figure.

пузырьки, содержащие golgin-84, удерживаются на слайдах, покрытых giantin-родственным белком CASP [33]. На основании относительного обилия Golgi энзимов и относительного истощения маркёров forward груза в CASP-связывающих пузырьках, в противоположность p115-связывающим пузырькам, было предположено, что самостоятельные привязи могут диктовать направленность (directionality) COPI пузырьков. Интересно, что и giantin и golgin-84 присутствуют в обоих классах пузырьков. Хотя, если такие привязи должны предопределять мишени для слияния, то дополнительные механизмы д. селективно активировать/инактивировать один из компонентов привязи, ассоциированной с пузырьком.
Основным недостатком модели, базирующейся на golgin привязи, является то, что доказательства in vivo строго аргументируют против необходимой роли любой из этих привязей для слияния пузырьков с субкомпартментализации Golgi. Истощение giantin, GM130 или golgin-84 в интактных клетках не вызывает ни обильного накопления происходящих из Golgi пузырьков, ни коллапса субкомпартментов Golgi [34-36]. Достоверно, p115 необходим для слияния пузырьков и для субкомпартментализации Golgi [34,37]. Однако, механизм действия p115 использует его SNARE-связывающий домен, а не его giantin или GM130-связывающие домены [37]. Т.о., сегодня очевидно, что p115 может быть регулятором SNARE скорее, чем везикулярных привязей.
С др. стороны, in vivo данные подтверждают участие крупных мультибелковых комплексов в привязывании Golgi пузырьков [38]. Истощение COG3, субъединицы COG комплекса, который взаимодействует с COPI и Golgi SNAREs, вызывает очевидное накопление происходящих из Гольджи пузырьков, содержащих специфические белки, включая и v-SNAREs [39]. Сходным образом, у дрожжей комплекс TRAPP, который непосредственно соединяется с COPII пузырьками, м. привязывать их к аппарату Golgi [40].
Инициальные стадии биогенеза de novo Golgi создают несколько проблем для локального рециклинга. Только что отпочковавшиеся пузырьки, содержащие активный v-SNARE имеют множество потенциальных сайтов для связывания на ER. Что же предупреждает такое бесполезное обратное слияние пузырьков? Также и компартменты сами по себе имеют активные SNAREs, что же удерживает их от слияния др. с др.? Сходные вопросы возникают относительно состояния устойчивости везикулярного транспорта, т.к. SNAREs подвергаются рециклингу для участия во множественных раундах слияний. Очевидным решением является удерживание SNAREs неактивными до тех пор, пока не наступит специфическая реакция слияния. Мembrane-proximal 'переключение', которым необходимо щелкнуть, чтобы сделать их компетентными к слиянию, было идентифицировано на t-SNAREs [41,42]. Пост-трансляционные модификации, такие как фосфорилирование и дополнительные белки, такие как GATE-16 и LMA1, которые переносятся на свободные SNAREs с помощью NSF [43,44], также могут удерживать SNAREs от участия в нежелательных слияниях. Специфическая роль в предупреждении обратного слияния COPII пузырьков с ER приписывается Tip20, SNARE-подобному белку, который взаимодействует с ретроградным ER SNARE комплексом [45].
Интересно, что присутствие пятого SNARE может предотвращать образование fusogenic SNARE комплексов [46]. Возможно, что рециклинг SNAREs действует подобным образом, как ингибирующие молекулы или i-SNAREs, которые предупреждают неспецифические слияния. Они могут позденее секвестрироваться прочь от ассоциированных с мишенями белков, делая возможным специфическое слияние. Удивительно, но cis Golgi SNAREs ингибируют слияния, обусловленные с помощью trans Golgi SNAREs и vice versa. Такая автоматическая генерация комплементарных градиентов i-SNAREs гарантирует градиентам из fusogenic активных SNAREs, быть ниже активных градиентов благодаря их концентрациям.
Т.к. uncoating пузырьков является предварительным условием для слияния, то это может быть тем самым случаем, который покрывает оболочкой секвестрируемые SNAREs и ингибирует бессмысленное слияние пузырьков. Такая секвестрация, если она происходит на компартментах, может быть механизмом, который предупреждает их неразборчивое слияние др. с др. В согласии с этим то, что разборка COPI значительно медленнее на плоских мембранах, в противоположность пузырькам [47]. Кроме того покровные белки сами по себе могут также активировать специфические v-SNAREs и инактивировать все др. recycling SNAREs во время образования пузырьков, гарантируя тем самым только один потенциал для SNARE пары на пузырёк (Рис. 2).

Comparison to post-mitotic Golgi reassembly


Большинство доказательств подтверждает, что во время митозов аппарат Гольджи млекопитающих превращается в популяцию многочисленных пузырьков, которые диспергируют по метафазной клетке. После цитокинеза каждая дочерняя клетка затем восстанавливает компартментализованный аппарат Гольджи. Согласно одному сценарию во время митоза кухня слияния пузырьков в Гольджи ингибирована, тогда как формирование пузырьков продолжается. однако, необходимо обратить внимание, что необходимые роли в разборке аппарата Гольджи или по ингибированию tether/SNARE или функции COPI, еще необходимо продемонстрировать [48]. Если это так, то эти реакции д. конвертировать Golgi штабеля в самостоятельные наборы пузырьков, которые сохраняют свои интерфазные субкомпартментное богатство и программирование для целенаправленного слияния. Т.о., во время пост-митотической повторной сборки пузырьки, которые оригинально происходили из cis Golgi, и которые содержали cis Golgi residents, будут сливаться со вновь генерируемыми VTCs, управляя тем самым созреванием VTCs. Дальнейшее созревание за счёт оставшихся пузырьков и инициация локального рециклинга д. затем создавать более поздние субкомпартменты. Согласно этому мнению постмитотическая сборка аппарата Гольджи по существу использует те же самые ступени и механизмы как и при поддержании устойчивого состояния Golgi и de novo Golgi биогенеза из ER. Т.к. инициальное распределение Golgi компонентов в ER, пузырьках и Golgi элементах отличается существенно в этих трёх состояниях, то мощный гомеостатический механизм д. участвовать в становлении собственно организации Golgi из разных стартовых точек.

Conclusions


Efficient incorporation of newly synthesized or cycling Golgi proteins during ER exit, followed by active sorting of earlier components into retrograde vesicles to allow iterative local recycling, might suffice to create and maintain a subcompartmentalized Golgi apparatus. The accuracy of local recycling might be achieved by SNARE gradients generated by differential affinities of coats, with additional fine control provided by SNARE-interacting proteins that regulate aspects of the SNARE association– dissociation cycle. Further elucidation of the interplay between coats and SNAREs will help us establish the minimal systemrequired to generate subcompartments in the Golgi.
Сайт создан в системе uCoz