Гомологичная Рекомбинация (HR) и Факторы Соединения Негомологичных Концов (NHEJ)
Mills, K. D. et al. Rad54 and DNA ligase IV cooperate to maintain mammalian chromatid stability. Genes Dev.18, 1283–1292 (2004)
Couedel, C. et al. Collaboration of homologous recombination and non-homologous end-joining factors to the survival and integrity of mice and cells. Genes Dev.18, 1293–1304 (2004) |
DNA double-strand break (DSB) repair occurs by at least two distinct pathways — homologous recombination (HR) and non-homologous end-joining (NHEJ). Both pathways are clearly important for maintaining genome stability, but little is known about how they are coordinated. Now, two papers in Genes & Development show that the pathways might collaborate in the repair of DSBs that arise after DNA replication.
Мыши, лишенные NHEJ-специфического фактора DNA ligase IV () имеют хорошо выраженный мутантный по репарации фенотип, в то время как нехватка по фактору HR обусловливает более слабый фенотип. Mills et al. создали двойных мутантных мышей, у которых отсутствовал и Rad54 и Lig4, чтобы изучить взаимоотношения между HR и NHEJ при репарации DSB. Они установили, что эмбриональные фибробласты, которые происходили от таких мышей, обнаруживали тяжелые пролиферативные дефекты по сравнению с клетками, происходящими или от Rad54 или Lig4 одиночных мутантных мышей.
Чтобы проверить, может ли этот дефект пролиферации обусловливать высокие уровни DSBs, акт. проводили иммунофлюоресцентные эксперименты, чтобы выявлять фосфорилированные варианты гистона-H2A (γ-H2ax), который является маркёром присутствия DSBs. Почти 100% клеток двойных мутантов содержали γ-H2ax фокусы, по сравнению с 50% клеток Lig4-/-.
Т.к. нехватка p53 м. восстанавливать пролиферативные дефекты у двойных мутантов, то Mills et al. использовали клетки от тройных мутантов, которые были также дефектны по p53 для изучения хромосомных аномалий. Уровень хромосомной и хроматидной нестабильности в Rad54-/-p53-/- был низким по сравнению с существенно увеличенным уровнем хромосомных разрывов в клетках Lig4-/-p53-/-. Клетки тройных мутантов обнаруживали ещё более высокий уровень фрагментированных хросомом, а также значительно более высокую пропорцию разрывов сестринских хроматид. Высокая пропорция разрывов одиночных хроматид в клетках, которые дефицитны и по Rad54 и по Lig4, сравнима с таковой при дефиците каждого из них в отдельности, указывая тем самым на кооперативную роль обоих путей в пост-репликативной репарации DSB.
Использовав сходный подход, Couedel et al. генерировали двойных мутантных мышей, у которых были скомбинированы HR мутация Rad54 с хорошо выраженной мутацией по NHEJ . При рождении выживало знчительно меньше мышей с двойной мутацией по сравнению с мышами, мутантными только по Ku80. Эта потеря жизнеспособности продолжалась в течение всей жизни и к возрасту 7 мес. выживало более чем в 10 раз меньше двойных мутантов, чем одиночных Ku80 мутантных мышей.
Rad54-/-Ku80-/- мыши оказались гиперчувствительными к низким дозам ионизирующей радиации, тогда как к тем же самым дозам мыши Ku80-/- среде выраженную чувствительность. Кроме того, двойные мутанты обнаруживали достоверно повышенный уровень DSBs, так более 90% эмбриональных фибробластов от Rad54-/-Ku80-/- мышей содержали γ-H2ax фокусы и большинство из них содержали большие количества фокусов, нехарактерные для клеток одиночных мутантов.
Итак, HR и NHEJ пути важны для выживания и геномной интеграции и, по-видимому, функционируют синергично в репарации DSBs. Теперь важно установить источник этих DSBs, чтобы понять как HR и NHEJ сотрудничают в поддержании стабильности генома.