David L. Vaux & John Silke Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 287-297 (2005); doi:10.1038/nrm1621
The inhibitor of apoptosis (IAP) proteins all contain one or more baculoviral IAP repeat motifs, through which they interact with various other proteins. Many IAPs also have another zinc-binding motif, the RING domain, which can recruit E2 ubiquitin-conjugating enzymes and catalyse the transfer of ubiquitin onto target proteins. The number of targets of IAP-mediated ubiquitylation is increasing and recent results indicate that outcomes following ubiquitylation are tantalizingly complex. As well as regulating other proteins, the IAPs themselves are controlled by ubiquitin-mediated degradation.
Рис.1. | A selection of inhibitor of apoptosis (IAP) proteins.
Рис.2. | RING-containing E3 ligases often have a conserved multisubunit composition.
Рис.3. | Inhibitor of apoptosis (IAP) interactions
Рис.4. | An abundance of inhibitor of apoptosis (IAP) binding and ubiquitylation.
Рис.5. | Ubiquitylation of components of tumour necrosis factor (TNF) signalling complex
Boxes
Box 1 | Caspases
Caspases, so-called because they cleave their substrates after an aspartate using a catalytic cysteine, are essential effector proteases of programmed cell death or, in some cases, of an inflammatory response. They are believed to be present in most living metazoan cells as ZYMOGENS that become activated by oligomerization or processing. Upstream caspases, which usually contain long prodomains, become activated by oligomerization that is promoted by an adaptor molecule. This activation might result in autoprocessing, although this is not required for upstream caspase activation and has little effect on catalytic activity116. Downstream caspases, which contain a short prodomain, can be activated by proteolytic processing, usually by an upstream caspase. In some cases, it is clear that, once activated, downstream caspases can proteolytically process upstream caspases in vivo117. In the case of caspase-9, oligomerization-induced autoprocessing results in a form of caspase-9 that binds to, and can be inhibited by, XIAP (X-chromosome-linked IAP). Further processing of caspase-9 by the downstream caspase-3 results in a form of caspase-9 that cannot be inhibited by XIAP, which provides a rationale for the processing of upstream caspases by downstream caspases34.
Box 2. | Ubiquitylation of substrates requires a multi-enzyme cascade
Xu, P. et al. Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation. Cell 137, 133–145 (2009)
Ubiquitin имеет 7 Lys остатков, каждый из которых вносит вклад в сборку polyubiquitin цепочек на белковом субстрате. Lys48-сцепленная цепочка ведет к деградации белка, а Lys63-цепочка участвует в не-протеолитических событиях, но роли др. 'unconventional' polyubiquitin цепочек неясны. Junmin Peng с коллегами сообщают, что все не-Lys63-сцепленные polyubiquitin цепочки направляют белки на протеосомную деградацию. Более того, они показали, что Lys11-сцепленные цепочки функционируют в с endoplasmic reticulum (ER)-associated degradation (ERAD) - путем качества контроля, благодаря которому неправильно упакованные или неправильно собранные белки в ER biquitylated и деградируют с помощью 26S протеосом.
Используя mass spectrometry (MS) у дрожжей авт. установили высокие уровни этих цепочек (особенно тех, что связаны с Lys11) в широком круге субстратов. Уровни этих цепочек, также как и Lys48-сцепленных цепочек, увеличиваются, когда 26S протеосомы ингибируются химически или генетически, тогда как уровень Lys63-сцепленных цепочек не затрагивается (что и ожидалось исходя из хорошо известных не-протеолитических функций Lys63-сцепленных цепочек). Эти результаты указывают на то, что все не-Lys63-сцепленные polyubiquitin цепочки обеспечивают протеосомную деградацию.
Если неконвенционные polyubiquitin цепочки направляют белки на деградацию, то молекула ubiquitin этих цепочек может поступать в оборот за счет активности deubiquitylating энзимов (DUBs), которые ассоцирют с 26S протеосомами. В самом деле, авт. установили, что все unconventional цепочки отщепляются с помощью ассоциированных с протеосомами DUBs in vitro.
У дрожжей мутация ubiquitin Lys48 летальна, но Lys48 сам по себе недостаточен, чтобы обеспечить жизнеспособность, если др. остатки Lys мутантны. Итак, unconventional polyubiquitin цепочки обладают важными физиологическими функциями. Отметим, что путем комбинирования множественных ситуаций цепочки формирующих Lys остатков, авт. установили, что unconventional цепочки имеют частично перекрывающиеся функции.
Используя количественный MS, Peng с сотрудниками искали субстраты, сцепленные с Lys11 polyubiquitin цепью по всему протеому дикого типа и в линиях. мутантных по ubiquitin Lys11. Среди прочих субстратов они идентифицировали Ubc6, ubiquitin-conjugating энзим, который участвует в ERAD. Мутации в ubiquitin Lys11 существенно снижали скорость оборота Ubc6, и Lys11 мутантные клетки обнаруживали повышенную чувствительность к агентам, индуцирующим ER стрессы, и повышенную реакцию на неупакованные белки. Итак, Lys11-сцепленные polyubiquitin цепочки действуют в событиях ubiquitylation, которые связаны с ERAD.
Учитывая широкий спектр белков, которые изменяются у Lys11 мутантов, Lys11-сцепленные polyubiquitin цепочки, скорее всего, участвуют во многих физиологических процессах. Специфические функции разных ubiquitin цепочек в разных процессах могут быть приобретены во время конъюгации, распознавания с помощью ubiquitin рецепторов и разборки с помощью DUBs
.
Inhibitor of apoptosis (IAP) были впервые идентифицировны в baculoviruses1. Все IAPs, включая и вирусные, а также их клеточных гомологов у беспозвоночных и позвоночных содержат 1–3 BACULOVIRAL IAP REPEAT (BIR) мотива (Рис. 1a). Характерная для BIR складка содержит ион цинка, который координируется с помощью одного гистидина и трех цистеиновых остатков2. BIR домены некоторых IAPs позволют им связываться с и ингибировать протеазы, caspases, которые дирижируют апоптической деструкцией клеток (Box 1). Прямое ингибирование каспаз, дает простейшее объчснение того, как IAPs препятствуют апоптозу. В некоторых случаях IAP-обуслолвенное ингибирование может быть предупреждено за счет антогонистов IAP, которые соединяются с доменами BIR у IAPs. Но др. домен IAP — домен RING у Drosophila melanogaster IAP (DIAP1) — как было впоследствии показано, участвует в регуляции апоптоза у мух in vivo3,4 (Рис. 1a,b). Т.к. большинство IAP гомологов бакуловирусов и клеток содержат домены RING помимо BIRs, то они привлекли внимание к их роли в регуляции клеточной гибели с помощью IAPs.
RING домены соединяются с (UBCs). Это позволяет RING-домен-содержащим белкам рекрутировать E2 и катализировать перенос ubiquitin с E2 на субстрат5-7. Это открывает возможность того, что домен RING м. позволять IAPs polyubiquitylate белки, которые взаимодействиуют с ними непосредственно, такие как каспазы и направлять их на деградацию с помощью . Но IAPs соединяются также и с др. молекулами также как и с каспазами, и следовательно обадают потенциалом убиквитилировать многие субстраты, включая самих себя. Такое убиквитилирование м. направлять IAPs или др. взаимодействующие с IAP белки на деградацию или м. специфически менять их активность определенным образом.
Здесь будет рассмотрена функция домена RING у IAPs. Мы представим обзор биологии , энзима, который конъюгирует ubiquitin с белками субстрата, его связь с IAPs, и рассмотрим доказательства убиквитилирования субстрата с помощью IAPs и значение этих событий для защиты от апоптоза.
IAP proteins
Любой белок, который содержит мотив BIR, относят к семейству IAP. Но это м. приводить к неправильным послествиям, т.к.некоторые BIR-домен-содержащие белки, такие как survivin/BIRC5 млекопитающих и его гомологи у дрожжей и беспоозвоночных, не ингибируют апоптоза. Большое количество данных in vivo показывают, что эти IAPs регулируют сегрегацию хромосом во время митозов 8. Следовательно, белки с BIRs м. также обозначаться как BIRCs
— 'BIR-containing' белки. IAPs/BIRCs имеют 1–3 BIRs, при этом первый домен BIR расположен вблизи N конца белка. IAPs/BIRCs с четко определенными ролями в апоптозе содержат также высоко консервативные на своих C концах (Рис. 1a,b).
Living up to their name.
Наиболее строгие доказательства того, что определенные IAPs являются важными регуляторами запрограммированой клеточной гибели, получены при генетическим и биохимическом анализе одного из двух D. melanogaster
IAPs, DIAP1. Мутации потери функции DIAP1 вызывают эмбриональную летальность3,4,9, снижение DIAP1 ведет к клеточной гибели10-13, и DIAP1 соединяется непосредственно с ингибирует вышестоящий (DRONC) и нижестоящие каспазы (DCP1, DRICE)14,15.
Сцепленный с Х хромосомой IAP, XIAP/BIRC4 — наиболее тщательно охарактеризованый IAP млекопитающих — м. ингибировать апоптоз, когда он избыточно экспрессируется в клетках тканевой культуры16,17, а рекомбинантный XIAP/BIRC4 м. ингибировать ферментативную активность каспаз in vitro18. Однако, мыши, у которых были делетировна ген Xiap не были откровенно предрасположены к апоптозу19.
IAPs млекопитающих cIAP1/BIRC2 и cIAP2/BIRC3, которые содержат
(CARD) (Рис. 1a) помимо BIRs и RING доменов, м. ингибировать caspases. Но они менее охарактеризованы, чем XIAP, и роль CARD всё ещё неизвестна. Присутствие нескольких генов neuronal apoptosis inhibitory protein Naip/Birc1 у мяшей препятсвует нашему пониманию физиологической функции этого IAP,а доказательства противо-апоптической функции довольно фрагментарны. Т.к. NAIP не содержат домена RING20, мы не быдем рассматривать его здесь.
Blocking the blockers.
Т.к. DIAP1 м. мощно защищать клетки от гибели, то он д.б. удален или его анти-каспазной активности д. что-то противодействовать, чтобы произошла запрограммированная клеточная гибель у D. melanogaster. Идентифицировано несколько IAP антогонистов — HID, Grim и Reaper
— которые существенны для нормальной клеточной гибели, которая происходит во время развития у D. melanogaster. Эти гены тесно сцеплены и одна геномная делеция Df(3L)H99 предупреждает почти всю клеточную гибель21-23. Др. IAP антагонист, Sickle, располагается на арасстоянии 40 kb от Reaper24-26.
Одним из наиболее удивительных в этой области стало осознание, что разные семейства IAP антагонистов, которые почти не обладют др. общими законсервированными свойствами, имеют общий способ связывания с BIR доменами IAPs, что удерживает IAPs от соединения с и ингибирования каспаз. and inhibiting caspases. IAP-binding motif,IBM, характеризуется немоди фицированным остатком аланина на N конце белка (это может быть обусловлено пост-трансляционным расщеплением или удалением initiator methionine) и может быть идентифицировано по паттерну A(K/T/V/I)(P/A/E)(F/E/I/S/Y). Этот мотив также сходен с таковым у антагонистов IAP у млекопитающих Smac/DIABLO27,28, HtrA2/Omi29-32 и GSPT1/eRF3 (Ref. 33). У млекопитающих caspase-9 также имеет IBM, так что IAP антагонисты м. непосредственно конкурировать с caspase-9 за связывание XIAP34. Соединение caspase-3 с XIAP использует линкерную область, которая располагается N-терминальнее BIR2 у XIAP35,36,
так что связывание антогониста IAP, как полагают, предупреждает связывание caspase-3 путем стерической закупорки (occlusion) (Рис. 1c). Однако, установлено, что обе processed caspase-3 и caspase-7, также соединяются с XIAP с IBM-подобным эпитопом, который контактирует с IBM-связывающей бороздой в BIR у IAP, это подчеркивает консервативных механизм антагонизма к IAP37.
E3 ligases
Ubiquitylation белков выступает как один из основных регуляторных механизмов в клетках эукариот и его одной из принципиальных ролей является регуляция периода полу-жизни белков путем направления их на протеосомную деградацию. Присоединение 76-аминокислотного ubiquitin пептида к белковому субстрату вызывает каскад из трех, иногда четырех, ферментов, которые известны как E1, E2, E3 и E4 (Box 2; rev. 38). Имеется два класса RING E3 лигаз, которые различимы: один класс предствален мультибелковыми комплексами, которые содержат самостоятельный субстрат-связывающий белок и E2 recruitment белок (который содержит RING домен); в др. классе компоненты закодированы в одном и том же полипептиде.
Мультисубъединичные RING E3 лигазы, включая APC (anaphase-promoting complex), SCF (SKP––), (suppressor of cytokine signalling) box39, и вновь идентифициованное BTB (первоначально выявленный в комплексе Broad, Tramtrack и Bric-a-brac) семейство. Хотя имеется разный набор субстрат-рекрутирующих доменов в F-box, box и BTB белках, однако, удивительно, что эти мультибелковые E3 лигазы обладают одним и тем же RING-домен-содержащими белками — RBX1/ROC1/HRT1. Субстрат-связывающие белки и RBX1 собираются на cullin каркасе (Рис.
2)
IAPs и др. RING-домен-содержащие белки, такие как TRAF6 (tumour necrosis factor receptor-associated factor-6) принадлежат к др. классу E3 ligases (Рис. 2). В противоположность мультисубъединичным RING E3 лигазам, IAP E3 лигазы содержат субстрат-связывающий домен (BIRs) и RING домен в одном и том же белке и не нуждлаются в cullin каркасах, чтобы убиквитилировать субстраты in vitro. Интересно, однако, что генетические взаимодействия с skpA, с компонентом D. melanogaster SCF лигазы, и геном, который кодирует F-box белок Morgue, были описаны для DIAP1 (Refs 40, 41),это следовательно, оставляет открытой возможность, что имеется некая поперечная связь или даже физическое соединение между двумя классами E3 лигаз.
Деградировать или нет? Хотя и является важной роль системы ubiquitin, чтобы регулировать период полу-жизни белков путем направления их на деградацию с помощью протесом, имеется множество модификаций ubiquitin, которые не вызывают деградации белков, а вместо этого меняют активность модифицированного белка. В самом деле, ubiquitin впервые бвл идентифицирован в конъюгации с гистоном H2B, и это событие monoubiquitylation ассоциировало с активным хроматином и обеспечивалось с помощью RING белка BreI у Saccharomyces cerevisiae42, 43 (Рис. 1b). Др. примеры, включая TRAF6-обеспечиваемое polyubiquitylation киназы TAK1 (transforming growth factor (TGF)-activated kinase-1), которое активирует киназу, и ubiquitylation транскрипционного фактора Met4, которое ингибирует его активационный потенциал44. В целом, monoubiquitylation или multi-monoubiquitylation (один ubiquitin на несколько лизиновых остатков lysine внутри субстрата) не приводят к деградации субстрата. Более того, т.к. ubiquitin содержит несколько лизинов (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63), то polyubiquitin цепочки м. собираться на любом из этих остатков. Polyubiquitin цепочки из более чем 4-х ubiquitins, собираемые посредством K48 сцепления, являются можным сигналом для рекрутирования на протеасомы и последующей деградации. Polyubiquitin цепочки, которые собираются посредством др. сцеплений, ассоциируют с рядом исходов.
Monoubiquitylation versus polyubiquitylation. Могут ли E3 ligases предопределять, будет субстрат mono- или polyubiquitylated, пока неизвестно. В неоторых случаях необходим фермент E4 для polyubiquitylation45. Первая E4, UFD2, была описана в 1999. UFD2 не способствует ubiquitylation субстрата в отсутствие E3 лигазы, хотя она и содержит U-box — домен, который структурно очень сходен с RING доменом46-49. С тех пор как была идентифицирована E4, было описано несколько и др. E4s. Однако, недавно было установлено, что RING белок MDM2 нуждается E4-подобный кофактор, способствующий polyubiquitylation of p53. В этих работах было, во-первых, подтверждены более ранние наблюдения, что MDM2 сам по себе катализирует multi-monoubiquitylation of p53 (Refs 50,51); во-вторых, была расширена область E4s транскрипционных факторов и ко-активаторов.
Могут ли E3 лигазы предопределять, будет ли ubiquitin присоединяться к K48 (или др.) ещё предстоит определить. Большинство non-K48 сцеплений ассоциированно с E2-подобными молекулами, которые, как известно, являются ubiquitin E2 вариантами, которые гомлогичны E2s, но не содержат каталитического цистеина.
The importance of the RING for IAP function
Мутации RING finger в DIAP1 вызывают потери функции, а эмбрионы D. melanogaster, гомозиготные по таким мутациям, погибают во время эмбриогенеза4,52. Более того, мухи, которые гетерозиготны по точковой мутации RING в DIAP1, более чувствительны к апоптозу, чем индуцированные с помощью избыточной экспрессии IAP антагониста Reaper3,4. Неожиданно и в полном контрасте та же самая мутация DIAP1 RING понижает чувствительность к апоптозу, вызываемому избыточной экспрессией др. IBM-содержащего белка, HID. Результаты с HID подтверждены в исследованиях in vitro , при которых клетки были лишены дикого типа DIAP1 и экспрессируют только мутантный DIAP1 (Ref. 53). RING является следовательно, важным для регуляции апоптоза, который индуцируется с помощью IAP анатагонистов у D. melanogaster,но последствия нарушений домена RING зависят от индуктора клеточной гибели3,4.
Чрезвычайно трудно синтезировать модель, которая может объяснить выраженные отличающиеся эффекты, которые вызываются с помощью двух сходных IAP антагонистов, когда избыточно экспрессируются на гетерозиготном фоне DIAP1 DeltaRING. Гетерозиготы DIAP1 DeltaRING жизнеспособны, так что можно предположить, что комбинация дигого типа DIAP1 и DIAP1 DeltaRING могут эффективно противостоять повышенному количеству non-ubiquitylated DRONC, которое появляется как результат того, что DRONC не в состоянии больше эффективно убиквитилироваться с помощью DIAP1 (Ref. 52). Из-за избыточной экспрессии HID возникает меньше клеточной гибели, но избыточная экспрессия Reaper вызывает большую клеточную гибель, у RING мутантных гетерозигот по сравнению с глазами дикого типа, следовательно, различия в функциях IAP антагонистах д. вызывать разные фенотипы.
Одной из важных точек зрения является то, что IAP антагонисты не соединяются с DIAP1 точно одним и тем же способом, с HID соединяются преимущественно посредством BIR2 мотива, а с Reaper соединяется с BIR1 и BIR2 (Ref. 54) (Рис. 3a). Вообще-то прямой HID антагонизм DRONC связыванию54 является несущественным, чтобы сделать возможной клеточную гибель, но если этот непосредственный антогонизм комбинируется со способностью HID способствовать RING-зависимому autoubiquitylation и последующей деградации DIAP1, то он становится существенным55. Т.о., HID нуждается в DIAP1 RING домене, чтобы эффективно противодествовать DIAP1. Т.к. Reaper связывается с обоими BIRs у DIAP1, и может ингибировать связывание DRONC и DRICE с DIAP1 (Ref. 54), то он не является необходимым для деградации DIAP1, чтобы противодействовать этому эффективно. Следовательно, DIAP1-RING-мутанные клетки с повышенными количествами non-ubiquitylated DRONC оказываются сенсибилизированными к Reaper-индуцируемой гибели (Рис. 3a). Для этой модели, чтобы адекватно объяснить данные, показавшие, что Reaper также индуцирует деградацию DIAP1 RING-зависимым способом56,57, необходимо предположить, что эта функция Reaper имеет вторичное значение по отношению к его прямой IAP антогонистической роли. Эта модель не более, чем stop gap в настоящее время и решение этой специфической головоломки без сомнения зависит от понимания взаимодействий и роли RING finger.
IAPs and E2s
Ключевой функцией RING finger является связывание E2 UBC энзима, У D. melanogaster, E2 UBCD1 (гомолог UBCH5 млекопитающих) был идентифицирован как супрессор и Reaper- и HID-обусловленной клеточной гибели57. Reaper и HID нуждаются в активности E2 UBCD1, чтобы убивать клетки эффективно, особенно из-за того, что они нуждаются в E2, чтобы способствовать деградации DIAP1 (Ref. 57), и этот эффект является специфичным, т.к. тесно связан с E2s и не супрессирует убийства (Рис. 3b). Хотя у людей может быть свыше 96 разных E2 UBCs, но только небольшое количество из самых распространенных было протестировано в отношении их способности связывать IAPs человека. Сообщалось, что cIAP1 соединяется с UBCH5A, H5C, H7 и H8, тогда как фрагмент cIAP2, содержащий CARD и RING домены соеждиняется с H5A, H5B, H5C, H7, но не с H8, a XIAP соединяется со всеми из них58, когда временно эксрессируется в клетках 293T. Напротив, др. группа исследователе сообщала, что cIAP1, cIAP2, XIAP и melanoma IAP (ML-IAP) все они необходимы или для UBCH5A или H6, но не для UBCH2, H3, H5B, H5C, H7 или H10, чтобы продемонстрировать autoubiquitylation in vitro59. Принимая во внимание 80% идентичность между аминокислотами в RING домене и фланкирующих областях cIAP1 и cIAP2, было бы интересно подтвердить, могут ли существующие различия последовательностей обеспечить специфичность связывания UBC, как было предположено авт. Ref. 58. Семейство UBCH5 , по-видимому, особенно разнородно, взаимодействует с широким кругом RING-finger белков, таких как BRCA1–BARD1 (BRCA1 RING-domain-associated protein), NRDP1 (Ref. 60) и c-CBL61, an его члены часто используются в реакциях in vitro ubiquitylation. Однако, необходимо также отметить, что разные E2s могут связываться посредством гомологичных остатков с одним и тем же RING с польностью разными исходами. В то время как UBCH5 соединяется с гетеродимером BRCA1 и BARD1 , активируя активность E3 лигазы этого гетеродимера, то связывание очень сходного UBCH7 не способствует BRCA1– BARD1-обеспечиваемому polyubiquitylation62,63.
Surprising activity of inactive E2s. Эксперименты на D. melanogaster выявили участие UEV Morgue функции E3 лигазы DIAP1 (Refs 40,41) (Рис. 3b). UEVs это каталитически неактивные E2 UBCs, которые поэтому не конъюгируют с ubiquitin, но которые ассоциированы с ubiquitylation посредством non-K48-сцепленным polyubiquitin64,65. Напр., K63-сцепленное убиквитилирование TAK1 с помощью TRAF6 нуждается в UEV66.
Генетический скрининг in vivo идентифицировал morgue как про-апоптический ген, которые супрессирует фенотип 'too little cell death' у D. melanogaster41. Гетерозиготность по локусу morgue супрессирует HID, Grim или Reaper killing, и некоторые данные, полученные in vivo, указывают на то, что уровни DIAP1 повышены у мутантов morgue, так что можно ожидать, что Morgue может активировать K48 autoubiquitylation активность DIAP140,41. В прямом контрасте с данными in vitro установлено, что дикого типа Morgue скорее стабилизирует, чем способствует деградации DIAP1. Gal4-управляемая экспрессия дикого типа Morgue была также независимо идентифицирована как одна из групп энхансеров фенотипа 'increased cell death', который индуцируется избыточной экспрессией Reaper40. Хотя DIAP1, как было установлено, взаимодействует с Morgue in vitro, a избыточная экспрессия Morgue снижает уровни эндогенного DIAP1, у HYPOMORPHIC morgue мутантных мух, ожидаемое увеличениен уровней DIAP1 не наблюдается. К стати, UEVs ассоциируют с non-K48-сцепленным ubiquitylation, поэтому было бы интересно определить, может ли Morgue способствовать auto-K48-сцепленному убиквитилированию и деградации DIAP1, как это предполагается в Refs 40,41. Итак, установлена роль morgue в клеточной гибели и показано, что morgue кооперирует с IAP антагонистами HID, Grim и Reaper. Но необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы полностью понять, как функционирует Morgue в апоптических или живых клетках.
Targets of the IAP RING
Итак, пока не вырисовывается исчерпывающая картина роли E3 ligase функций IAPs. Из-за того, что имеетсся такое разноообразие ubiquitylation, с которыми ассоциированы RING fingers, и из-за того, что IAPs могут связывать и рекрутировать белки к ряду E2s и разными способами, нет ничего удивительного в том, что IAPs могут быть инструментами в модификации путей, с помощью которых убиквитилируются определенные субстраты. Учитывая фрагментарную природу данных, вместо догматического предположения, что IAPs выполняют определенный тип убиквитилирования, более рентабельно допускать разные возможности из-за отсутствия экспериментального подтверждения или отсутствия таковых для каждого (Рис. 4; also see Supplementary information S1 (table)).
IBM-containing proteins. Как было описано выше, антагонисты IAP у насекомых (Reaper, Grim, HID, Sickle и Jafrac2; Ref. 67) и млекопитающих (Smac/DIABLO, HtrA2/Omi и GSPT1/eRF3) взаимодействуют с BIR мотивами IAPs посредством IBM. Т.к. антогонисты IAP соединяются непосредственно с IAPs, то они представлют собой наиболее вероятных кандидатов на роль субстратов для IAP-обусловленного убиквитилирования. В самом деле, IAP-обусловленные polyubiquitylation и деградация Reaper были описаны in vitro68, a non-ubiquitylatable форма Reaper оказалась более эффективной, чем версия дикого типа в индукции клеточной гибели in vitro68. Одним из потенциальных осложнений, если посмотреть на антагонистов IAP, является то, что они могут быть экспозированы немодифицированным alanine на их N концах, чтобы сделать их способными взаимодействовать с IAP31. У D. melanogaster это очевидно, N-терминальный methionine эффективно удаляется из эндогенных белков при экспозиции их немодифицированным аланином. Экспериментально, простейший метод гарантии, что аланаин будет экспозирован на N конец, связан со слиянием ubiquitin с рассматриваемым N концом антагониста IAP. Затем он отщепляется внутриклеточно от слитого белка с помощью клеточных de-ubiquitylating энзимов, чтобы удалить немодифицированную N-терминальную аминоксилоту на non-ubiquitin партнера по слиянию67,69,70. Когда этот метод был использован для генерации D. melanogaster IAP антагонистов или с N-терминальным аланином (который может взаимодействовать с IAP) или с N-терминальным valine или isoleucine (которые не могут взаимодействовать с IAPs), то не было выявлено заметных отличий в стабильности IAP антагонистов Reaper, HID или Grim in vitro54. Это оставляет открытой возможность, что уровни этих D. melanogaster IBM белков не регулируются преимущественно с помощью IAPs.
Некоторые исследования показали, что Smac/DIABLO может быть субстратом для XIAP-опосредованного ubiquitylation in vitro71, 72. Однако, в этом и др. исследованиях ubiquitylation не вызывало деградации Smac/DIABLO, указывая тем самым, что Smac/DIABLO или multi-monoubiquitylated или non-K48 убиквитилируется. В некоторых случаях, Smac/DIABLO действительно, по-видимому, противодействует активности E3 ligase в XIAP73,74 , а убиквитилирования Smac/DIABLO не наблюдается. Др. результаты указывают на то, что хотя XIAP и ML-IAP могут способстовать убиквитилированию Smac/DIABLO in vitro, но только убиквитилирование с помощью cIAP1 и cIAP2 приводит к деградации Smac/DIABLO59.
Было предположено, что Smac/DIABLO может также регулироваться с помощью IAP BRUCE/Apollon75,76. BRUCE содержит одиночный BIR, но не содержит домена RING, и следовательно, E2 UBC домен, который присутствует в BRUCE не способен убиквитилировать субстрат без промежуточной E3 ligase. Результаты этих двух групп исследователей не совсем согласуются. Одни описывают monoubiquitylation Smac/DIABLO с помощью BRUCE и, что довольно неожиданно, с помощью BIR-мутантного BRUCE, который не взаимодействует с Smac/DIABLO75. Др. группа описывает, что BRUCE индуцирует polyubiquitylation и degradation Smac/DIABLO76. У D. melanogaster, BRUCE, как сообщалось, ингибирует Reaper- и Grim-индуцированную клеточную гибель без соотв. их деградации77.
IAP antagonists fight back? Необходимо понять, как же собственно становятся мишенями для IAP-обусловленной деградации, IAP антагонисты действительно могут способствовать auto-polyubiquitylation и деградации IAPs. HID55 и Reaper56,57, как было установлено, вызывают деградацию DIAP1 RING-зависимым способом, хотя необходимо отметить, что Yoo et al. наблюдали RING-независимую деградацию DIAP1 с помощью Grim и Reaper55. Reaper и Grim были также способны индуцировать деградацию XIAP в экстрактах амфибий и клетках млекопитающих56,73. В одном исследовании сплайс вариант Smac/DIABLO, который сохраняет IBM, может способствовать XIAP autoubiquitylation и деградации78, хотя др. авт. не наблюдали деградации XIAP, индуцированной с помощью Smac/DIABLO58,73. Остаётся возможным, что способ действия IAP-индуцированной деградации IAP антагонистов действительно связан с деструкцией самого IAP в self-sacrificial co-degradational процессе. Согласуется с этим потеря Smac/DIABLO, которая была индуцирована с помощью cIAP1 и cIAP2 и была ассоциирована с потерей самого IAP59.
Т.к. IAP антагонисты, которые связываются с IAPs, уже защитили IAPs от ингибирующих каспаз (Рис. 3a), то некоторые авт. задаются вопросом, не может ли IAP-антогонистом-индуцированная деградация IAPs быть необходимой для апоптоза, или не может ли она просто представлять собой экстремальную ситуацию, которая выявляет нормальную анти-апоптическую роль IAPs в живых клетках79 (Рис. 3b). Др. словами, эти авт. предполагают, что соединение IAP с IBMs активирует autoubiquitylation активность у IAP, и IAP и связанный IBM белок деградируются с помощью протеасом. Для иллюстрации необходимо рассмотреть IAP антагонистов млекопитающих Smac/DIABLO и HtrA2/Omi, которые продуцируются в здоровых клетках, но закрыты на ключ в митохондриальных межмембранных пространствах, так что они недостижимы для цитоплазматических IAPs. В не-апоптических клетках случайное поступление небольших количеств Smac/DIABLO или HtrA2/Omi в цитоплазму является непредвиденным и потенциально вредным и они, следовательно, д. автоматически удаляться с помощью IAP-обусловленного ubiquitylation и деградации с помощью протеасом. Важно отметить, что в этой модели IAPs д. ко-деградироваться вместе с субстратом, но что небольшие количества антагонистов IAP, высвобождаемые из митохондрий не д. вызывать обнаружимого уменьшения уровней IAP. В погибающих клетках, однако, имеется существенное высвобождение антогонистов IAP, и тогда потеря IAPs д. быть более очевидной. Генерация IBM с помощью нечаянной активности каспаз в здоровых клетках80 также может позволять IAPs убиквитилировать эти processed субстраты и направлять их в конечном итоге на протеосомы. Это мнение открывает возможность, что важная роль IAPs в здоровых живых клетках может функционировать как E3 лигазы для обеспечения деструкции случайно processed белков или белков, которые случайно попадают в цитоплазму81. В таких белках IBM д. действовать как метка, передающая сигнал о несоответствующей локализации или активности, которая д. метить их для удаления с помощью IAPs.
Caspases. У D. melanogaster, DIAP1 может ингибировать нижестоящие каспазы (Box 1) DCP1 и DRICE, но он может также непосредственно ингибировать и вышестоящую каспазу DRONC14,15, которая активируется с помощью адапторной молекулы D. melanogaster Apaf-1-related killer (DARK) (Рис. 3a). В отличие от IAPs млекопитающих, которые связывают только processed каспазы, DIAP1 может связывать unprocessed pro-DRONC. DIAP1 соединяется с DRONC посредством короткого пептида в области непосредственно с C-терминальнее его CARD домена, в той же самой бороздке, с которой соединяются IBMs82. Поэтому для удобства данного обзора мы обозначили рассматриваемое взаимодействие 'IBM-like'. DIAP1 убиквитилирует DRONC in vitro, но убиквитилированный DRONC не деградирует (Ref. 79; P. Meier, personal communication), это указывает на то, что он не модифицируется с помощью K48-linked polyubiquitin. Необходимо отметить, что др. группа предполагает, что происходит DIAP1-обусловленное убиквитилирование и деградация активности DRONC82,83. Показано также, что уровни DRONC выше в мутантных DIAP1 RING клетках (которые поддерживаются живыми mjfujlfhz избыточной экспрессии ингибитора baculoviral caspase p35)84. Пока неясно, может ли это видимое увеличение DRONC быть результатом повышения стабильности белка, epitope exposure или усиленной транскрипционой экспрессии с гена Dronc.
IAPs млекопитающих, как сообщалось, убиквитилируют каспазы in vitro. В одном исследовании продемонстрировано monoubiquitylation caspase-3 и caspase-7 in vitro85, а в др. описаны polyubiquitylation и деградация неактивной caspase-3 (Ref. 86). Эта каталитически неактивная caspase-3 не подвергается процессингу, а, следовательно, связывание XIAP этой каспазой и последующее убиквитилирование не обязательно отражают физиологическую ситуацию. Хотя после ревращения, а, следовательно, активированная, caspase-9 соединяется с XIAP с высоким сродством, а убиквитилирование искусственной, каталитически неактивной caspase-9 не наблюдается86. Следовательно, доказательства, что IAPs физиологически polyubiquitylate каспазы и способствуют их деградации посредством протеасом, всё ещё неубедительны.
TRAFs and MURR1. cIAP1 и cIAP2 млекопитающих м. соединяться с TRAF1 и TRAF2, a XIAP, как сообщалось, соединяется с MURR1 — фактором, который участвует в гомеостазе меди у млекопитающих87,88. Однако, ни один из этих IAP-взаимодействующих белков не имеет IBM, хотя все они соединяются с BIR доменами IAPs89,90. Как описано для DRONC82,возможно, что эти белки соединяются с той же самой бороздкой внутри BIR как это делают IBMs, но т.к. пептид в DRONC, который соединяется с DIAP1, связывается в C-to-N ориентации, то трудно предсказать, присутствует ли сходный пептид в в этих др. IAP-связывающих белках.
Передача сигналов посредством RING-содержащего TRAF2 возможно способствует выживанию за счет транскрипционного усиления активности ядерного фактора-kappaB (NF-κB) b Jun N-terminal kinase (JNK)91-93. В некоторых исследованиях было показано, что уровни TRAF2 снижаются вследствие связывания лигандом некоторых членов семейства TNF receptor (TNFR)94-97. Потеря TRAF2 , как было предположено, обеспечивается с помощью cIAP1(Ref. 97), т.к. убиквитилирование и деградация TRAF2 вследствие передачи сигналов TNFR2 может быть ингибирована с помощью cIAP1 RING мутанов97. В согласии с этими набюдениями, избыточная экспрессия DIAP1 у D. melanogaster может вызывать потерю TRAF98.
Родственный TNF рецептор TNFR1, также как и kinase receptor-interacting protein (RIP), но не TRAF2, оказываются polyubiquitylated вследствие передечи сигналов TNFα99. Эти модификации, как сообщалось, не затрагиваются трансфекцией TRAF2, у которого отсутствует RING домен, указывая тем самым, что TRAF2 не вызывает этих ubiquitylations99. Более того, RIP1 , как сообщалось, взаимодействует непосредственно с и становится убиквитилированным с помощью cIAP1 и cIAP2, и затем деградирует с помощью протеасом100. Взаимосвязь этого с передачей сигналов TNFα неясна, однако, ни RIP1, ни TNFR1 не деградируют быстро вследствие ubiquitylation in vivo101. Сообщалось также, что TRAF1 является мишенью для cIAP2- (но не для cIAP1-) обусловленного polyubiquitylation и деградации in vitro, и идентифицированы два ключевых лизина, которые модифицируются с помощью ubiquitin. Однако, эффекты мутирования этих двух лизинов не исследовалось в физиологических системах102.
Ряд др. наблюдений делает роль, приписываемую IAPs в TNF signalling трудной для разрешения. Т.к. TRAFs, как предполагается, создают анти-апоптические сигналы для клеток, то деградация TRAF2 с помощью cIAP1 д. указывать на то, что в TNF сигнальном пути cIAP1 может быть про-апоптическим — предположение, которое противоречит интуиции, но для которого имеется недостаточно доказательств ни за, ни против. Др. авт. показали, что cIAP1 также деградирует вследствие передачи сигналов TNF96, чего не наблюдали авт. Ref. 97. Однако, др. эксперименты указывают на то, что деградация TRAF2 зависит от RING домена TRAF2 (Ref. 95). Следовательно, хотя cIAPs может быть E3 лигазой, которая ответственна за деградацию TRAFs, они являются не единственными кандидатами. Заслуживает внимания, что передача сигналов посредством TNFR1, который также связывается с cIAP1, cIAP2 и TRAF2, не обусловливает деградации TRAF2, а вместо этого обусловливает его релокализацию101 (Рис. 5).
XIAP, как было установлено, взаимодействует с MURR1 (Ref. 90). Это исследование кроме того показывает, что MURR1 негативно регулируется с помощью XIAP и как следствие уровни внутриклеточной меди снижаются в эмбриональных фибробластах мышей. Хотя XIAP способен убиквитилировать MURR1 in vitro, у MEFs от нокаутных мышей уровни MURR1 были не очень отличными от уровней дикого типа MEFs, это указывает на то, что XIAP определенно не единственная E3 лигазой, которая может функционировать, чтобы регулировать уровни MURR190.
Indirect association and ubiquitylation. Многие белки скорее всего ассоциированы с IAPs косвенно в мультисубъединичных комплексов. Одним из таких белков может быть inhibitor of NF-kappaB kinase (IKKgamma)/NF-kappaB essential modulator (NEMO), который, как было показано, модифицируется с помощью cIAP1. IKKgamma/NEMO может рекрутироваться в комплекс TNFR1 вместе с IKKα и IKKβ, чтобы передать сигнал активации NF-kappaB TRAF2-зависимым способом103, так что может присутствовать вместе с cIAP1 или cIAP2, или обоими, в TNFR1 рецепторном комплексе. Неожиданно, в то время как IKKgamma/NEMO убиквитилируется, но не деградирует в комплексе TNFR1 in vivo, некоторые in vitro подходы с cIAP1 выявляют polyubiquitylation и деградацию IKKgamma/NEMO. Др. подходы выявляют как multi-monoubiquitin, так и non-K48-сцепленный polyubiquitin, что ставит вопросы, связанные с физиологическим значением IKKgamma/NEMO ubiquitylation с помощью cIAP1 (Ref. 104).
IAP homodimers and heterodimers. IAPs млекопитающих димеризуются посредством своих RING доменов105, это делает возможным, что при определенных условиях они могут autoubiquitylate др. др. in trans. Доказательства активации RING fingers с помощью димеризации накапливаются и, напр., в то время как BRCA1 и BARD1 в основном неактивны сами по себе в качестве E3 лигазы, в случае же их комбинации они становятся мощной E3 лигазой63. IAPs являются нестабильными молекулами — DIAP1 имеет период полу-жизни примерно в 30 мин (Refs 52,55), a cIAP1 и cIAP2 являются нестабильными, так что они д. экспрессироваться со 100-кратным избытоком, чтобы достичь тех же самых уровней экспрессии, что и XIAP58. Уровни IAP могут также дифференциально регулироваться, т.к. и XIAP и cIAP1 теряются избирательно RING-зависимым способом вследствие обработки glucocorticoid T клеток106. Наконец, все RING-содержащие IAPs, которые были тестированы, autoubiquitylate.
В то время как белки, которые содержат E3 лигазные домены являются часто нестабильными106-109, это может быть объяснено 'occupational hazard' убиквитилирования и деградации поддерживаемого субстрата79. Если, однако, мы рассмотрим эту нестабильность как функцию RING, тогда важная роль RING домена может действительно регулировать обилие самого себя IAP. Если функция IAPs выступает в качестве надежной ловушки, чтобы предотвращать клеточную гибель, когда активны низкие уровни каспаз, чем контролировать их обилие, то она является важной и IAP, который будет действовать как своя собственная лигаза E3, будет позволять осуществление этого контроля. Т.о., возможно, что антагонисты IAP обусловливают деградацию IAP путем активации врожденной деструктивной способности IAPs, и путем IAP autoubiquitylation в некоторых, но не во всех контекстах. В согласии с этой моделью то, что RING домен IAP является необходимым для антагонистов IAP, чтобы индуцировать их деградацию55-57,73. Если D. melanogaster антагонисты IAP рассматривать как специфические индукторы самодеструкции IAP, то деградация самих антагонистов IAP может происходмть в то же самое время, когда комплекс направляется в протеосомы — модель, которая уже была частичоно предположена Ditzel and Meier79.
Beginnings and conclusions
This article illustrates that our knowledge of the role of the RING finger in IAPs is still rudimentary. Currently, data can be found to support IAPs carrying out the full range of ubiquitin modifications, from mono- to poly-ubiquitylation, and of a wide range of different substrates, including themselves. Some of these results might not stand the test of time, but if IAPs do carry out mono- and polyubiquitylation with both K48- and non-K48- linked ubiquitin, one of the big challenges will be to understand how the decision is made.
Our knowledge of the function of RINGs in IAPs is basic, but IAPs are not alone in this regard; knowledge of the function of the RING domain in other proteins is similarly incomplete. Consider the RING-bearing protein MDM2, which regulates p53. MDM2 has a RING (Fig. 1) and similar domain organization to the IAPs and is the most characterized p53 E3 ligase. It had been thought that MDM2 was responsible for polyubiquitylation and degradation of p53. However, recent results indicate that MDM2 multi-monoubiquitylates p53 (Ref. 51) and that this can lead to sequestration of p53 in the cytoplasm rather than its degradation50. K48-linked polyubiquitylation of p53 by endogenous levels of MDM2 might require the transcriptional co-activator p300, which seems, surprisingly, to function as an E3/E4 (Ref. 110). In some situations, MDM2 can modify p53 with a ubiquitin-like molecule called NEDD8 and this modification can destabilize p53 in vitro111. In addition, HDMX/MDM4, a close homologue of MDM2, seems to regulate MDM2 activity in a RING-dependent manner112, 113. And, as if this were not complicated enough, two recently described p53 E3 ligases, COP1 (Ref. 114) and PIRH2 (Ref. 115), also contain RING domains, which raises the levels of complexity further115. Modification of IAP-interacting proteins — including other IAPs — by IAPs with ubiquitin and ubiquitin-like molecules is likely to be similarly complex. Undoubtedly, many interesting discoveries await.
