BHK | LBPA | MVLs | HPTS | ESCRT-III

Мембраны и пузырьки, накапливающиеся внутри мультивезикулярных или мультиламеллярных эндосом вдоль пути деградации, ведущему к лизосомам, содержат некоторые селективно включенные белки, включая подавляемые рецепторы для факторов роста и гормонов (1,2). В поздних эндосомах, LBPA [или bis(monoacylglycero) phosphate] обилен в этих внутренних мембранах, составляя ~15 mole percent от общих фосфолипидов органелл (3). LBPA не обнаруживается ещё где-либо в клетке и участвует в поставке белков и липидов посредством поздних эндосом (3-7). Мы синтезировали 2,2'-dioleoyl LBPA (8) (Fig. 1, A and B), основную изоформу (более 90%) в клетках baby hamster kidney (BHK) (9) и приготовили крупные липосомы (10) с фосфолипидным составом, сходным с тем, что в поздних эндосомах (dioleoylphosphatidylcholine: dioleoylphosphatidylethanolamine: phosphatidylinositol:LBPA, 5:2:1:2 mol) (3, 9). Меченные флюоресцентной окраской FM2-10 крупные unilamellar липосомы (диаметром ~600 - 800 nm) легко выявлялись с помощью световой микроскопии независимо от присутствия или отсутствия LBPA (Fig. 1C) (Table 1). Т.к. просвет поздних эндосом является кислым (pH 5.0 - 5.5) (1), то мы воспроизводили эту ситуациюwe in vitro инкубированием липидов при pH 5.5 во время фазы реверсии процесса сборки липосом; наружная pH была затем нейтрализована, чтобы воспроизвести градиент, формируемый in vivo (10). Липосомы, лишенные LBPA оставались unilamellar (Fig. 1D и Table 1), тогда как LBPA липосомы обнаруживали от 5 до 10 внутренних пузырьков (Fig. 1E и Table 1), напоминая тем самым мультивезикулярные области поздних эндосом при EM (3, 9, 11, 12). Внутренние пузырьки наблюдались также внутри LBPA-содержащих липосом (Fig. 1G), но не в контрольных липосомах (Fig. 1F) (13, 14).

Multivesicular liposomes (MVLs) неспособны формироваться в отсуствие градиента pH или когда просветная pH менее кислая (pH менее или равна 6), как это имеет место в ранних или recycling эндосомах. В LBPA, oleoyl цепочки преимущественно эфиризированы по термодинамически нестабильному β положению glycerol остова (2,2'- LBPA, Fig. 1A) in vivo, a жирные кислоты м. мигрировать в α позиции (3,3'- LBPA) (8, 9). Формирование MVL существенно снижено, когда используются др. изоформы LBPA (Table 1), включая 3,3'-LBPA, или полу-LBPA, трижды acylated изоформа, обнаруженная в вирусе вакцины и вообще в комплексе Golgi (15, 16) (Table 1). T. о., 2,2'- LBPA, основная изоформа поздних эндосом обладает прирожденной способностью стимулировать образование внутренних пузырьков внутри кислых липосом и тем самым генерировать структуры, которые напоминают поздние эндосомы.

Чтобы проследить процесс инвагинации двойного слоя, липосомы обрабатывали нейтральной pH и затем ацидифицировали с помощью инкубации при pH 5.5 с protonophore nigericin. После удаления лекарства с помощью быстрой хроматографии и нейтрализации внешней pH липосомы инкубировали с водорастворимой окраской 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS).

Fig. 1. MVLs. (A and B) The structure (A) and molecular modeling (B) of 2,2'-LBPA are shown. The 2 and 2' carbons are asymmetric with an SN1 configuration. Because of the small size of its headgroup, this isoform may be cone shaped. (C to G) Liposomes with a neutral lumenal pH [(C), pH 7.4] or an acidic lumenal pH [(D) to (G), pH 5.5] were prepared with LBPA [(C), (E), and (G), +LBPA] or without LBPA [(D) and (F), –LBPA]. (LBPA-containing liposomes were unstable when bathed at pH 5.5.) The liposomes were then incubated with FM 2-10 and observed by fluorescence microscopy without fixation [(C) to (E)] or processed for cryo-EM [(F) and (G)]. (F) and (G) show examples of liposomes that are roughly the same size to facilitate comparison. Scale bars, 750 nm [(C) to (E)]; 100 nm [(F) and (G)]. (H and I) Liposomes prepared at neutral pH with LBPA (+LBPA) and without LBPA (–LBPA) were acidified by incubation for 10 min with nigericin at pH 5.5. After drug removal by rapid chromatography and neutralization of the milieu, liposomes were incubated with HPTS at 4°C (H) or 37°C (I). After quenching external HPTS with DPX, the fluorescence intensity of HPTS entrapped within liposomes was quantified. For each condition, the mean SEM of three experiments is shown. Upon prolonged incubations (>30 min), LBPA liposomes became unstable and showed a tendency to aggregate. ( J) LBPA liposomes were switched to an acidic pH, as in (H) and (I), but 3 µg/ml of the antibody to LBPA or isotypic control antibody (ctrl Ab) was added together with HPTS. For each condition, the mean SEM of three experiments is shown.

Fig. 2. Alix-dependent MVL formation. (A) Liposomes containing 2,2'-LBPA or 3,3'-LBPA, or lacking LBPA (no LBPA), were incubated in 250 µg of complete cytosol in the presence of a pH gradient (as in Fig. 1, H and I), retrieved by floatation in gradients, and then analyzed by Western blotting with antibodies to Alix. A lane loaded with 5 µg of cytosol is shown for comparison. The star marks the position of Alix. (B) 2,2'-LBPA liposomes were prepared at a neutral pH, and switched to pH 5.5, as in Fig. 1H (ctrl, control), or incubated with 5 µg purified recombinant Alix or annexin II (Anx II). Lipid concentrations and buffer solutions were identical to those in (C) and (E) (with cytosol) to facilitate comparison. Scale bar, 750 nm. (C) Liposomes prepared as in (B) were incubated in 50 µg of cytosol, or cytosol immunodepleted with 5 g of rabbit antibody to Alix (cytosol Alix IP), mock treated with 5 µg of rabbit immunoglobulin G (cytosol mock IP), or complemented with 5 µg of purified Alix (cytosol Alix). (B) and (C) show examples of liposomes that are roughly the same size to facilitate comparison. (D) The number (n) of MVLs in (B) was counted, as in Table 1. MVLs were also quantified after the addition of both Alix and antibodies to Alix (αAlix Abs). Different experimental conditions [see (B)] account for different values of n in the control here and in Table 1. (E) Liposomes were incubated in 12.5 or 50 µg of complete cytosol, as in (C), and MVLs were quantified, as in (D). In (D) and (E), more than 300 liposomes from three independent experiments were counted.

Затем окраску, оставшуюся во внешней среде, избирательно удаляли с помощью p-xylenebis-pyridinium bromide (DPX) (10, 17). Липосомы, содержащие LBPA, обнаруживали высоко достоверную способность включать HPTS и при 4°C (>10% объёма липосом)и 37°C (~5.75 µl/µmol липида или ~40% объёма липосом) по сравнению с контролем, лишенным LBPA (4% объёма липосомы) (Fig. 1, H и I, и Table 1). Эти липосомы сохраняли также способность формировать MVLs (Table 1), с большей готовностью, чем липосомы, обработанные при pH 5.5 (Fig. 1E). Кроме того, антитела против LBPA (3), но не изотипические контрольные антитела, ингибировали процесс инвагинации (Fig. 1J) и образования MVL (Table 1), подтверждая роль LBPA в образовании внутри-липосомальных пузырьков. Сходным образом, антитела предупреждали образование MVLs при бработке pH 5.5, если они присутствовали во время ступени нейтрализации pH (Table 1). Т.о., процесс инвагинации м.б. воссоздан при ацидификации липосом, содержащих LBPA, это воспроизводит ацидификацию эндосом, которая происходит in vivo.

In vivo, формирование (и динамика) внутренних мембран внутри поздних эндосом, по-видимому, контролируется с помощью белков. После инкубации в цитозоле мы нашли 5 белков, избирательно рекрутируемых на LBPA липосомы, но не контролирующие липосомы. Один из этих белков идентифицирован с помощью tandem mass spectrometry как Alix, цитозольный партнёр ALG-2 (18), который также присутствует в экзосомах (19)и phagosomes (20). Дрожжевой гомолог Alix, Vps31p (известный также как Bro1p или Npi3p), участвует в биогенезе мультивезикулярных эндосом, вообще-то вместе с или нижестоящим endosomal sorting complex III required for transport (ESCRT-III) (21). Более того, Alix взаимодействует с ESCRT белками и подобно ESCRT белкам играет роль в почковании вируса иммунодефицита у людей на плазматических мембранах (22, 23). Цитозольный Alix преимущественно рекрутируется с помощью липосом, содержащих 2,2'-dioleoyl LBPA (2,2'-LBPA) (Fig. 2A). Без цитозоля, очищенный, рекомбинантный Alix (24) строго ингибирует образование MVL (Fig. 2, B и D), не влияя на липосомную pH, и это ингибирование частично устраняется с помощью антител к Alix (Fig. 2D). Связывающий фосфолипиды белок annexin II (25), использованный в качестве контроля, снижает образование MVL, но в значительно меньшей степени, чем Alix (Fig. 2D). Хотя цитозоль эффективно поддерживает образование MVL дозово-зависимым образом (Fig. 2, C и E), избыток очищенного Alix ингибирует образование MVL. Напротив, иммуно-истощение Alix

Fig. 3. Alix downexpression. (A) HeLa cells were transfected for the indicated time with siRNA1, and analyzed by Western blotting, with the use of antibodies against Alix and annexin II (Anx II). (B and C) Cells transfected with siRNA1 for 72 hours, as in (A), or mock transfected (control), were stained with LysoSensor DND189 (B) or acridine orange (C) and analyzed by fluorescence microscopy. (D to F) Cryosections of cells transfected with Alix siRNA1 [(E) and (F)] or mock transfected (D) were immunogold labeled with antibodies to LBPA. Open arrows point at gold particles; black triple arrows and stars indicate multilamellar and vesicular regions, respectively; asterisks show late endosomes in siRNAtreated cells with a typical multilamellar/multivesicular morphology but devoid of labeling. (G to I) The total number of multilamellar late endosomes (G), the total number of gold particles per cellular profiles (H), and the number of gold particles per late endosomal profiles (I) were quantified in 35 flat cell profiles selected at random, each section containing a nuclear profile. ( J) Alix siRNA1-treated cells and mocktransfected cells were analyzed by indirect immunofluorescence with antibodies against LBPA and Lamp1. (K and L) Cells transfected with Alix siRNA1 or mock transfected were infected with VSV for 3 hours, labeled with antibodies against the glycoprotein G (G protein) of VSV and fluorescein isothiocyanate–labeled secondary antibodies (green), and analyzed by immunofluorescence (K); cells are identified by nuclear staining (red). In control infected cells (ctrl), the newly synthesized VSV–G protein is abundant in the endoplasmic reticulum and the Golgi complex, whereas the number of infected cells is reduced by Alix siRNA1. The number of infected cells was quantified (L); data show the mean of three independent experiments.

из цитозоля заметно стимулирует образование MVL, в то время как контрольные антитела не оказывают эффекта (Fig. 2, C и E). Если экспрессия Alix замалчивается с помощью small interfering RNAs (siRNAs) в клетках HeLa (Fig. 3A), то количество кислых, поздних эндоцитических компартментов, по-видимому, снижается (Fig. 3B), тогда как признаки ацидификации др. органелл (таких как ранние эндосомы и trans-Golgi network) по-видимому, не затрагиваются ( Fig. 3C). С помощью EM, LBPA (Fig. 3, D и E, open arrows) обнаруживается в клетках HeLa как в мультиламеллярных областях (Fig. 3D, black triple arrow) так и в мультивезикулярных областях (Fig. 3D, star and inset), часто внутри одних и тех же поздних эндосом. Соответственно, Alix siRNAs уменьшает количество поздних эндосом, содержащих multilamellar области (которые однозначно м.б. идентифицированы на срезах) (Fig. 3B), тогда как др. органеллы, включая комплекс Golgi , по-видимому, не затрагиваются (Fig. 3G).

Биохимический анализ показывает, что подавление Alix редуцирует LBPA до ~50% от контрольного уровня. Соответственно, окрашивание LBPA в Lamp1-позитивных поздних эндосомах снижается при иммунофлюоресценции (Fig. 3J), как и общее количество anti-LBPA золотых частиц на клеточный профиль (Fig. 3H) и на поздние эндосомы endosomes (Fig. 3, E and F, quantification in I) с помощью EM. Vesicular stomatitis virus (VSV) инфицирует клетки с помощью эндоцитотического пути, но не с помощью ранних эндосом (26, 27). Кислая эндосомная pH запускает слияние оболочки VSV с эндосомными мембранами, позволяя nucleocapsid проникнуть в цитоплазму. Вирусная инфекция (Fig. 3K, quantification in L) ингибируется с помощью подавления Alix, по-видимому, благодаря снижению количества кислых поздних эндосом. Напротив, Alix-зависимая динамика мембран поздних эндосом м.б. необходима для эффективного высвобождения nucleocapsid. Установлено, что LBPA обладает способностью управлять образованием инвагинаций мембраны внутри кислых липосом. Мы также установили, что Alix контролирует этот процесс инвагинации in vitro и организацию LBPA-содержащих эндосом in vivo. Мы полагаем. что внутренние пузырьки и лимитирующая мембрана взаимодействуют динамически посредством событий деления и слияния и что процесс деления контролируется, по крайней мере частично, с помощью временных взаимодействий между LBPA мембранами и Alix (28), по-видимому. вместе с др. факторами, включая и ESCRT белки (22, 23).