Посещений:
Движение Клеток, Частиц

Генерация Движущих Сил

The actin slingshot
Julie Plastino and Cecile Sykes
Current Opinion in Cell Biology
Volume 17, Issue 1 , February 2005, Pages 62-66

Actin polymerization generates the force that deforms the cell membrane, pulls the cell forward and propels endosomes and bacteria within the cell. The mechanism of force generation has been probed using experimental biomimetic systems where force generation and movement occur by the same actin-polymerization processes observed in cells. The advantage of such systems over living cells is that their physical properties can be changed, such as the size of the load, its composition and its deformability, in order to respond to specific questions. Recent experimental developments and associated theoretical models have provided us with a better understanding of motility based on actin polymerization. This paves the way towards a better comprehension of cell motility.

Enlarge Image
Рис.1.  |  Figure 1. Schematic describing the ‘squeezing’ effect caused by the elastic properties of the actin gel, and the consequences on symmetry-breaking and movement. (a) Actin gel growth from a hard bead (grey) grafted with activators of actin polymerization (yellow stars). The red layer is newly generated and its insertion deforms the older layers (light red and pink) as monomers are polymerized at the bead surface. This effect results in stresses within the actin gel. (b) Symmetry is broken due to the local thinning of the actin gel that breaks or depolymerizes under the increased outer tangential stress. (c) Propulsion of a hard bead due to squeezing forces (blue arrows) that are opposed by the gel/bead friction (green arrows). Squeezing at the sides results in pulling at the rear (purple arrow, and the gel can, in some cases, be pulled off the hard bead surface (orange space). (d) Effect of squeezing on a soft droplet or liposome, as seen experimentally in artificial36,37,40 or living systems [38]

См. также подробности в Biomimetism of cellular movement
Движения и деформации эукариотических клеток подкрепляются, частично, с помощью динамики обильного цитоскелетного белка актина. Актин существует в двух формах в клетках, мономерной глобулярной формы и полимерной филаментозной форме. Актиновые филаменты полярны и в условиях стабильного состояния имеют растущий "колючий" (‘barbed’) конец и уменьшающийся "заостренный" (‘pointed’) конец. Процесс полимеризации актиновых мономеров в филаменты на плазматической мембране генерирует силу. Полимеризация актина м. также управлять эндоцитозом и перемещением эндосом в культивируемых клетках [1] и у дрожжей [2]. Продуцируемая полимеризацией сила кажется уникальной для биологических систем, т.к. она никогда не была описана для синтетической химической полимеризации. Каковы же биохимические и физические механзмы, лежащие в основе генерации сил. Прежде всего, понимание того, как клетки движутся имеет значение для разных областей, таких как иммунология и развитие, а также для изучения определенных заболеваний, в частности метастазирования рака. Кроме того, перемещения эндосом и бактерий ставят фундаментальные вопросы для физики. , endosome and bacterial movement raises fundamental questions in physics. Как движение м.б. разложено на составляющие силы? Какрвы физические основы сил, базирующихся на полимеризации?

Cell movement


Структурный остов клетки состоит из трех разных филаментозных компонентов, которые собираются в сети и регулируют клеточную форму: актиновые филаменты, микротрубочки и промежуточные филаменты. Промежуточные филаменты вносят вклад в эластические свойства клетки, но мало участвуют в обеспечении подвижности клетки, тогда как актиновые филаменты и микротрубочки высоко динамичны, собираются и разбираются, благодаря чему клетка движется. Дополнительно к этим актиным движениям актиновые филаменты и микротрубочки подвергаются термальным флюктуациям. Способ, с помощью которого каждый тип филамент вносит вклад в клеточную архитектуру предопределяется сохранением длины филамент, которые имеют типичную длину, при которой филаменты начинают спонтанно изгибаться под действием термальных флюктуаций. Актиновые филаменты имеют персистирующую длину примерно в 15 µm [3], а микротрубочки имеют персистирующую длину в пределах 1–6 mm [4]. Свободные микротрубочки являются поэтому полностью ригидны по клеточной шкале, тогда как актиновые филаменты являются более гибкими, что связано с разными ролями двух типов филамент в подвижности. Термальное искривление, сопровождаемое ростом и реляксацией одиночных микротрубочек [5] или актиновых филамент [6], м. генерировать движущие силы.
Микротрубочки вносят вклад в клеточную подвижность, хотя ползание амёбоидных клеток может осуществляться столь же успешно и в их отсутствие [7]. Актин, однако, абсолютно неоходим для клеточной локомоции; двиижение клеток по субстрату характеризуется lamellipodium, оснащенному высоко динамичными актиновыми филаментами, которые продвигают клетку вперед. Рука об руку с актиновыми филаментами действуют миозиновые молекулярные моторы, которые взаимодействуют с актиновыми филаментами, используя их как тракты для транспорта клеточных грузов или смещения актиновых филамент относительно др. др. Эта последняя функция, как полагают, важна для клеточного движения, хотя перекрываемость (redundancy) миозинов в клетках делает это трудным для проверки в обычных нокаутных экспериментах. Напр., myosin II knockout мутанты у Dictyostelium всё ещё могут двигаться, хотя их поведение существенно меняется [8].

Biochemistry


Биохимический каскад, который ведет к полимеризации актина в клетках, сложен, но многие компоненты уже идентифицированы. Наблюдения в клетках разветвленных филамент возбуждало интрес в течение многих лет и понуждало к теоретическому моделированию[9], т.к. актиновые филаменты, полимеризующиеся in vitro, были линейны. Основной прорыв связан с идентификацией белкового комплекса, комплекса родственных актину белков 2 и 3 (Arp2/3), в точке разветвления актина10,11. Arp2/3 является уникальной формой по сравнению с др. branching белками, такими как filamin [12], т.к. он также является nucleator полимеризации актина; он активируется путем взаимодействия с членами семейства Wiscott Aldrich syndrome protein (WASP), закрепленных на плазматической мембране [13]. Позднее снова возродился интерес к неразветвленным филаментам в клетках, которые присутствуют во всем lamellipodium [14], а также в специализированных структурах, таких как филоподии [15]. Внимание переключилось на систему Arp2/3-независимой полиеризации, такую как formin белки (rev.[16]), и белки, которые, по-видимому, защищают филаменты от Arp2/3 ветвления, такие как семейство белков Ena/vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP), которые,по-видимому, отсоединяют филаменты от места, где полимеризация инициируется (nucleated)17-19.. Недавние исследования подтвердили важность биохимических факторов для детерминации функц ии актиновой сети, показав, что ведущий край клетки имеет молекулярно самостоятельные актиновые области, которые играют разные роли в выпячиваниях [20].

Model biomimetic systems


Одним из экспериментальных подходов, используемых для решения вопроса о том, как сборка актиновых мономеров может генерировать силу, является использование stripped-down системы, более простой, чем клетка, которая воспроизводит движения посредстом полимеризации. Первой широко исследованной системой были бактерии Listeria monocytogenes, которые движутся со скоростью порядка нескольких µm/min внутри клетки за счет полимеризации актина на её поверхности [21]. Эти актиновые филаменты ориентированы своими колючими концами в направлении движения. Эндоцитотические пузырьки обладают сходным типом подвижности. Для этих движений не требуется миозин, а механизм полимеризации актина является тем же самым, что и в клетках за исключением того, что рекрутирование Arp2/3 осуществляется с помощью бактериального трансмембранного белка, называемого ActA [22]. Бактериальный комета-подобный хвост создается актиновыми филаментами, поперечно связанными с помощью белков из цитозоля, что придает комете эластические свойства полимерной сети, для которой характерны эластичные модули порядка 103 - 104 Pa23,24. Движения Listeria активно изучались с помощью клеточных экстрактов вместо клеток, это позволяло регулировать смесь, в которой изучалась подвижность, и это привело к идентификации важных компоентов подвижности, базирующейся на актине [25]. В дополнение к определенным белковым инградиентам образование кометы нуждалось в асимметричном распределении ActA (rev. [26]).
Логическим продолжением работ с Listeria стало замещение бактерий не-биологическим грузом, т.к. единственным бактериальным вкладом в формирование кометы был белок ActA на поверхности. В самом деле, сферические polystyrene кусочки, покрытые вариантами ActA или WASP, формировали хвосты комет и перемещались, если помещались в клеточные экстракты или чистую смесь белков27,28. Во всех случаях не было необходимости в усложненном введении белков, т.к. простая адсорбция белка или фрагментов белка на кусочке (bead) не нарушала белковой активности. В этих экспериментах осталось неясно, как скорость связана с размером кусочка, т.к., по-видимому, скорость зависела от обработки экстракта, а в очищенной белковой смеси увеличение размера кусочка кратно 10 приводило к прерывистому движению, при котором только средняя скорость может быть определена [28].

Squeezing forces in actin-based propulsion


Аналогично резине, др. полимерная сеть, актиновый гель, обладает эластическими свойствами, которые зависят от биохимических условий, при которых собирается актиновая сеть29,>30. Эти эластичесие свойства, как полагают, играют важную роль в подвижности клеток [31] и могут быть экспериментально смоделированы в in vitro системах, состоящих из липосом, заполненных актиновой сетью [32], хотя в клетках, в отличие от липосом, образуется иная структура сети в зависимости от локализации внутри клетки [33]. На mesocopic шкале (больше, чем молекула, но меньше, чем груз) эластические свойства актиновой сети, синтезируемой путем добавления мономеров к поверхности или кусочка, или Listeria, д. генерировать stress34,35. Реляксация после такого стресса дает в результате движущую силу; актиновый гель протискивает кусочек вперед (Рис. 1).
Использование способных к деформациям грузов предоставило наглядную демонстрацию наращивания стресса и проталкивания (squeezing). Липосомы36,37., эндосомы [38] и капельки масла39,40 деформируются в грушевидную форму, когда приводятся в движение с помощью актиновых комет. Актиновый гель сжимается по бокам объекта и удаляется с тыла, приводя иногда к формированию трубок, которые развивают тянущие силы, приложенные к тылу мягкой капли или липосомы [Boukellal, unpublished; Upadhyaya, unpublished] или к hollowing-out комет в случае твердых кусочков [18]. Анализ контуров деформируемых объектов показывает качественное распределение нормальных стрессов вдоль поверхности груза. В случае капелек масла, где межфазное (interfacial) натяжение измеримо, могутт быть подсчитаны реальные значения для нормального стресса [40]. Однако, мягкие объекты являются только сенсорами стресса, но не сенсорами силы, поэтому ни один из этих экспериментов не позволил измерить общие усилия, оказываемые на груз, которые получаются в результате интегрального давления (stress) на поверхность и следовательно, учитываются как compression, так и aspiration stresses. Фактически, интегрирующий нормальный компонент стресса сводит силу к нулю, независимо от очертаний капли, независимо от пространственных вариаций в натяжении поверхности способного к деформаци груза и это необходимо иметь в виду [40].

Attachment of the comet to the load


Во время движения, squeezing эффект встречает препятствия за счёт трения между поверхностью груза и актиновым гелем [35] (Рис. 1); это является внутренним по отношению к comet–load системе, и не вступает в конфликт с наружными вязкими помехами, обсуждаемыми в следущей секции. Эти препятствия объясняются тем фактом, что имеются молекулярные связи, перпендикулярные направлению движения, между актиновыми филаментами в комете и nucleators на поверхности, как это было продемонстрировано в экспериментах на Listeria [23] или кусочках [24]. Молекулярное сцепление между грузом и кометой является самым слабым сцеплением в системе [24]; однако, из-за того, что мономеры вставляются на поверхности груза, оно необходимо, чтобы обрисовать сценарий с временным сцеплением актиновых филамент с поверхностью 6,35. В этом случае, белки, такие как VASP, которые ускоряют отсоединение филамент от поверхности, должны, как ожидается, увеличивать скорость, что и наблюдается в biomimetic системах [17] и в клетках на короткой временной шкале [19]. Увеличение скорости, наблюдаемое в случае полых (hollow) комет 18,41, может также объяснять снижение внутреннего трения, вызываемого потерей прикреплений филамент в центре комет. Т.к. силы трения, вызываемые скольжением (slippage) актинового геля на поверхности груза, присутствуют только в случае не-нулевого искривления (non-zero curvature). Случай плоской поверхности, изученный недавно [42], соответствет другому режиму по сравнению с тем, что описывается elastic-friction моделью, т.к. силы трения являются нулевыми (поверхность перемещается почти параллельно по отношению к направлению роста актиновых филамент) и так возникают squeezing силы. Если это происходит, то скорость по плоской поверхности д.б. равной скорости полимеризации актинового геля, чего не происходит в случае искривленных объектов.

Force estimates and movement dynamics


Микрометровые кусочки и Listeria перемещаются со скоростями порядка нескольких µm/min, в зависимости от условий среды. Эти движущиеся объекты испытывают препятствия со стороны вязких сил трения, которые соответствуют 6??RV для сферического объекта размером в R, движущегося со скоростью V в среде с вязкостью ?. Для Listeria или кусочков в клеточной среде силы вязкости порядка 10-17 Newton. Такого же типа вязкое трение действует на кометы, когда они образуются. Т.к. силы вязкости возрастают с размером движущегося объекта, то вскоре длина кометы становится больше, чем резмер кусочка, сила вязкости становится больше на комете, чем на кусочке и в результате кусочек перемещается вперед, тогда как комета остается неподвижной. Сила, которую вызывает полимеризация актина на твердый кусочек находится в пределах nanoNewton, как это удалось измерить непосредственно с помощью микроманипуляций, при которых кусочек прикреплялся к растяжимому микроволокну, которое дейстовало как определитель силы [24]. Эта сила на несколько порядков величин выше, чем вязкое трение, которое противодействует движущимся объектам в растворе, она объясняет, почему движущиеся Listeria и кусочки не очень чувствительны к усилителям вязкости43,44. В самом деле, удерживающая (stall) сила, которая необходима для остановки движения, для приводимого в дивжение в 2 µm кусочка подсчитана как 7 nanoNewton по кривой сила-скорость, она сравнима с эластической и силой трения [24]. Это согласуется с nanoNewton рангом сил, продуцируемых клетками, измеренными с использованием субстрата в качестве сенсора силы [45].
Взаимодействие между squeezing силой и внутренними силами трения может двать в результате stick-slip феномен, в зависимости от относительного занчения каждого эффекта. В самом деле циклы между высокой и низкой скоростью с пространственной периодичностью сходны с размером объекта наблюдаются экспериментально [28], из этого истекает следующее: после периода быстрого движения, эластическая энергия, первоначально сохраняемая в актиновом геле, почти полностью расходуется (relaxed), эластическая движущая сила близка к нулю и скорость минимальна. Во время этого периода, однако, полимеризация происходит наиболее быстро, т.к. имеется мало обычных стрессов, чтобы ей препятствовать. Актиновый гель накапливается и напряжение (stress) растет вплоть до достижения критического занчения, при котором большая састь соединений между кусочком и гелем разрывается. Это обусловливает быстрое увеличение скорости до максимального размера. Как только stress ослабляется, скорость быстро снижается назад до минимального размера.

Symmetry breaking


В системе с кусочками актиновое олачко, которое первоначально гомогенно, д. поляризоваться, чтобы сгенерировать комету. Этот феномен интереасен физикам как ‘symmetry breaking’ является общим проявлением в физических системах, от механики до электромагнетизма. При mesoscopic анализе, инициальное состояние системы является истекает из актинового геля, который находится под натяжением, которое продуцируется путем инкорпорации мономеров между поверхностью кусочка и уже существующим гелем (Рис. 1). При сферически гомогенном режимеэто натяжение вызывает в результате ограничения увеличения геля вокруг маленьких кусочков (<5 µm радиусом) [34]. Для кусочков больших рамеров рост актинового геля лишь ограничен скоростью диффузии актиновых мономеров [46], хотя порог размеров для ограничения диффузии зависит от экспериментальных биохимических условий. До тех пор, пока толщина геля гомогенна, распределение stress остается униформным вдоль поверхности кусочков. Присутствие любой локальной негомогенности д. индуцировать изменения толщины и тем самым м. вызывать более высокое натяжение в точке, где гель тоньше [47](Рис. 1). Как следствие этого, гель будет разрываться или деполимеризоваться в тонкой области и комета будет расти на противоположной стороне кусочка. Разрыв м. приводить к критическим stress, возникающим в результате линейного соотношения между временем symmetry breaking и размером кусочка, как это наблюдалось экспериментально [28].

Conclusions


Biomimetic systems have provided a powerful tool for understanding the mechanism of actin-based movement and have paved the way for the development of physical explanations of polymerization-based propulsion. Abiotic systems [48] and non-actin-based systems [49] that reproduce the movement observed with actin polymerization could be interesting for testing the models. It remains to be seen how the elastic properties of the actin network, which trigger movement when actin polymerizes on convex surfaces, contribute to movement in the more complex geometry of the cell membrane. A precise study of the cell contour, correlated with movement, would shed light on this question.
Сайт создан в системе uCoz