Neph1 and nephrin interaction in the slit diaphragm is an important determinant of glomerular permeability
J Clin Invest. 2003 July 15; 112 (2): 209-221 | |
|
Neph1-deficient mice develop nephrotic syndrome at birth, indicating the importance of this protein in the development of a normal glomerular filtration barrier. While the precise subcellular localization of Neph1 remains unknown, its relationship with other components of the glomerular filtration barrier is of great interest in this field. In this paper, we localize the expression of Neph1 to the glomerular slit diaphragm by immunogold electron microscopy in rodents and describe its direct interaction with two other components of the slit diaphragm, nephrin and ZO-1. Both native and recombinant Neph1 associate with each other as dimers and multimers and interact with nephrin via their extracellular segments. Disruption of the Neph1-nephrin interaction in vivo by injecting combinations of individual subnephritogenic doses of anti-Neph1 and anti-nephrin results in complement- and leukocyte-independent proteinuria with preserved foot processes. This disruption modestly reduces Neph1 and nephrin protein expression in podocytes and dramatically reduces ZO-1 protein expression via the interaction of ZO-1 PDZ domains with the cytoplasmic tail of Neph1, independent of changes in mRNA expression of all three genes. The interaction between nephrin and Neph1 is specific and not shared by either protein with P-cadherin, another integral slit diaphragm protein. The interaction between nephrin and Neph1 therefore appears to be an important determinant of glomerular permeability.
 Рис.1. | Cloning and characterization of mouse Neph1.  Рис.2. | Characterization of native and recombinant mouse Neph1 by Western blot.  Рис.3. | Localization of Neph1 in adult and developing rodent glomeruli.  Рис.4. | Immunogold localization of Neph1 to the slit diaphragm in adult rat glomeruli.  Рис.5. | Composite Western blots showing the association of native  Рис.6. | The induction of heterologous-phase proteinuria in rats by combinations of anti-Neph1 and anti-nephrin in individual subnephritogenic doses.  Рис.7. | Electron micrograph of rat kidney taken 24 hours after injection of the anti-Neph1 and anti-nephrin combination  Рис.8. | Composite Western blot analysis of (a) the expression of recombinant FLAG-tagged PDZ domains of mouse ZO-1 and (b) the association of Neph1 with FLAG-tagged ZO-1 PDZ domains by coimmunoprecipitation.  Рис.9. | Composite image showing protein (a and b) and mRNA (c–g) expression in rat glomeruli of Neph1, nephrin, and ZO-1 24 hours after the injection into rats of anti-Neph1 or anti-nephrin alone, or a combination of both.  Табл.1 . | Urinary protein excretion in response to anti-Neph1 and anti-nephrin  Табл.2 . | Urinary protein excretion in response to anti–P-cadherin  Табл.3 . | Urinary protein excretion in response to subnephritogenic doses of Ab's  Табл.4 . | Densitometric analysis of protein expression  Табл.5 . | ΔCt values for mRNA expression of individual groups and 2–ΔΔCt values of difference between combination and individual groups by real-time PCR |
К настоящему времени охарактеризовано большое число генов, имеющих отношение к биологии подоцитов и щелевой диафрагмы. Некоторые из них кодируют транскрипционные факторы и, как предполагается, регулируют экспрессию белков подоцитов (1-3), но подавляющее большинство кодирует структурные компоненты foot process подоцитов или щелевой диафрагмы. Поскольку локализация ZO-1 (4) и mAb 5-1-6 антигена (5), соответственно, в цитоплазме и внеклеточно по отношению к щелевой диафрагме была главным моментом этих исследований, открытие нефрина (6) дало широкий простор для идентификации других новых протеинов. Таким образом, быстрое открытие белков: CD2 AP (7), подоцина (8), α-актинина 4 (9), P-кадгерина (10) и FAT (11) - компонентов foot process подоцитов/комплекса щелевой диафрагмы, недавняя идентификация фильтрина (12), а также получение характеристик mAb 5-1-6 как анти-нефринового антитела (13) несомненно являются одними из наиболее важных достижений в изучении процессов развития за последние 4 года.
Цель настоящего исследования - охарактеризовать Neph1, ген, по которому у стволовых клеток эмбрионов мышей недавно были получены мутации с помощью метода высокопроизводительного (high-throughput) мутагенеза(14). У мутантных мышей-потомков этих стволовых клеток с рождения развивался нефротический синдром, что подчёркивает важность Neph1 для развития нормального гломерулярного барьера фильтрации. Электронная микроскопия почек мутантных мышей показала отсутствие формирования нормального foot process и наличие в клетках некоторых типов (включая подоциты) слияния Neph1-β-geo транскриптов. Методом Northern-блоттинга отдельныq транскрипт размером 9 kb был обнаружен в нескольких органах, причём высокий уровень экспрессии наблюдался в почках. Согласно опубликованным данным (14), последовательность кДНК гена Neph1 человека кодирует пять Ig-подобных доменов и трансмембранный домен, у мыши коинтеграт имеет только четыре Ig-подобных домена при отсутствии трансмембранного. Более поздняя работа (15) включала полноразмерный сиквенс и мыши, и человека и описывала взаимодействие белка Neph1 с подоцином. В то время как экспрессия Neph1 в подоцитах не вызывает сомнения, вывод о его локализации в щелевой диафрагме был сделан на основе нефротического фенотипа, наблюдающегося у мышей Neph1-/-, и взаимодействий белок-белок (16).
В данной статье мы приводим доказательства наличия субклеточной локализации Neph1 в гломерулярной щелевой диафрагме, полученные с помощью immunogold электронной микроскопии. Нами установлено, что Neph1 взаимодействует с нефрином in vitro и in vivo, и что это взаимодействие является важным фактором в поддержании нормальных характеристик проницаемости щелевой диафрагмы. Мы также изучили ассоциацию PDZ-доменов белка ZO-1 с цитоплазматическим концом белка Neph1 и предлагаем новую модель функциональных свойств щелевой диафрагмы. РЕЗУЛЬТАТЫ Рис.1а отражает результаты клонирования гена Neph1 мыши. Структурный анализ гена показал наличие в его составе 15 экзонов, занимающих на хромосоме 3 район размером 57.4 kb, а также диспропорциональную протяжённость (42.7 kb) первого интрона. Была установлена полная идентичность между прогнозируемыми экзонами и последовательностями кДНК исследованных нами мышей. При анализе доменов прогнозируемого белка (рис. 1b) были выявлены: сигнальный пептид (AAs 1-47), пять Ig-подобных доменов, причём средний из них перекрывался с PKD-подобным доменом; RGD-последовательность (AAs 437-439); трансмембранный домен (AAs 529-551) и цитоплазматический конец (552-789). Наиболее важные участки цитоплазматического конца - Grb2 SH2-сайт (637) и PDZ1-мотив (787). Другим мотивом цитоплазматического конца является Itk SH2 (672). Заметим, что наличие Itk-киназ в подоцитах ещё никем не было описано.
На рис.2 представлены результаты Western-блоттинга. Вес белка Neph1 у грызунов - 110 kDa, установленный нами, совпадает с приведённым Sellin и соавторами (15), но превышает описанный в другой работе - 90 kDa (27). Это различие может быть связано с посттрансляционной модификацией белка.
Рис.3 даёт представление о результатах локализации Neph1 в гломерулах грызунов: взрослых крыс (a-c) и развивающихся мышей (d-f). Совместная локализация белков Neph1 и CD2 AP была отмечена для развивающихся почек мыши на стадии прекапиллярной петли (15 дней). Эти данные дополнены результатами локализации Neph1 в щелевой диафрагме гломерул взрослых крыс (рис.4) с помощью immunogold электронной микроскопии. В то время как Donoviel с соавторами отметили наличие слияний Neph1-β-geo транскриптов в подоцитах, париетальных эпителиальных клетках и мезангиальных клетках, нашей группой было доказано, что гломерулярная экспрессия Neph1 ограничивается подоцитами.
Эксперименты по коиммунопреципитации (рис.5) были поставлены для изучения потенциально возможного взаимодействия между тремя белками щелевой диафрагмы: Neph1, нефрином и Р-кадгерином. Полученные нами результаты, в частности, показывают, что взаимодействие Neph1-нефрин происходит первоначально на уровне внеклеточных сегментов этих белков.
На рис.6-7 и в таблицах 1-3 отражены результаты изучения связи Neph1-нефрин у крыс и мышей in vivo путём индукции протеинурии комбинацией антигенов. Под действием анти- Neph1 и анти-нефрина уже через 18 часов развивалась heterologous-phase протеинурия, уровень которой снижался в течение последующих двух дней.
Результаты изучения нашей группой ассоциации Neph1 с белком ZO-1, несомненно доказывающие её наличие в цитоплазме щелевой диафрагмы, представлены на рис.8.
Наконец, в таблице 4 и на рис.9 отражены результаты исследования экспрессии белков и мРНК нефрина, Neph1 и ZO-1 в случае дисфункции щелевой диафрагмы, индуцированной антигенами: анти- Neph1 и анти-нефрин. ОБСУЖДЕНИЕ За два десятилетия были установлены интересные факты в структуре и функционировании капиллярной петли гломерулы (29-31). Большое число исследований последних лет посвящено относительному значению подоцитов в сравнении с белками базовой мембраны для поддержания фильтрационного барьера (24). Основываясь на обнаружении врождённого нефротического синдрома у мышей-мутантов по гену Neph, Donoviel с соавторами (32) сделали заключение важной роли этого гена в нормальном развитии и функционировании капиллярной петли гломерулы. Sellin с соавторами (15) описали взаимодействие белков Neph1 и подоцина in vitro, распределение Neph1 в капиллярной петле гломерулы и трансактивацию AP-1 в присутствии Tec-киназ. Наша работа чётко доказывает, что Neph1 - белок щелевой диафрагмы.
Изучение коиммунопреципитации при использовании анти-Neph1, анти-нефрина и анти-FLAG с гломерулярными экстрактами и рекомбинантными белками дало серьёзные основания предполагать взаимодействие между белками Neph1 и нефрином в щелевой диафрагме на уровне их основных внеклеточных сегментов. Кроме того, мы решили нарушить это взаимодействие в экспериментах in vivo. Появление комплемент- и лейкоцито-независимой протеинурии при действии комбинации антител к анти-Neph1 и анти-нефрину, вводимых в индивидуальных субнефрогенных дозах, заставляет полагать, что это взаимодействие присутствует in vivo, и, по крайне мере, частично изменяется под действием использованной комбинации антител. Более того, индукция heterologous-phase протеинурии с помощью вышеназванной комбинации не была связана со сглаживанием/отсутствием foot process или различиями в экспрессии мРНК ZO-1, нефрина и Neph1 между подгруппами мышей с протеинурией и без оной, доказывая, что большей частью проницаемость щелевой диафрагмы зависит от взаимодействий белок-белок.
Важно заметить, что кривые дозовой зависимости, полученные как этап, предшествующий этим исследованиям, были построены для идентификации оптимума субнефрогенной дозы индивидуальных антител, но не для изучения нефрогенного потенциала индивидуальных антител в полном объёме. Действительно, у крыс и анти-Neph1, и анти-нефрин начинают увеличивать (в сравнении с сывороточным контролем) проницаемость щелевой диафрагмы в дозе 500 µl. Возможно, что будущие эксперименты, направленные на изучение нефрогенного потенциала этих индивидуальных антител, покажут более высокую степень протеинурии при более высоких дозах.
При тестировании взаимосвязи Neph1-нефрин предпочтение варианта воздействия in vivo варианту использования in vitro монослоёв культивируемых клеток гломерулярного эпителия имело несколько причин. Щелевая диафрагма является конечным барьером, который ограничивает выход белков плазмы в мочу (29). Теперь по прошествии нескольких лет стало известно, что определённые антититела к белкам подоцитов при введении их внутривенно индуцируют комплемент- и лейкоцито-независимую протеинурию (5, 33, 34). Мы получили уточнение, что антитела к белкам внеклеточных сегментов щелевой диафрагмы связываются со своими мишенями и индуцируют дисфункцию щелевой диафрагмы, которая и может выявляться как протеинурия. Классическим примером является mAb 5-1-6, который в определённых дозах индуцирует протеинурию у крыс после связывания с эпитопом на внеклеточном сегменте нефрина. Вариант исследования in vitro в этом случае был бы менее подходящим, так как нет таких культур клеток гломерулярного эпителия, способных формировать щелевую диафрагму и foot processes морфологически сходным образом с их аналогами in vivo. В дополнение культивируемые клетки склонны формировать непроницаемые, плотные соединения, которые не наблюдаются в дифференцированных подоцитах. Это может осложнять интерпретацию данных о проницаемости монослоя.
Ассоциация белка ZO-1 с цитоплазматическим концом Neph1 и взаимодействие нефрина с Neph1 в щелевой диафрагме также предполагает важность понимания изменений в белках подоцитов при развитии протеинурии. Работа дополняет проницательное наблюдение Kawachi с соавторами. (24) о том, что индукция протеинурии с помощью mAb 5-1-6, антитела к анти-нефрину, проявляется в уменьшении количества гломерулярного белка ZO-1. В обсуждавшейся анти-Neph1/анти-нефриновой модели гломерулярный белок ZO-1 не изменялся в сравнении с контролем, когда крысам вводили анти-нефрин в дозе, недостаточной для развития протеинурии. Некоторое уменьшение содержания гломерулярного белка ZO-1 было отмечено только при инъекции анти-Neph1, доказывая дополнительно прямую связь ZO-1 с Neph1. Наиболее серьёзное уменьшение, однако, наблюдалось, когда комбинация антител индуцировала heterologous-phase протеинурию. Данный факт показывает, что взаимодействие между нефрином и Neph1 способствует частичной стабилизации связи Neph1 с ZO-1, и что нарушение этой связи приводит к быстрому уменьшению количества гломерулярного ZO-1. Это позволяет нам постулировать, что макромолекулярный комплекс nephrin/Neph1/ZO-1 представлен в щелевой диафрагме и может быть изменён при некоторых формах протеинурии. Которое из двух антител к анти-нефрину, вводимое в высоких дозах, уменьшает количество гломерулярного белка ZO-1, будет объектом последующих работ, направленных на изучение нефрогенных аспектов этих антител. Было бы интересно провести сходные исследования с mAb 5-1-6.
Существенное количество новых данных, представленное в разделе РЕЗУЛЬТАТЫ, позволяет нам предложить следующие усовершенствования в организации молекул белка Neph1 щелевой диафрагмы. Существование гомодимерной и мультимерной форм Neph1, коиммунопреципитация нефрина с нативным белком Neph1, селективная коиммунопреципитация нефрина с рекомбинантным экстрацеллюлярным Neph1, наконец, индукция комплемент- и лейкоцито-независимой heterologous-phase протеинурии путём комбинации антител к анти-нефрину и анти-Neph1 в субнефрогенных дозах - всё это способствует возникновению возможной конфигурации. Гомодимеры/мультимеры Neph1 в щелевой диафрагме могут располагаться рядом, бок о бок или прилипать друг к другу в момент прохождения прилежащего foot processes. Также весьма вероятно, что Neph1 формирует дополнительные гетеродимеры с молекулами нефрина либо бок-о-бок или конец-в-конец от соседних foot processes. Хотя обе гомодимерные ассоциации Neph1 и агетеродимерная ассоциация с нефрином, по-видимому, важны в поддержании характеристик проницаемости щелевой диафрагмы, развитие протеинурии после воздействия субнефрогенной комбинацией антител выше, чем после воздействия индивидуальными антителами. Этот факт позволяет отводить в появлении протеинурии более важную роль последнему механизму. В дополнение к приведенным выше данным вероятность взаимодействия Neph1-нефрин подтверждается также наличием взаимодействия у Drosophila между Hibris и Dumbfounded, двумя белками структурно сходными с нефрином и Neph1, соответственно, во время слияния миобластов (35). Также, взаимосвязь между нефрином и Neph1 была показана совсем недавно в двух других работах (27, 36).
Пока нет исследований потенциально возможного взаимодействия Neph1 или нефрина с белком FAT, членом суперсемейства кадгеринов, который также затрагивает щелевую диафрагму (11). Интересно, что FAT также имеет PDZ-связанный мотив, для которого в недавней публикации, посвящённой ассоциации между Neph1 and ZO-1, не была показана связь с ZO-1 (28). Более того, имеющиеся данные позволяют предположить, что большие кадгерины, такие как члены семейства FAT, совсем не могут быть включены в адгезию, но могут играть опознавательную роль (37). Методом RT PCR было показано, что два родственных Neph1 гена: Neph2 и Neph3 экспрессируются в кортексе почки человека (15). Точная клеточная и субклеточная локализация ещё только ожидается. Будущие исследования, необходимые для изучения в щелевой диафрагме других ассоциаций белок-белок, могут также оказаться важными для понимания механизмов поддержания фильтрационного статуса этой структуры.
|