Посещений:
Спецификация Позвонков

Передача сигналов Notch

Specification of vertebral identity is coupled to Notch signalling and the segmentation clock
Ralf Cordes, Karin Schuster-Gossler, Katrin Serth and Achim Gossler
Development 131, 1221-1233 Published by The Company of Biologists 2004 doi:10.1242/dev.01030

To further analyse requirements for Notch signalling in patterning the paraxial mesoderm, we generated transgenic mice that express in the paraxial mesoderm a dominant-negative version of Delta1. Transgenic mice with reduced Notch activity in the presomitic mesoderm as indicated by loss of Hes5 expression were viable and displayed defects in somites and vertebrae consistent with known roles of Notch signalling in somite compartmentalisation. In addition, these mice showed with variable expressivity and penetrance alterations of vertebral identities resembling homeotic transformations, and subtle changes of Hox gene expression in day 12.5 embryos. Mice that carried only one functional copy of the endogenous Delta1 gene also showed changes of vertebral identities in the lower cervical region, suggesting a previously unnoticed haploinsufficiency for Delta1. Likewise, in mice carrying a null allele of the oscillating Lfng gene, or in transgenic mice expressing Lfng constitutively in the presomitic mesoderm, vertebral identities were changed and numbers of segments in the cervical and thoracic regions were reduced, suggesting anterior shifts of axial identity. Together, these results provide genetic evidence that precisely regulated levels of Notch activity as well as cyclic Lfng activity are critical for positional specification of the anteroposterior body axis in the paraxial mesoderm.


Рис.1.  |  Название

Табл.1 Название

Позвоночный столб является сегментированной структурой у всех позвоночных. Сегментированный паттерн устанавливается рано во время эмбриогенеза путём генерации сомитов. У большинства видов позвоночных сомиты являются блоками эпителиальных клеток, которые конденсируются последовательно из параксиальной мезодермы по обеим сторонам от нервной трубки строго в передне-задней последовательности. У эмбрионов мышей первые сомиты формируются в задней области головной складки примерно на 7.75 день развития. Во время последующих 5 дней происходит прогрессивная конденсация сомитов, тогда как одновременно новые мезодермальные клетки генерируются каудально от первичной полоски, а позднее от хвостовой почки происходит удлинение эмбриона кзади (Gossler and Tam, 2002).
Образование и формирование паттерна сомитов нуждается в межклеточных коммуникациях в presomitic mesoderm (psm), обеспечиваемых с помощью пути передачи сигналов Notch. Мутации в генах, кодирующих компоненты пути Notch у мышей нарушают компартментализацию сомитов и становление и поддержание сегментных границ (Conlon et al., 1995; del Barco Barrantes et al., 1999; Evrard et al., 1998; Hrabй de Angelis et al., 1997; Kusumi et al., 1998; Swiatek et al., 1994; Zhang and Gridley, 1998). Образование сомитов осуществляется с помощью молекулярного осциллятора, называемого 'segmentation clock', который оперирует в пресомитной мезодерме и проявляет себя с помощью периодической экспрессии 'cyclic' генов. Экспрессия циклических генов происходит в виде последующей волны, которая проходит через psm однажды во время образования каждого из сомитов (Forsberg et al., 1998; McGrew et al., 1998; Palmeirim et al., 1997). Сегментационные часы тесно связаны с передачей сигналов Notch и Wnt/β-catenin: cycling гены кодируют различные компоненты Notch пути(Aulehla and Johnson, 1999; Forsberg et al., 1998; Jiang et al., 2000; Jouve et al., 2000; McGrew et al., 1998; Palmeirim et al., 1997), и негативный регулятор Wnt пути axin2 (Aulehla et al., 2003). Кроме того, мутации некоторых компонентов пути Notch также как и в Wnt3a тяжело нарушают экспрессию циклических генов (Aulehla et al., 2003; Bessho et al., 2001; del Barco Barrantes et al., 1999; Jiang et al., 2000; Jouve et al., 2000).
Во время формирования сомитов специфические особенности накладываются на сомиты в соответствии с их аксиальным положением (Gossler and Hrabe de Angelis, 1998; Hogan et al., 1985; Meinhardt, 1986). Трансплантационные эксперименты у эмбрионов кур (Kieny et al., 1972) и мышей (Beddington et al., 1992) показали, что позиционная информация устанавливается в psm до образования эпителиальных сомитов. Во время последующей дифференцировки сомитов, позиционная спецификация приводит к уникальной морфологии позвонков вдоль оси тела. Мутационный анализ показал, что гены Hox ответственны за спецификацию качественных особенностей позвонков (Krumlauf, 1994). Во время развития Hox гены активируются последовательно в соответствии со своим положением в кластере (Duboule, 1994), это приводит к уникальным комбинациям экспрессиируемых Hox генов на разных аксиальных уровнях, это обозначается как 'Hox code' (Kessel, 1991; Kessel and Gruss, 1991). В параксиальной мезодерме Hox гены в целом активируются в задней части пресомитной мезодермы и остаются экспрессирующимися в сомитах и их производных с чёткой и соответствующей экспрессией границ. Недавний анализ показал, что по крайней мере Hox гены дополнительно активируются взрывообразно в передней части psm, в результате чего возникают динамические полосы, которые коррелируют с осциллирующей экспрессией циклических генов (Zakany et al., 2001). У RBPj k мутантных эмбрионов (Rbpsuh - Mouse Genome Informatics) экспрессия циклических генов нарушена (del Barco Barrantes et al., 1999), а экспрессия Hox генов редуцирована (Zakany et al., 2001). Сходным образом, потеря или редукция Wnt3a влияет на идентификацию позвонков и экспрессию Hox генов (Ikeya and Takada, 2001), подтверждая связь между сегментационными часами, скоординированной активацией Hox генов и позиционной спецификацией. Однако, подобные альтерации качественных особенностей позвонков у мышей с нарушенной передачей сигналов Notch не отмечены. Для дальнейшего исследования функции передачи сигналов Notch в параксиальной мезодерме мы получали трансгенных мышей, которые экспрессируют в параксиальной мезодерме укороченную версию Delta1 (Dll1 - Mouse Genome Informatics), Dll1dn, которая действует как доминантно-негативная молекула у эмбрионов Xenopus и кур (Chitnis et al., 1995; Henrique et al., 1997). Эти мыши обнаруживали снижение активности Notch в psm, были жизнеспособными, но имели дефекты в сомитах и позвонках, согласующиеся с известной ролью передачи сигналов Notch при формировании передне-заднего паттерна сомитов. Кроме того, Dll1dn трансгенные мыши обнаруживают изменчивую экспрессию и пенетрантность альтерации качественных особенностей позвонков, согласующуюся с гомеозисными трансформациями. Подобным же образом гемизиготные трансгенные Dll1dn мыши, которые несут только одну функциональную копию эндогенного гена Dll1, также как и мыши гетерозиготные по Dll1lacZ нулевому аллелю, обнаруживают изменения качественных особенностей позвонков, подтверждая ранее неотмеченную гаплонедостаточность по Dll1. Также у мышей, лишенных функции Lfng (Zhang and Gridley, 1998) или экспрессирующих Lfng конституитивно в пресомитной мезодерме (Serth et al., 2003) качественные особенности позвонков менялись, а аксиальная identity сдвигалась кпереди, указывая тем самым, что уровни передачи сигналов Notch также как и циклической активности Lfng существенны для позиционной спецификации параксиальной мезодермы.

Discussion


Мы установили, что отклонения в передаче сигналов Notch в параксиальной мезодерме эмбрионов мышей меняют качественные особенности позвонков. Полученные результаты предоставляют прямые доказательства того, что координация сегментации и позиционная спецификация тканей, производных мезодермы вдоль передне-задней оси тела, нуждаются как в достаточных уровнях сигналов Notch, так и циклической активности Lfng.



Fig. 4. Homeotic transformations in the cervical vertebral column. Isolated individual vertebrae and cervical vertebral columns after Alcian blue/alizarin red staining. Ventral processes (anterior tuberculi) present at wild-type vertebrae C6 (A,A') were unilaterally or bilaterally missing (black arrowheads) in hemizygous (B,B'’) and homozygous (C,C') msd::Dll1dn and most double heterozygous msd::Dll1dn; Dll1lacZ/+ (D,D') mice. In hemi- or homozygous animals this was accompanied by the presence of ventral structures (white arrowheads, B,B',C,C') and/or transverse foraminae (arrows, B,C) on C7 and reduction of ribs at T1 (grey arrowheads, C). In msd::Dll1dn; Dll1lacZ/+ mice aberrant ventralprocesses were found on C5 or C7 (white arrowheads, D,D'). In some heterozygous Dll1lacZ mutant mice rudimentary ribs were attached to C7 (asterisks, E,E'). Arrows in (A) point to the foramina at C3-C6.

Позвоночный столб msd::Dll1dn трансгенных мышей обнаруживает незначительные дефекты, которые, по-видимому, отражают последствия нарушений полярности сомитов. В основном нормальный позвоночный столб, позволяет однозначно идентифицировать отсутствие или эктопическое присутствие характерных признаков (напр., anterior tuberculi и transverse foramina), характерных для определенных позвонков. Потеря таких признаков из некоторых позвонков и их эктопическое появление на др. указывает на изменения качественных особенностей позвонков и указывает на гомеозисные трансформации. Изменения качественных особенностей позвонков обнаружены также у мышей, экспрессирующих Dll1dn под контролем промотора Mesp2. У таких мышей не выявлено дополнительных уродств позвонков, это подтверждает, что изменения качественных особенностей позвонков у msd::Dll1dn мышей возникают независимо от дефектов, связанных с сегментной полярностью. Отсутствие дефектов позвонков показательно для нарушенного передне-заднего паттерна у Mesp2::Dll1dn мышей, это удивительно, т.к. активность Notch в передней части psm является критической при компартментализации сомитов i (Takahashi et al., 2003; Takahashi et al., 2000). Разумным объяснением м.б. то, что активность Notch у Mesp2::Dll1dn трансгенных эмбрионов выше, чем у msd::Dll1dn эмбрионов, это подтверждается остаточной экспрессией Hes5 (Fig. 5D), и этого достаточно для установления сегментной полярности. Элемент msd управляет экспрессией мРНК в задней части psm и во вновь образующихся сомитах, но его экспрессия слабая или отсутствует в передней области psm, соотвествующей S-I/S0 (Beckers et al., 2000), тогда как промотор Mesp2 управляет экспрессией специфически в этой области (Fig. 5B). Т.о., в дополнение к кажущейся строгой редукции активности Notch клетки параксиальной мезодермы эмбрионов msd::Dll1dn подвергаются воздействию редуцированной активности Notch во время большей части её прогрессии через psm, тогда как у Mesp2::Dll1dn эмбрионов активность Notch редуцирована в клетках только незадолго перед образованием сомита, это и м. вносить вклад в фенотипические различия. Формально нельзя исключить того, что экспрессия Dll1dn во вновь формируемых сомитах вносит вклад в изменения качественных особенностей позвонков. Однако, это кажется мало вероятным, т.к. экспрессия в передней части psm у Mesp2::Dll1dn эмбрионов достаточна для воздействия на качественные особенности позвонков. Кажущееся ограничение изменений качественных особенностей позвонков шейной и верхней торакальной областью у msd::Dll1dn и гетерозиготных Dll1lacZ мышей м. отражать более высокую чувствительность передних Hox генов к снижению активности Notch.
Шейная область трансгенных мышей, экспрессирующих Dll1dn, обнаруживает передние трансформации, тогда как гетерозиготные Dll1lacZ мыши, которые преимущественно имеют редуцированные Dll1-обусловленные сигналы, обнаруживают задние или двунаправленные трансформации, а Dll1dn мыши, лишенные только одной копии Dll1 имеют смешанный фенотип. Dl1dn представленный клетками сетчатки цыплят глух к восприятию сигналов Notch (Henrique et al., 1997), блокирование активности Notch осуществляется клеточно автономно. Т.о, Dll1dn, по-видимому, не только редуцирует Dll1-обусловленные Notch сигналы, но и м. также влиять на сигналы, обеспечиваемые др. лигандами и разными рецепторами, это м. приводить к разным исходам передачи сигналов Notch в psm по сравнению с редукцией только Dll1. Это м.б. не только количественным эффектом, т.к. и у Dll1dn и у Dll1dn/Dll1lacZ/+ эмбрионов экспрессия Hes5 тяжело подавляется и перестаёт обнаруживаться (Fig. 3 and data not shown). Такой способ действия доминантно-негативного Dll1 м. объяснить разные фенотипы у Dll1dn и Dll1dn/Dll1lacZ/+ мышей и м.б. подразумевать, что сигналы, обусловленные разными лигандами или рецепторами вносят вклад в позиционную спецификацию и м. действовать потенциально противоположными путями, сходными с не перекрывающимися или даже противодействующими функциями во время компартментализации сомитов (Takahashi et al., 2003).
Исходя из тяжелой редукции экспрессии Hox генов на 8.5 RBPj k мутантных эмбрионов (Zakany et al., 2001), которые лишены активности Notch, м. ожидать, что ослабленная передача сигналов Notch ведет к редукции экспрессии Hox. Результаты анализа экспрессии 15 Hox генов с помощью in situ гибридизации у Dll1dn эмбрионов между 8.5 и 10.5 днём не подтвердили эту идею, хотя нельзя исключить слабый уровень различий, который не выявляется при анализе. Однако границы передней экспрессии Hoxb6 и Hoxc5 были сдвинуты, это указывает на то, что точное позиционирование ростральной границы экспрессии Hox нуждается в точно регулируемой активности Notch в psm. В целом активация Hox в параксиальной мезодерме, по-видимому, серьёзно затрагивается только если передача сигналов Notch сильно снижена или полностью блокирована потенциально уже в предшественниках параксиальной мезодермы. Как активность Notch и регуляция транскрипции Hox генов купированы молекулярно, неясно. Трансформации качественных особенностей позвонков, передний сдвиг экспрессии Hoxb6 и позиции зачатков передних и задних конечностей, обнаруживаются у мышей с отсутствием функции Lfng или при конституитивной экспрессии Lfng. Видимый передний сдвиг экспрессии Hoxb6 у Lfng мутантных эмбрионов м.б. также ожидаем, если меньше сегментов генерируется в проспективной шейной области, тогда как абсолютная позиция границы передней экспрессии Hoxb6 вдоль передне-задней оси тела сохраняется. Недавние модели сегментации сомитов указывают на то, что взаимодействие градированного распределения FGF (Dubrulle et al., 2001) или WNT (Aulehla et al., 2003) сигналов с сегментационными часами генерирует периодический паттерн сомитов. Концептуально, увеличение крутизны градиента или снижение периодичности часов д. приводить к образованию меньшего числа сегментов, которые, во всяком случае, д. становиться больше. Т.о., если потеря Lfng будет затрагивать часы (output) и будет формироваться меньше сегментов в проспективной шейной области, то они д.б. крупнее нормальных. Однако 5 шейных сегментов у Lfng мутантных эмбрионов занимают по существу то же самое пространство, как и передние 5 сегментов WT эмбрионов (Fig. 8), это строго подтверждает, что граница ростральной экспрессии Hoxb6 в самом деле сдвинута кпереди. Положение зачатков передних и задних конечностей инвариантны у эмбрионов дикого типа и соответствуют переходам между шейной и торакальной и поясничной и крестцовой областями соотв. (Burke, 2000). Их передний сдвиг подтверждает гомеозисные трансформации во всём туловище вдоль передне-задней оси тела, это ведет к общей редукции количества сегментов в туловище.
Эксперименты на эмбрионах кур показали, что клетки psm становятся детерминированными в отношении программы сегментации и экспрессии Hox генов в передней трети psm на уровне, обозначаемом как 'determination front', который, по-видимому, предоставляет пороговый уровень FGF8 (Dubrulle et al., 2001). Расширенное воздействие на клетки FGF8 в передней части psm эмбрионов кур нарушало положение сомитных границ и сдвигало границы экспрессии Нох генов кпереди (Dubrulle et al., 2001), a hypo- и hypermorphic мутации в FGFR1 вызывали гомеозисные трансформации и лёгкий сдвиг грниц экспрессии Hox генов у эмбрионов мыши (Partanen et al., 1998), указывая тем самым, что передача сигналов FGF в передней части psm играет критическую роль в позиционировании границ экспрессии Hox. У эмбрионов мышей транскрипционный взрыв некоторых Hox генов в передней части psm коррелирует с циклической экспрессией Lfng, это ведет к идее, что транскрипционная регуляция Hox генов непосредственно перед образованием сомита происходит в ответ на циклический исход активности Notch, это м. купировать сегментацию с приобретением аксиальных качественных особенностей (Zakany et al., 2001). Трансформации качественных особенностей позвонков вдоль передне-задней оси тела у мышей без функции Lfng также как и при нециклической экспрессии Lfng в psm предоставляет прямые экспериментальные доказательства того, что циклическая активность Lfng существенна для скоординированной генерации сегментов с их позиционной спецификацией. Т.к. в целом спецификация разных анатомических регионов сохраняется, то колинеарность экспрессии Hox генов наиболее вероятно не затронута. Было предположено (Dubrulle et al., 2001; Zakany et al., 2001), что достижение точной комбинаторной экспрессии генов Hox в сомитах происходит в две ступени: во-первых, наиболее вероятно в предшественниках параксиальной мезодермы перед их вступлением в psm кластеры Hox д. прогрессивно открываться и становиться psm, и дефинитивная экспрессия генов Hox д.б. распределена по сегментным единицам вкупе с сегментационными часами. Наши результаты согласуются с критической ролью передачи сигналов Notch и циклической активностью Lfng на второй ступени, потенциально после того, как клетки пройдут фронт детерминации. Т.о., взаимодействие сигналов FGF и Notch в передней части psm м. закладывать дефинитивные ростральные границы Hox. Задние трансформации, достигаются экспериментально у трансгенных мышей с помощью эктопической более передней экспрессии Нох генов (Kessel et al., 1990; Lufkin et al., 1992; McLain et al., 1992). Скорее всего Lfng вызывает задние трансформации и передний сдвиг экспрессии Hoxb6. Это указывает на то, что активность Lfng в psm необходима для предотвращения эктопической активации или распространения экспрессии гена Hox кпереди от своей обычной границы экспрессии. Т.о., формально циклический Lfng репрессирует транскрипцию Hox генов во время закладки дифинитивных передних границ экспрессии.
Всё это демонстрирует, что как снижение передачи сигналов Notch без обнаружения нарушений экспрессии циклических генов в psm таки и нарушение циклической активности Lfng затрагивают позиционную спецификацию мезодермальных производных вдоль переден-задней оси тела. Т.о., передача сигналов Notch и более вероятно их циклическая модуляция необходимы для спецификации качественных особенностей позвонков.
Сайт создан в системе uCoz