J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 35, 32872-32879, August 29, 2003 Membrane Topology of Bves/Pop1A, a Cell Adhesion Molecule That Displays Dynamic Changes in Cellular Distribution during Development Ruth F. Knight , David M. Bader and Jon R. Backstrom

Изучали топологию в мембране Bves/Pop1A. Bves содержит два связанных с аспарагином сайта гликозилирования на N-конце и три предполагаемых мембранных домена. Проверяли, поставляется ли Bves в просвет эндоплазматического ретикулёма и там гликозилируется. Было установлено. что Bves из сердца эмбрионов кур и трансфицированных клеток гликозилируется, указывая тем самым, что N-конец молекулы клеточной поверхности является внеклеточным. Определяли ориентацию С-конца Bves.


Рис.10.  |  The carboxyl-terminal Bves construct Met128-FLAG co-immunoprecipitates full-length HA-Bves.

Во-первых, гликозилирование Bves по экзогенным сайтам внутри С-конца наблюдается только в конструкциях, которые лишены третьего мембранного домена, который, по-видимому, меняет на противоположную ориентацию С-конца. Во-вторых, ко-экспрессия Bves полной длины с растворимой СМ-терминальной конструкцией Bves, которая располагается в разных субклеточных компартментах, показала, что Bves-Bves взаимодействия происходят в цитоплазме. В-третьих, иммунореактивность эндогенного Bves на клеточной поверхности эпикардиальных клеток драматически усиливается с помощью detergent. Эти результаты указывают на то, что на клеточной поверхности мембранная топология Bves/Pop1A представлена внеклеточным N-концом, тремя трансмембранными доменами и цитоплазматическим С-концом. Предполагается, что С-конец регулирует клеточное распределение Bves/Pop1A во время развития коронарных сосудов.

Гены Popeye, Pop1, Pop2 и Pop3 являются членами недавно идентифицированного семейства, преимущественно 'rghtccbhe.ncz в сердце и скелетных мышцах. Эти гены не обнаруживают существнного сходства с ранее описанными семействами генов, но высоко законсервированы среди позвоночных. Высокре уровни мРНК Pop1 выявлены в сердце эмбрионов кур, Xenopus, мыши и человек, а также в скелетных мышцах взрослых мышей и людей. Выявляются высокие уровни мРНК Pop1 в миокарде, но е эпикарде или эндокарде. Продемонстрирована активность гена Pop1 в миотомном компоненте сомитов, в развивающихся скелетных мышцах конечностей и в сателитных клетках взрослых мышц. Гомозиготные Pop1 нокаутные мыши жиснеспособны. Однако, у них нарушена регенерация скелетных мышц после повреждения мышц cardiotoxin. Однако в противположность этим данным белок Pop1 выявлен в проэпикардиальном органе, эпикарде и сосудистых гладких мышцах сердца эмбрионов кур. Предполагается, что белок является самым ранним из известных маркёров кардиальных сосудистых гладких мышц, поэтому он назван blood vessel/epicardial substance (Bves). Было предположено, что Pop1(Bves) является новой адгезивной молекулой, обнаруживаемой в межклеточных контактах зрелых сосудистых гладки х мышц. В данной работе использованы моноклональные антитела против С-терминальных 91-358 аминокислот куриного Pop1/Bves . Продемонстрировано присутствие белка Pop/Bves в кардиомиоцитах эмбрионов кур в ходе всего развития и его отсутствие в коронарных сосудах. Подтверждена мембранная локализация белка Pop/Bves в кардиомиоцитах и миоцитах склетных мышц, это указывает на его участие в адгезии. В кардиомиоцитах его экспрессия впервые выявляется на ст. Е3 и продолжается впоть до вылупления. В скелетных мышцах белок Pop/Bves обнаруживается с 7 дня эмбриогенеза, но белок не обнаруживается в сарколемме вплоть до стадии Е11, что совпадает с образованием вторичных мышечных трубок из сателлитных клеток. Однако, чёткая локализация его в сарколемме выявляется только на ст. Е13, которая сохраняется вплоть до вылупления эмбрионов кур из яйца. Установлено, что геномный фрагмент рядом с геном Pop1/Bves соединяется с транскрипционным фактором Рах3. С помощью метода CAST-ing проведен поиск для идентификации цис-регуляторных элементов и предполагаемых генов-мишеней. Т.к. уровень мРНК Pop1/Bves редуцирован у Рах3-нулевых мутантных эмбрионов, то кажется наиболее вероятным, что Pop1/Bves является действительным геном-мишенью для Рах3.