Liu, J. et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 29 July 2004 (doi:10.1126/science.1102513)
Song, J. -J. et al. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 29 July 2004 (doi:10.1126/science.1102514)
FURTHER READING Okamura, K. et al. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev.18, 1655–1666 (2004) | | | |
RNA-induced silencing complex (RISC) обеспечивает сиквенс-специфическое молчание гена с помощью расщепления мРНК мишени, к которой он направляется с помощью комплементарных, short interfering (si)RNAs. В дополнение к siRNAs, RISC содержит белки из семейства Argonaute. Две работы в Science — групп Hannon и Joshua-Tor — предоставили убедительные доказательства, что Argonaute является энзимом, который обеспечивает расщепление мРНК во время RNA interference (RNAi). И из 4-х белков Argonaute известных у млекопитающих, Argonaute2 () является 'slicer' белком RISC у млекопитающих.
Dicer and RISC (RNA-induced silencing complex). a, RNAi is initiated by the Dicer enzyme (two Dicer molecules with five domains each are shown), which processes double-stranded RNA into 22-nucleotide small interfering RNAs36. Based upon the known mechanisms for the RNase III family of enzymes, Dicer is thought to work as a dimeric enzyme. Cleavage into precisely sized fragments is determined by the fact that one of the active sites in each Dicer protein is defective (indicated by an asterisk), shifting the periodicity of cleavage from 9–11 nucleotides for bacterial RNase III to 22 nucleotides for Dicer family members40. The siRNAs are incorporated into a multicomponent nuclease, RISC (green). Recent reports suggest that RISC must be activated from a latent form, containing a double-stranded siRNA to an active form, RISC*, by unwinding of siRNAs41. RISC* then uses the unwound siRNA as a guide to substrate selection31. b, Diagrammatic representation of Dicer binding and cleaving dsRNA (for clarity, not all the Dicer domains are shown, and the two separate Dicer molecules are coloured differently). Deviations from the consensus RNase III active site in the second RNase III domain inactivate the central catalytic sites, resulting in cleavage at 22-nucleotide intervals. Figure copied from [Hannon, G. J. 2002 #107]
Hannon, Joshua-Tor и др. affinity-очистили Argonaute-содержащий RISC комплекс млекопитающих и показали, что только когда RISC содержит Ago2 он способен расщеплять мРНК, которые комплементарны к используемым siRNA. Они также показали, что нокаутные по Ago2 мыши продуцируют эмбрионально-летальный фенотип с тяжелыми онтогенетическими дефектами. Кроме того, мышиные клетки, лишенные Ago2 - но содержащие др. Argonaute белки - были неспособны репрессировать экспрессию генов в ответ на siRNA. Этот дефект устранялся добавлением Ago2.
Используя относительно чистый Ago2, авт. смогли реконструировать активность RISC in vitro в присутствии нескольких разных siRNAs и комплементарных РНК субстратов. Хотя и возможно, что предполагаемый slicer белок очищается вместе с Ago2, однако эти находки строго указывают на то, что Ago2 является каталитической машиной RISC.
Параллельно генетическим и биохимическим исследованиям авт. определили кристаллическую структуру Argonaute белка из archaebacterium Pyrococcus furiosus. В общем структура напоминает серповидной формы основание, которое представлено N-терминальным, срединным и доменами, с доменом, удерживаемым выше основания с помощью ножко-образной области.
Structure and nucleic-acid binding of the PAZ domain
Недавно охарактеризован PAZ домен, предполагается, что он взаимодействует с 3' концами siRNAs. Сегодняшние исследования пролили свет на PIWI домен, который имеет складку, которая характерна для энзима с nuclease активностью, и сильно напоминает RNase H. RNase-H энзим расщепляет однонитчатую РНК, когда она ведется с помощью нити ДНК в гибриде ДНК-РНК, и продуцирует РНК с 3'-OH и 5'-phosphate группами, которые сходны с продуктами расщепления RISC. Более того, обе каталитические реакции оказались Mg2+ зависимыми. Эти параллели строго указывают на то, что Argonaute является неуловимым slicer (резак) энзимом.
Домен PIWI у Argonaute содержит три высоко законсервированные каталитические carboxylate группы, которые содержат одну glutamic acid и два остатка aspartate. И в самом деле, мутантный белок Argonaute, у которого законсервированный остаток аспартата был мутирован, теряет свою нуклеазную активность, хотя всё ещё связан с siRNA. Интерсно, будут ли мутации др. остатков вне 'catalytic triad' также затрагивать ферментативную активность Argonaute. Скорее всего имеютс дополнительные детерминанты, включая возможные взаимодействующие факторы, которые необходимы для полной slicer активности.
Dicer and RISC (RNA-induced silencing complex). a, RNAi is initiated by the Dicer enzyme (two Dicer molecules with five domains each are shown), which processes double-stranded RNA into 22-nucleotide small interfering RNAs36. Based upon the known mechanisms for the RNase III family of enzymes, Dicer is thought to work as a dimeric enzyme. Cleavage into precisely sized fragments is determined by the fact that one of the active sites in each Dicer protein is defective (indicated by an asterisk), shifting the periodicity of cleavage from 9–11 nucleotides for bacterial RNase III to 22 nucleotides for Dicer family members40. The siRNAs are incorporated into a multicomponent nuclease, RISC (green). Recent reports suggest that RISC must be activated from a latent form, containing a double-stranded siRNA to an active form, RISC*, by unwinding of siRNAs41. RISC* then uses the unwound siRNA as a guide to substrate selection31. b, Diagrammatic representation of Dicer binding and cleaving dsRNA (for clarity, not all the Dicer domains are shown, and the two separate Dicer molecules are coloured differently). Deviations from the consensus RNase III active site in the second RNase III domain inactivate the central catalytic sites, resulting in cleavage at 22-nucleotide intervals. Figure copied from [Hannon, G. J. 2002 #107]
Structure and nucleic-acid binding of the PAZ domain