The RNase III Dicer enzyme processes RNAs into small interfering (si)RNAs and micro (mi)RNAs. These small RNAs then function as guides for RISC (RNA-induced silencing complex) to cleave messenger RNA (siRNA) or block its translation (miRNA). New insights into RISC formation, and the role of Dicer in this process, now come from two studies published in Cell.

dsRNA | miRNA | RISC | siRNA

В первой работе группы Sontheimer and Carthew использовался изощренный генетический скрининг для идентификации глазных мутаций у Drosophila или с усиленным или ослабленным генным молчанием - или с RNA interference (RNAi). Среди мутировавших локусов были dicer-1 (dcr-1) и dicer-2 (dcr-2), кодирующие два Dicer энзима Drosophila.

dcr-2 мутанты снижают уровни siRNA и довершают RNAi дефект в глазах и зародышевой линии самок, это указывает на то, что Dcr-2 важен для процессинга dsRNA в siRNAs.

Когда авт. инъецировли в яйцеклетки Drosophila pre-processed siRNA, которая соответствует гену bicoid, то уровень транскриптов bicoid уменьшался в яйцеклетках дикого типа, но существенно не менялся в яйцах мутантов dcr-2 из-за дефектной реакции RNAi. Это означает, что Dcr-2 д. также участвовать в нижестоящей продукции siRNA на пути RNAi.

Фенотип dcr-1 RNAi менее тяжелый, чем у dcr-2 и уровни siRNA были нормальными, это согласуется с тем, что Dcr-2 является основным энзимом процессинга dsRNA. Как же м. объяснить частичный RNAi дефект? Мутантные dcr-1 яйцеклетки, инъецированные pre-processed siRNA, комплементарной транскриптам bicoid, содержат в 6 раз больше bicoid мРНК по сравнению с яйцами дикого типа. Это говорит о том, что Dcr-1 обладает также нижестоящей функцией в siRNA-зависимой RNAi.

Мутанты dcr-1 обнаруживают также онтогенетические дефекты, которые указывают на роль Dcr-1 в miRNA-обусловленном пути, обеспечивающем молчание. Dcr-1 и в самом деле существенен для продукции miRNA, т.к. уровни miRNA в мутантных dcr-1 яйцах не обнаружимы. Используя генетические подходы для miRNA-обусловленного генного молчания, авт. показали, функция dcr-1, а не dcr-2, необходима для этого процесса. Итак, Dcr-1 участвует в функции как siRNA- , так и miRNA-обусловленного генного молчания.

Dj второй своей работе группы идентифицировали процесс сборки, инкорпорирующий siRNAs в активный RISC. Эта сборка сопровождается образованием трёх отдельных комплексов - R1, R2 и R3. Эти комплексы собираются в присутствии siRNAs в экстрактах, происходящих от мух дикого типа, но не от dcr-2-нулевых мутантов.

Частично очищенные фракции, которые д. формировать R1 комплекс, обладают активностью dsRNA-процессинга, но не мРНК-расщепления. В pulse-chase эксперименте, R1 комплексы были идентифицированы в R2 и R3 комплексах, это указывает на то, что R1 м.б. инициирующим комплексом на пути сборки RISC. И как было установлено, Dcr-2 ассоциирует непосредственно с siRNAs в R1, R2 and R3.

Комплекс R2 ещё не охарактеризован, но считается, что он является промежуточным комплексом, который формирует комплекс R3. мРНК расщепляющая активность в точности совпадает с R3, это указывает на то, что он и является функциональным RISC. В самом деле в присутствии siRNA, R3 соединяется специфически с комплементарными мишенями мРНК, но не с неродственными мРНК. Др. известные ассоциированные с RISC факторы также присутствуют в R3 фракциях и очищаются совместно в виде частично преформированных 'holo-RISC' в отсутствие siRNAs.

Принимая во внимание, что Dcr-2 присутствует в активном комплексе R3, обе работы указывают на то, что siRNAs неспособны ассоциировать с RISC в присутствии лизата из dcr-2-мутантных эмбрионов, это указывает на то. что Dcr-2 необходим для siRNA-специфической сборки функциональных RISC. В присутствии dcr-1-мутантного лизата формируется R1, но R2 и R3 не выявляются - , следовательно, Dcr-1 м.б. необходим для поздних ступеней на пути сборки RISC.

Dcr-1 b Dcr-2 играют самостоятельные, но перекрывающиеся роли на пути siRNA и miRNA молчания. Dicers необходимы для функциональной сборки RISC, а у Drosophila, Dcr-1 и Dcr-2 м. непосредственно участвовать в сборке функционально отличных RISCs.