некоторые мРНК локализованы (см. [1]). И kinesin и цитоплазматический dynein участвуют в локализации мРНК в разных местах. Белок оskar является главным детерминантом для детерминации задней полярной плазмы, которая позднее даёт зародышевые клетки. Локализация мРНК
) в задней части ооцита зависит от kinesin I [12]. Однако, это не обязательно означает kinesin-обусловленный транспорт мРНК
в заднюю часть. Альтернативное объяснение исходит из наблюдения, что примерно во время накопления
на заднем конце ооцита минус концы микротрубочек ассоциируют со всем кортексом ооцита за исключением заднего его конца [13]. С помощью направленного к плюс-концам транспорта kinesin I м. предупреждать ассоциацию мРНК
с нежелательными кортикальными сайтами, гарантируя тем самым корректное накопление на заднем конце.
В противоположность зависимому от кинезина перемещению РНК у
Drosophila, была выявлена функция направленного к минус-концам перемещения мРНК с помощью цитоплазматического dynein. В ооцитах средней стадии, мРНК
bicoid (
bcd) локализуется в передней части ооцита. Он кодирует транскрипционный фактор, существенный для развития передних эмбриональных структур. Т.к. минус-концы микротрубочек накапливаются в передней части ооцитов, то микротубулярный dynein является кандидатом на роль мотора для подобного перемещения. Установлено, что специфическое нарушение функции цитоплазматического dynein в ооцитах средней стадии нарушает переднюю локализацию
bcd [14,15]. Неожиданно оказалось, что это перемещение нуждается также и в kinesin. Было предположено, что кинезин вносит вклад в рециклинг неактивного цитоплазматического динеина на плюс концах микротрубочек, позволяя динеину проходить др. раунд активного движения к минус концам [14,15]. Зависимое от динеина перемещение мРНК наблюдалось также в живых эмбрионах после инъекции флюоресцентно меченных транскриптов (см. [8]). Во время синцитиальной стадии эмбрионов
Drosophila транскрипты
pair rule генов, включая
hairy, локализуются апикально в ядрах, которые располагаются под эмбриональным кортексом [8]. Изучение этого транспортного механизма неожиданно выявило, что нарушенная локализация мутантных мРНК
hairy с нефункциональными локализационными сигналами не является результатом того, что они не включаются в RNP частицы, а результатом задержки формирования активного комплекса доставки [16]. Одним из возможных объяснений м.б. то, что корректный груз RNP каким-то образом влияет на эффективность цитоплазматического динеина, делая более быстрым целенаправленное движение.
Как ассоциированные с микротрубочками моторы сцеплены со своими соотв. грузами РНК? В двух недавних исследованиях изолированы комплексы, содержащие локализованные мРНК и ассоциированные моторные белки из нейронов [17] или эмбрионов
Drosophila [18]. Гомолог у млекопитающих RNA-связывающего белка Staufen (mStau) участвует в локализации мРНК в дендритах нейронов. Он является компонентом RNP частиц, которые перемещаются внутри дендритов, по-видимому, используя кинезин-подобные моторы в качестве движущей силы [19]. mStau был выделен как компонент messenger RNP комплексов. Mallardo
et al. [17] обогащали mStau-содержащими RNP комплексами с помощью высоко-разрешающей гель-фильтрации. Идентифицированы два комплекса: в >2 MDa комплекс и ~650 kDa комплекс. Малый mRNP комплекс, который, по-видимому, подвижен, содержит mStau1, тяжёлую цепь кинезина и две РНК, как известно, локализующиеся в дендритах - BC1 и Ca
2+/calmodulin-dependent kinase мРНК. Ohashi и др. [20] выделили mStau в качестве компонента messenger RNPs, содержащего Purα (белок, связывающий однонитчатую нуклеиновую кислоту), РНК-связывающий белок FMRP (fragile X mental retardation protein) и myosin-V. Кроме того, этот комплекс содержит РНК и ассоциирует с грубым ER и не идентифицированным кинезином.
В яичниках
Drosophila,
bcd мРНК транспортируется из питательных клеток в ооцит и затем в передний край ооцита. Локализация зависит от РНК элемента в 3'-UTR [1]. Очищен мультибелковый комплекс, который связан с функциональным элементом локализации, но не с мутантными элементами [18]. Этот комплекс содержит три РНК-связывающих белка, существенный для локализации фактор Swallow и член семейства кинезинов Nod. Swallow, как было установлено, ассоциирует с легкими цепями цитоплазматического dynein и, по-видимому, с dynein-зависимым перемещением
bcd в переднюю часть [21]. Однако, dynein не является частью очищенного комплекса. Под вопросом и то, что Nod является активным моторным компонентом для локализации
bcd, т.к. было установлено, что он лишен
bona-fide моторной активности; возможно, что вместо этого он м. поперечно связывать РНК-содержащие комплексы с микротрубочками [22]. Природа активных моторов, ассоциированных с локальными мРНК в ооцитах
Drosophila остаётся неустановленной.
Microfilament-based trafficking
Базирующееся на актомиозине перемещение мРНК активно изучалось на двух системах: фибробластах цыплят и дрожжах. Кстати, локализация дрожжевой мРНК представляет собой наиболее понятный пример myosin-зависимой локализации мРНК (см [23]). Миозин-V, She1/Myo4p, ассоциирует с локализуемыми мРНК посредством двух белков, She2p (РНК-связывающий белок) и She3p (адаптор, который связывает миозин с She2p). Белковый комплекс участвует в локализации 22 мРНК [4], включая
ASH1, который является существенным для клеточно-специфического переключения типа спаривания у дрожжей [23]. Интересно, что She1/Myo4p myosin нуждается в ассоциации со своим RNP грузом, чтобы накапливаться в сайте-мишени локализации, на кончике почки [24]. Однако, в то время как
hairy транскрипты у
Drosophila [16], по-видимому, модулируют эффективность моторов, FLIP (fluorescence loss in photobleaching) исследования у дрожжей указывают на то, что RNP груз напротив модулирует локализацию путём контроля удерживания She1/Myo4p myosin в сайте-мишени [24].
В отличие от дрожжей локализация мРНК β-actin на ведущем крае подвижных фибробластов цыплят, по-видимому, зависит от myosin-II [25]. Локализация мРНК актина необходима для собственно стимулированного сывороткой движения фибробластов. Инактивирование myosin light chain kinase и и инактивация myosin II-B тяжелой цепи ведут к нарушению локализации β-actin мРНК. Хотя и предложена модель направленного зависимого от миозина-II транспорта мРНК β-actin вдоль филамент из собранного в пучки актина [25.], но некоторые вопросы остаются открытыми. Миозины класса II являются не-поступательными (non-processive) моторами и обычно формируют филаменты с миозиновыми головками на обоих концах. Кроме того, актиновые пучки представлены филаментами смешанной полярности. Как миозины класса II myosins обеспечивают однонаправленный транспорт β-actin мРНК в таких условиях, пока не установлено. Недавно это продемонстрировано с помощью live imaging слитого белка GFP-ZBP1 (zipcode-binding protein 1) [26]. ZBP1 белок распознаёт локализационный сигнал β-actin мРНК [27] и ко-локализуется с эндогенной β-actin мРНК и актиновыми филаментами. Live imaging демонстрирует направленное движение GFP-ZBP1-содержащих частиц в направлении ведущего края. Добавление ингибитора myosin ATPase BDM (2,3-butanedione-2-monoxime) быстро прекращает это движение [26]. Это доказывает, что система actomyosin играет роль в перемещении ZBP1 и β-actin РНК, но чтобы понять, как BDM ингибирует некоторые клеточные ATPases [28] необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения роли myosin-II в доставке РНК.
Cytoskeleton and mRNA anchoring
Мы мало знаем о том, как мРНК удерживаются, достигнув места своей локализации. Возможно следующее: РНК м. закрепляться с помощью специфических факторов-якорей; они м. временно удерживаться с помощью локальной трансляции на ассоциированных с цитоскелетом рибосомах; или они м. удерживаться с помощью постоянных зависимых от моторов возобновляющихся поставок мРНК, которые диффундируют прочь от места предназначения, хотя не получено доказательств в пользу существования такого механизма.
Очень мало известно о специфических РНК-закрепляющих факторах. В фибробластах, трансляционный elongation factor EF1α участвует в локализации β-actin мРНК после её высвобождения в клеточные выпячивания [29]. EF1α соединяется и с actin и с РНК будучи уже связанной с локальной трансляцией на пересечениях актиновых филамент (см. [30]). В зрелых ооцитах
Xenopus некоторые мРНК направляются в вегетативный коритекс клетки с помощью kinesin-зависимого транспорта и удерживаются там вплоть до оплодотворения (см. [2]). Интересно, что две РНК, не кодирующие Xlsirt РНК [31] и VegT мРНК, которая кодирует T-box транскрипционный фактор [32], как полагают, м.б. закрепляющими факторами. Трансляция мРНК VegT не нужна для закрепления локализованных мРНК, это указывает на базирующийся на РНК механизм у
Xenopus для поддержания локализованных РНК. Как закрепляющие РНК факторы сами удерживаются, неясно. Ранние наблюдения указывали на то, что кортикальные микрофиламенты играют существенную роль [33], но новые данные показывают, что м.б. вовлечены кортикальная cytokeratin сеть в комбинации с кортикальным актином [34] (Рис. 2).
Figure 2. Different ways in which mRNA can be anchored. (a) In Drosophila oocytes, osk and nanos mRNAs (red) are anchored to the cortical actin meshwork (blue) by yet unknown mechanisms. Cortical actin is anchored to the membrane by moesin (green) [36]. (b) At the leading edge of fibroblasts, anchoring of β-actin mRNA (red) to the actin network (blue) is mediated by elongation factor EF1α (green) [29]. (c) In Xenopus oocytes, two different models are proposed. Left: Vg1/Xml11 mRNAs (red) are anchored via cytokeratin filaments (magenta) to cortical actin (blue) [34]. Right: mRNAs previously localized to the vegetal pole like VegT and Xlsirts (green) mediate anchoring of following localized Vg1/Xml11 mRNAs (red) [32.]. Putative factors supporting either anchoring of subcortical actin filaments to the membrane or connecting actin and cytokeratin filaments are shown in yellow.
Так, микротрубочки, необходимые для транспорта мРНК у
Drosophila, кортикальные микрофиламенты являются существенными для удержания мРНК. Генетический скрининг выявил два актин-связывающих белка, которые важны для организации кортикальной актиновой сети, которая закрепляет мРНК
osk в задней части [35,36]. Один из этих белков,
Drosophila Moesin, связывает актиновые филаменты с мембранами и м. сам служить в качестве якоря кортикальной актиновой сети.
Live imaging локализации мРНК
nanos предоставил дальнейшие доказательства того, что кортикальный актин является важным компонентом во время локализации мРНК у
Drosophila [37]. Ген
nanos кодирует организатор задней части эмбриона, а ограничение синтеза белка Nanos на заднем конце существенно для развития. Локализация мРНК
nanos в позднем оогенезе у
Drosophila является результатом диффузии мРНК в сочетании с отлавливанием этим мРНК на заднем конце. На ст. позднего ооцита, происходит быстрое перемешивание цитоплазмы (называемое 'ooplasmic streaming'). мРНК
nanos, которая достигает заднего конца во время этого процесса вливаний (streaming) секвестрируется конце с помощью локализованной в задней части зародышевой плазмы (позднее дающей зародышевые клетки) и удерживается на заднем конце. Разрушение микрофиламент с помощью лекарства latrunculin высвобождает гранулы, содержащие
nanos, это указывает на то, что актиновый цитоскелет является важным для их удержания. Др. мРНК у
Drosophila , которые локализуются во время поздних стадий оогенеза м. осуществляться сходным образом [38]. эти находки демонстрируют, что локализация РНК м.б. достигнута исключительно за счёт отлавливания специфическими кортикальными сайтами без предшествующего направленного транспорта.
A role for centrosomes in mRNA sorting?
Центросомы являются организующими микротрубочки центрами, которые удваиваются во время митоза и расходятся в дочерние клетки. Подобно сети цитоскелетных филамент они также м. участвовать в локализации РНК. Это было впервые установлено путём обнаружения, что мРНК cyclin B1 концентрируется на веретене и центросомах в делящихся яйцах
Xenopus [39]. Де-локализация мРНК ведет к ингибированию клеточного деления, указывая тем самым на важность функции для локального синтеза cyclin B1 в митотическом аппарате [39]. Сортировка РНК с участием центромер также была описана у эмбрионов моллюска
Ilyanassa obsoleta. mRNAs, кодирующие эмбриональные паттерн-формирующие белки, ассоциируют с центросомами во время деления и затем распределяются ассиметрично [40]. Сегрегированные мРНК первоначально распределяются диффузно в цитоплазме, затем локализуются возможно посредством микротубулярных моторов, направленных на минус концы одной из центросом. С помощью ещё неизвестного механизма внутренне присущие различия вежду центросомами используются этими локализуемыми мРНК, обеспечивая асимметричную сортировку. Во время деления клеток они отделяются от центросом и движутся с помощью актиновых филамент в кортекс одной из презумптивных дочерних клеток. Без центросомной ассоциации последующие ступени локализации нарушаются, указывая на то, что центросомы м. служить как место сборки для ассиметричного высвобождения мРНК в кортекс.
Conclusions
After identification of cis signals within localized mRNAs and the isolation of decoding proteins, the next step in the study of mRNA localization has been made. Imaging of fluorescently labeled RNAs now allows dissection of cytoskeleton-dependent RNA movement in living cells. Likewise, imaging will help us to understand the mechanism of RNA anchoring at target sites. In parallel, recent advances in the isolation of multiprotein complexes involved in localization will hopefully result in a dissection of the motor and non-motor components of messenger RNPs on the move.
Сайт создан в системе
uCoz