Два белка, которые д. соединиться временно др. с др. могут быть связаны взаимодействиями между определенными субдоменами одного белка и химической группой, которая временно прикреплена к другому. Классическим примером подобного процесса являются белковые домены, которые соединяются с фосфорилированными аминокислотами^1,2. В обзоре рассматриваются пост-трансляционные модификации, при которых весь белок - ubiquitin - ковалентно прикрепляется к свободным амино группам лизина боковой цепочки или к N-терминальной амино группе белка мишени^3,4. Ubiquitylation меняет молекулярный ландшафт белка и может , следовательно, влиять на взаимодействия белка с др. белками, и вообще, на трехмерную структуру белка. Мы знаем, что ubiquitin модификации могут изменять локализацию или активность белка, чтобы регулировать многие биологические процессы, включая репарацию ДНК, эндоцитоз, транскрипцию и деградацию или процессинг с помощью many biological processes, including DNA repair, endocytosis, transcription and degradation or processing by the PROTEASOME^5-10. Мы также знаем кое-что о каталитических реакциях (Box 1), которые отбирают и добавляют monoubiquitin или разные POLYUBIQUITIN CHAINS к субстратам (Рис. 1). Однако, в большинстве случаев мы мало знаем о биохимических механизмах, которые стоят ниже события ubiquitylation. Недавно было установлено, что эти механизмы используют распознавание специфических ubiquitylated мишеней с помощью 'downstream' ubiquitin-связывающих белков, которые также известны как UBIQUITIN RECEPTOR.

Ubiquitin-связывающие белки обычно имеют небольшие (20-150 аминокислот), независимо упакованные ubiquitin-binding domains (UBDs), которые могут взаимодействовать непосредственно с monoubiquitin и/или polyubiquitin цепочками. UBDs может бытьнайдены в энзимах, которые катализируют ubiquitylation или deubiquitylation (Box 1), или в ubiquitin рецепторах, которые распознают и интерпретируют сигналы от ubiquitin, конъюгированного с субстратными белками. UBDs структурно разнообразны и обнаруживаются в белках, которые содержат разные структурные свойства и которые выполняю разные биологические функции (Box 2). Присутствие UBD в белке указывает на то, что он может взаимодействовать с ubiquitin или ubiquitylated белком и может регулироваться с помощью ubiquitylation.

Как показано в Табл. 1, идентифицировано 9 модулей UBDs.

Identification of UIMs and UBA domains. Polyubiquitin цепочки, которые прикрепляются к белку могут наделять его сигналом, который будет направлять белок в протеосомы для окончательной инактивации и деградации. Цепочки ubiquitin, которые прикреплены к отбракованному белку выполняют свою роль путем связывания или непосредственно с протеосомной субъединицей или путем переноса белка, который связывает ubiquitylated белки с протеосомами. Первый ubiquitin-связывающий сайт был охарактеризован в протеосомной субъединице S5A/RPN10 белка¹¹. Последовательность S5a, которая необходима и достаточна для взаимодействий с ubiquitin короткая и простая и была использована в качестве стартовой точки в нескольких биоинформационных поисках, чтобы выявить сходные последовательности в др. белках. HIDDEN MARKOV MODELS и поиски повторяющихся данных, которые базировались на последовательности S5a идентифицировали паттерн последовательностей, известный ubiquitin-interacting motif (UIM)^12,13. Подобно исходному S5a UIM, UIMs в целом ряде разнообразных белков быстро показали, что являются непосредственными bona fide ubiquitin-связывающими мотивами (Refs 14-17).

Др. мотив, ubiquitin-associated (UBA) домен, впервые был идентифицирован с использованием биоинформационой техники как паттерн последовательностей, общий у ряда белков, которые подвергаются ubiquitylation или deubiquitylation¹⁸. Примерно в то же самое время, когда были открыты UIMs, в нескольких лаб. было показано, что UBA домен непосредственно соединяется с ubiquitin^19,20. С открытием UIMs и UBA доменов были начаты исследования UBDs. Одним из наиболее впечатляющих наблюдений было то, что UIMs и UBA домены обнаруживаются во множестве белков с разнообразными функциями и локализацией (Box 2), и оба способны связывать и monoubiquitin и polyubiquitin цепочки. Это разнообразие указывает на то, что UIM- и UBA-домен-содержащие белки могут быть рецепторами для многих типов ubiquitin сигналов.

More ubiquitin-binding domains. По пятам открытий UIM и UBA-домена были идентифицированы дальнецшие ubiquitin-связывающие мотивы с помощью YEAST TWO-HYBRID SCREENS. При скрининге использовали модифицированный ubiquitin в качестве матрицы для идентификации monoubiquitin-связывающих белков и открыли CUE (coupling of ubiquitin conjugation to endoplasmic reticulum degradation) домен^21,22. The GAT (Gga and TOM1) и PAZ (polyubiquitin-associated ZINC FINGER) UBDs были открыты случайно, когда были изолированы клоны ubiquitin при two-hybrid скрининге, при котором в качестве затравки использовали белки, которые раньше не были замечены с связывании ubiquitin^23-26. Домен PAZ, как было установлено, связывает ubiquitin в биохимических экспериментах²⁷, как и др. тип zinc finger ubiquitin-связывающего мотива, NZF (Npl4 zinc finger)мотив^28,29, а также VHS (Vps27, HRS, STAM)³⁰ и GLUE (GRAM-like ubiquitin-binding in Eap45)³¹ домены. S конце списка находится UEV (ubiquitin-conjugating enzyme variant) мотив, домен, который выглядит подобно домену E2s (ubiquitin-conjugating enzymes), но который лишен активного сайта цистеина. Несмотря на структурное сходство между каталитическими доменами UEV и E2, UEV домены не являются каталитическими и действуют как не-ковалентно связывающие убиквитин сайты в белках с сильно отличающимися функциями.

Ubiquitin-binding characteristics of UBDs. Примеры каждого из доменов представлены в Табл. 1, они, как известно непосредственно связывают ubiquitin. Для UBDs, для которых константа диссоциации (K_d) взаимодействия ubiquitin была измерена, обнаруживали связывание от среднего до слабого и , следовательно, в тех же пределах сродство связывания для каждого класса домена (Табл. 1). Кроме того, некоторые UBD семейства имели членов, которые, по-видимому, не взаимодействовали с ubiquitin совсем^15,28,32-35, это подчеркивает, что связывающие домены, которые были идентифицированы с помощью поиска мотивов, д.б. верифицированы экспериментально. Хотя один UBD, который не связывает ubiquitin, как полагают, обеспечивает гомодимеризацию³⁴, функция большинства UBDs, которые не связывают ubiquitin, неизвестна. Некоторые UBDs могут соединяться с NEDD8, который является UBIQUITIN-LIKE PROTEIN (Ubl), который содержит законсервированный участок Ile44 (см. ниже), или более удаленные Ubls (Refs 36-38).

Возникает вопрос, действительно ли UBDs в целом связывают monoubiquitin или polyubiquitin сигналы в клетках (Рис. 1a). Некоторые члены каждого класса доменов связывают monoubiquitin, но нет ни единого домена, который бы мог аккуратно быть назван, как polyubiquitin-specific связывающий домен. С др. стороны, установлено, что большинство индивидуальных доменов, которые могут связывать monoubiquitin, предпочитают связывать polyubiquitin цепочки in vitro (за возможным исключением Ref. 28). Некоторые домены даже обнаруживают предпочтение к Lys63-сцепленным по сравнению с Lys48-сцепленными цепочками^29,39 (Рис. 1b). Для некоторых белков предпочтение in vivo к polyubiquitin цепочкам имеет смысл, напр., для ubiquitin рецепторов, которые связывают polyubiquitylated белки с протеосомами⁴⁰. Для др. UBD-содержащих белков, таких как те, что участвуют в сортировке мембранных белков на ENDOCYTIC PATHWAY, in vivo мишенью является возможно monoubiquitin, т.к. эндоцитотический груз и эндоцитотическая кухня (machinery) по большей части оказываются monoubiquitylated⁶. Тип ubiquitin партнера, который предпочитается изолированным UBD, может отличаться от того, что предпочитается белком полной длины или белковым комплексом, а может также зависеть субклеточного расположения UBD-содержащего блека (напр., белок, который прикреплен к плазматической мембране, может только быть экспонированным для monoubiquitylated субстратов). Клеточные, ubiquitylated партнеры для большинства ubiquitin-связывающих белков не известны и д.б. идентифицированы, чтобы можно было разрешить эти расхождения. С этой точки зрения кажется, что разные члены из UBD классов могут распознавать разные типы ubiquitin модификаций в клетке. Индивидуальные домены класса варьируют широко не только в отношении своей ubiquitin-связывающего сродства и структурного контекста, но и вообще также в отношении типа ubiquitin, который они запрограммированы связывать in vivo.

многие белки несут множественные копии UBD. UIMs часто обнаруживаются в тандеме, множественные UBA домены присутствуют в некоторых белках (Box 2), а некоторые типы UBD могут обнаруживаться в одном и том же белке или комплексе^24,29,41 (см SMART в Online links box). В одном ubiquitin рецепторе, эндоцитотическом белке EPS15, один UIM из тандемно расположенных UIMs не способен связывать ubiquitin^15,32. Для двух др. эндоцитотических ubiquitin рецепторов биофизические данные показывают, что каждый UBD из тандемных UIMs или CUE доменов может связывать ubiquitin полностью независимо^32,42,43. Некоторые тандемные домены обнаруживают частично, но не полностью перекрывающиеся функции (Ref. 17), это указывает на то, что эти домены не связываются с отличающимися ubiquitylated партнерами. Вместо этого, каждый UBD может вносить вклад в сродство к взаимодействию с одним типом партнеров. В целом, причина, почему несколько UBDs обнаруживается во многих белках, неизвестна и может варьировать от белка к белку.

Why are UBD-ubiquitin interactions typically weak? Как указывалось выше, имеется широкий круг изменчивости сродства UBD-ubiquitin, но эти взаимодействия - особенно те, что с monoubiquitin - находятся в конце шкалы низкого сродства (они обычно имеют K_d в 10-500 μM). Межбелковые взаимодействия низкого сродства имеют прецендент. Напр., один клеточный процесс, который состоит из множества разного типа взаимодействий низкого сродства, это сборка белковой сети, которая управляет отпочкованием пузырьков от плазматической мембраны. Многие из белков, которые необходимы для этого процесса временно ассоциируют др. с др. и с мембраной. Многие типы взаимодействий, такие как те, что междуEPS15-HOMOLOGY DOMAINS м Asn-Pro-Phe (NPF) мотивами и между Src-homology-3 (SH3) DOMAINS и Pro-богатыми последовательностями, происходят во время сборки сети и эти взаимодействия имеют K_d в 5-500 μM (Refs 44-46). Образование подобных кластеров из высоко-специфичных, низкого сродства взаимодействий создают сеть, которая текуча (fluid), т.е. может подвергаться быстрой сборке и разборке, и является только временно стабильной благодаря формированию нескольких взаимодействий modular-domain-peptide. Система, следовательно, встраивает 'dynamic instability'⁴⁷, которая позволяет ей быть легко обратимой и делает возможной сборку, осуществляемую за счет взаимодействий в специфической последовательности. Т.к. стабильная сеть нуждается в многочисленных слабых взаимодействиях, то эта ситуация также предоставляет множество мишеней для регуляции, т.к. разрушение любого из взаимодействий д.приводить к разборке сети.

Слабые взаимодействия типа UBD-ubiquitin возможно физиологически наиболее подходящие, т.к. точковые мутации в слабо взаимодействующих UBD доменах, которые ингибируют связывание ubiquitin являются вредными in vivo (Refs 17,33,48). UBD-ubiquitin взаимодействия могут быть относительно слабыми, т.к. они функционируют как легко обратимые, временные белковые сети, сходные с одной из описанных выше (UBD-ubiquitin взаимодействия являются возможно частью сети, необходимой для отпочкования от плазматической мембраны пузырьков, т.к. многочисленные эндоцитотические белки имеют UBDs и/или monoubiquitylated⁶). В таком случае, модификации белков с помощью ubiquitin могут действовать как переключатели, которые распознаются UBDs и которые контролируют регулируемую сборку сети, как это предполагается для Src-homology-2 (SH2)-DOMAIN-phosphotyrosine взаимодействий и др. регуляторных переключений⁴⁹. Благодаря присутствию множества deubiquitylating enzymes (DUBs) в большинстве клеток вызываемые ubiquitin переключения могут быть легко обратимыми и индивидуально регулируемыми.

Др. причиной низкого сродства взаимодействий UBD-ubiquitin может быть относительно высокая концентрация свободного ubiquitin в клетках (подсчитано ~10 μM в клетках млекопитающих⁵⁰). Воздействие на UBD с высоким сродством делало бы их постоянно занятыми свободным ubiquitin и недоступными для связывания с ubiquitylated партнером. Итак, в случаях, для которых взаимодействие с высоким сродством между low-affinity ubiquitin рецептором и ubiquitylated партнером необходимо, то взаимодействие д.б. существенно усилено за счёт присутствия нескольких UBD мотивов в рецепторе или рецепторном комплексе, путем мультимеризации ubiquitin рецепторов или с помощью дальнейших контактов между ubiquitin рецептором и ubiquitylated мишенью. ENVELOPED VIRUSES могут использовать последнюю стратегию для усиления взаимодействий между белком хозяина и ubiquitylated вирусным белком, чтобы способствовать отпочкованию вируса. Tumour susceptibility gene-101 (TSG101) является клеточным белком, который обладает UEV доменом низкого сродства (K_d ~500 μM)⁵¹. TSG101 соединяется с вирусным белком GAG и ubiquitin индивидуально, но обладает высоким сродством к ubiquitylated Gag⁵¹. В др. примере, хотя ubiquitin-связывающие области в каталитических доменах энзимов ubiquitin-пути обычно рассматриваются как UBDs, но DUB, как было установлено, соединяется одновременно с конъюгированным ubiquitin и с областью ubiquitylated белка посредством взаимодействий, которые индивидуально слабые, но которые вместе усиливают специфичность⁵². Сходно с этими примерами и др. UBD-содержащие белки могут увеличивать свою специфичность и сродство, осуществляя контакты с ubiquitylated мишенями, используя области белка, который находятся вне UBDs.

Наконец, стабильное взаимодействие UBD-ubiquitin может происходить в случаях, в которых ubiquitin рецептор сам оказывается ubiquitylated (см. ниже) и тогда возникает внутримолекулярное взаимодействие между конъюгированным ubiquitin и UBD. В этом случае из-за высокой локальной концентрации ubiquitin, UBD-ubiquitin сродство не д. быть высоким.

Одним из способов регулирования оккупации UBDs является контроль их доступности. Некоторые UBDs соединяются с ubiquitin более эффективно, когда они вну контекста белка полной длины (напр., Refs 22,27), это указывает на то, что взаимодействия между ubiquitin и UBDs контролируются с помощью меж- и внутримолекулярных взаимодействий или с помощью пост-трансляционных модификаций. Напротив, UBA домен в белке полной длины P47 соединяется с ubiquitin более эффективно, чем p47, ассоциированный с одним из своих партнеров^28,53, это указывает на то, что воздействие на этот UBA домен регулируется путем четвертичных или quaternary структурных изменений.

Доступность UBD может контролироваться с помощью стерического закрытия. В одном ubiquitin рецепторе, который переносит белки к протеосомам, RAD23, связывание ubiquitin ингибируется с помощью внутримолекулярного взаимодействия между UBA доменом и Ubl доменом^36,38. В др. примере связывание ubiquitin с TOM1 доменом GAT конкурирует со связыванием др. партнера GAT⁴¹. Имеются и др. примеры UBDs, которые взаимодействуют с белками иными, чем ubiquitin^54,55, a вопрос, могут ли UBDs иметь несколько партнеров, остаётся открытым. Однако, ясно, что участие в др. внутри- и межмолекулярных межбелковых взаимодействиях, является механизмом, который регулирует ubiquitin-связывающую способность некоторых UBDs. Возможно, что др. механизмы регуляции UBD ещё не открыты, возможно существование кандидатов, включая тех, что участвуют в пост-трансляционных модификациях и контролируют субклеточную локализацию.

Высокий уровень консервации последовательностей и структуры для ubiquitin в ходе эволюции, по-видимому, является результатом того, что она необходима, чтобы обеспечивать связь со многими разными, структурно отличающимися UBDs. Различные структуры UBD-ubiquitin комплексов, которые выявляются с использованием рентгеновской кристаллографии или NMR спектроскопии, показаны на Рис. 2. Эти структуры очень изменчивы: UIMs образуют одиночные α-спирали, которые взаимодействуют с ubiquitin; NZF мотивы связывают ubiquitin преимущественно посредством трёх остатков, которые располагаются в петлях, которые исходят от 4-х нитей, которые упорядочены с помощью иона zinc; CUE, UBA и GAT домены формируют пучки из 3-х спиралей и две из них α-спирали упакованы против ubiquitin; a UEV домены представлены смесью из β-нитей и α-спиралей, а контакт с ubiquitin осуществляется посредством двух петель и части β-sheet.

Структура UBA-domain-ubiquitin комплекса⁵⁶, наложенная на CUE-domain-ubiquitin структуру^42,57 (Рис. 2), обнаруживают, что структуры CUE и UBA комплексов очень близки. Напротив, теоретические исследования показывают, что два UBA домена от разных белков контактируют с ubiquitin посредством одной и той же поверхности, но используют ориентации, которые отличаются др. от др. и от таковой в домене CUE⁵⁸. Хорошо бы подтвердить это экспериментально.

Подобно комплексам CUE/UBA, GAT домены упакованы в две α-спирали против ubiquitin (Рис. 2). Однако, порядок, в котором эти спирали соединяются др. с др. отличен от такового в CUE/UBA и GAT доменах, две ubiquitin-связывающие спирали CUE/UBA доменов антипараллельны, тогда как GAT спирали параллельны. Сходство между CUE/UBA и GAT доменами и одиночной спиралью UIMs также является поверхностным (Рис. 2), т.к. UIM спираль и две спирали CUE/UBA или GAT доменов располагаются поперек ubiquitin под углом, который отличается на ~60°. Итак, ряд полностью отличных складок использует разные поверхности - одиночные впирали, две соседние спирали, β-нити или петли - чтобы связывать ubiquitin.

Др. неожиданный поворот обнаружен при сравнении двух доступных структур CUE-domain-ubiquitin комплексов. В одном случае ubiquitin соединяется с одиночным CUE доменом⁴², тогда как в др. соединяется с CUE димером. В димерной структуре одна из α-спиралей в каждом домене обмениваются и это образует структуру, которая перекручивается, чтобы позволить двум эквивалентным поверхностям CUE-доменов контактировать с разными порциями одной и той же молекулы ubiquitin⁵⁷ (Рис. 2). Это структурное искажение расширяет интерфейс CUE-domain-ubiquitin с 550 A² до 870 A², так что он включает остатки вблизи С-конца ubiquitin. Такой тип связывающего взаимодействия, по-видимому, объясняет относительно высокое связывающее сродство этого определенного CUE-домен-содержащего белка с ubiquitin⁵⁷.

Дальнейшая сложность вносится за счёт UEV-домен-содержащих белков. Домены UEV человеческого TSG101 (Ref. 59) и его Saccharomyces cerevisiae ортолога, Vps23 (vacuolar protein sorting-23; Ref. 60), соединяются с ubiquitin посредством самостоятельной 'β-tongue' cnhernehs (Рис. 2), которая не обнаруживается в др. UEV-домн-содержащих белках. Напротив, UEV домен, который найден в E2 субъединице MMS2 - ubiquitin-связывающая поверхность которой была выяснена благодаря мутагенезу и NMR исследованиям^61,62 - использует разные ubiquitin-связывающие интерфейсы. Интересно, что две ubiquitin-связывающие поверхности, которые были охарактеризованы для TSG101/Vps23 и Mms2, отличались от поверхности контакта, которая была охарактеризована между E2 энзимом и его thiolester-сцепленным ubiquitin^62-64. Итак, родственные UEV/E2 структуры соединяются с ubiquitin посредством трех полностью самостоятельных интерфейсов. Эти примеры иллюстрируют замечательную приспособленность архитектуры белка и показывают, что ubiquitin-связывающая функция может быть встроена в многочисленные складки, способность, которая, по-видимому, облегчается низким сродством связывания большинства взаимодействий с ubiquitin, которые были охарактеризованы.

Хотя нет очевидных общих тем для UBD структур или для UBD поверхностей, которые контактируют с ubiquitin, но того же самого нельзя сказать в отношении сторон партнерства ubiquitin. Все UBDs, которые были охарактеризованы, контактируют с перекрывающимися поверхностями ubiquitin, которые включают Ile44 (Рис. 2). Это облегчается, частично, с помощью способности остатков, которые окружают, Leu8 - и в меньшей степени, Gly47 - чтобы перемещаться на любую строну интерфейса. Хотя интерфейсы перекрываются, они далеко не идентичны; различные UBD отпечатки на ubiquitin обнаруживают существенную изменчивость и и имеется незначительная или отсутствует совсем эквивалентность во взаимодействиях специфических остатков.

Перекрывание связывающих поверхностей может быть важным для путей, в которых ubiquitylated груз может проходить через серию белков путём последовательных взаимодействий с разными UBDs (напр., в позднем эндоцитотическом пути;% см. ниже). Т.к. одна и та же половинка ubiquitin не может одновременно взаимодействовать с двумя доменами, которые обладают общими перекрывающимися ubiquitin-связывающими интерфейсами, то ubiquitin, оказывается неприкасаемым ('hand-off') в ubiquitin рецепторе и нуждается в дополнительных, вообще-то с ubiquitin или др. ubiquitin рецептором (Ref. 65). Различия в UBD отпечатках на ubiquitin имеют и др. функциональное предназначение. Напр., некоторые UBDs используют Lys48 или Lys63, которые являются двумя ключевыми сайтами для конъюгации polyubiquitin. Это может иметь значение для распознавания polyubiquitin цепочек в противовес monoubiquitin^20,38,42.

Помимо UBDs, ubiquitin осуществляет также экстенсивные взаимодействия с многочисленными и варьирующими ubiquitin-activating (E1), E2, ubiquitin ligase (E3) и DUB энзимами ubiquitin пути (Box 1). Удивительно, но все взаимодействия между ubiquitin и этими энзимами, которые были детально охарактеризованы, также используют Ile44 сторону ubiquitin^52,64,66,67. Большое количество различных взаимодействий, которые происходят между ubiquitin и UBDs или энзимами ubiquitin-пути, по-видимому, объясняют, почему Ile44 сторона ubiquitin высоко консервативна в эволюции. Однако, это не объясняет, почему противоположная сторона также законсервирована: 13 из поверхностных остатков ubiquitin не участвуют в каких-либо из охарактеризованных взаимодействий с энзимами или UBDs, за исключением трех из них все они инвариантны у людей и S. cerevisiae. Очевидно, что др. функционально важные взаимодействия ubiquitin всё ещё не открыты.