Рекомбинационный анализ на базе эписомных рекомбинационных субстратов показал, что N-инсерции CJ не связаны непосредственно с активностью TdT, но что они в SJ непосредственно затрагиваются с помощью TdT. Однако, при рекомбинации эндогенных TCR и Ig генов N-нуклеотиды в SJ не связаны непосредственно с активностью TdT. TCRα V-D рекомбинация во взрослых тимоцитах мышей обнаруживает N-инсерции в CJ и не обнаруживает в SJ. В локусе TCRβ N-инсерции в Vβ-Dβ SJ зависят от локуса Vβ, используемого для рекомбинации. Vγ-Jγ SJ из TCRγ содержит N-инсерции (70%) во взрослых тимоцитах, независимо от использования гена Vγ, но инсерции не обнаруживаются в тимоцитах плодов с низкой активностью TdT. Не обнаружено N-инсерций ни в Vκ-Jκ СО или SJ в локусе легкой цепи Ig κ (IgLκ) спленоцитов взрослых мышей, возможно из-за отсутствия активности TdT. В локусе тяжелой цепи Ig (IgH), однако, инсерции N-нуклеотидов были многочисленными в V
SJ, тогда как оба CJ содержали многочисленные N-инсерции. Эти результаты указывают цис-действующую хромосомную потребность, а также на активность TdT, контролирующих частоту N-инсерций в SJ эндогенных Ig и TCR генов.
Локус TCRδ, Dδ и Jδ сегменты гена и Cδ ген, локализованы между Vαδ и Jα сегментами гена. Vα и Vδ сегменты фланкированы ниже с помощью 3'RSS с 23-п.н. спейсером. Два D&dlta; элемента Dδ1 и Dδ2 относительно близки др. к др. и оба фланкированы с помощью 5'RSS, содержащими спейсерную область в 12 п.н., и с помощью 3'RSS, содержащей спейсер длиной в 23 п.н. И Jδ и Jα сегменты имеют спейсерные сигналы в 12 п.н. на свойих 5' фланкирующих областях. Т.о., общий пул сегментов V гена м.б. использован для продукции генов как α, так и &delta цепей на разных стадиях дифференцировки Т клеток. Имеется некоторое перекрывание в использовании V сегмента: 7 из 11 идентифицированных сегментов Vδ гена подсемейства перекрываются с известными Vα подсемействами. Остальные 4 Vδ подсемейства, Vδ1, Vδ2, Vδ4 и Мδ5 используются исключительно для продукции генов δ цепи. Использование Vδ генов м. меняться у плодных и взрослых тимоцитов:
Vδ1, Vδ2, и Vδ3 часто экспрессируются в плодных тимоцитах, тогда как Vδ4 и, Vδ5 преимущественно взрослыми тимоцитами. Vδ6 является минорным компонентом, перестраивающимся в обоих типах тимоцитов. В плодных генах δ цепи V(D)J соединение м.б. приписано только Dδ2 и не выявляется существенного вклада Dδ1 или N области. Напротив два D элемента и N область участвуют в сборке гена Vδ во взрослых тимоцитах. Региональная хромосомная конфигурация области Vα-Vδ, пригдная для Vδ-Dδ рекомбинации, м. отличаться во время дифференцировки и т.о. ожидаются Vδ сегмент-специфические преимущественные N- инсерции в V-D SJ
Fig. 1.Schematic illustration of the standard and nonstandard PCR products of Vδ-Dδ (A, B) and Dδ1-Dδ2 (C-H) recombmation. Recombination signal sequences (RSS) and the polarity are shown as regular triangles for a 12-bp spacer signal and as long triangles for a 23-bp spacer signal, and the exons are shown by rectangles. Orientation and placement of PCR primers, p1 to p5, are shown with arrows. Recombinant ends are bracketed, SJ, signal joint; RJ. replacement joint; CJ, coding joint; PS J, pseudonormal signal joint; PCJ, pseudonormal coding joint.
В данной работе секвенировали последовательности TCRδ V-D и D-D сигнальных соединений в тимоцитах взрослых мышей, т.е. анализировали SJ продукты Vδ-Dδ1.2 и D&delta1-Dδ2 перестроек. Выявлены дифференциальные инсерции нуклеотидов в Vδ-Dδ сигнальных соединениях в зависимости от использования Vδ и Dδ генов на разных стадиях развития. Оказаловсь, что SJ из Vδ в Dδ элемент, специфицированный во взрослых клетках, обнаруживает низкую частоту N-инсерций для мажорных Vδ сегментов, но более частые инсерции в минорных Vδ сегментах на этой стадии, т.е. нуклеотидные инсерции в Vδ-Dδ сигнальных соединениях менее часты в V&delta4,5 генах, преимущественно используемых во взрослых тимоцитах, чем в V&delta3,6 генах. Выявлены также новые нестандартные продукты, "replacement joints" Dδ1 с замещением в downstream (фланкирующей последовательности) с помощью рекомбинатной сигнальной последовательности Vδ. Неожиданным оказалось открытие высокой частоты таких "replacement joints" (RJs) в Dδ1, в котором 3'RSS из Dδ1 замещен 3'RSS из Vδ. Др. RJs от Dδ1-Dδ2 рекомбинации также обнаружены. Т.к. мутация в TCRβ блокирует раннюю дифференцировку αβ тимоцитов при переходе от СD4-CD5- двойной негативной стадии к СD4+CD5+ двойной позитивной стадии и до некоторой степени редуцирует перестройку и экспрессию TCRα, поэтому мы изучали эффект мутации TCRβ на перестройку гена TCRδ цепи, организованной в том же самом генном комплексе как TCRα. Интересно, что показатель RJ был снижен и модификации сигнальных концов изменены за счёт мутации в гене TCRβ. Итак, мутации в гене TCRβ влияют на частоту нуклеотидных инсерций в Vδ-Dδ сигнальных соединениях и ингибируют образование RJ. Обсуждаются механизм рекомбинации, генерирующий RJ, и возможная роль TCRβ в усилении активности перестроек в гене TCRδ...
Сайт создан в системе
uCoz