Dsh | Fz | LRP5/6 | PCP

. Wnt signaling

Wnt белки представляют собой большое семейство секретируемых гликопротеинов, которые регулируют ключевые онтогенетические процессы, включая детерминацию клеточных судеб, пролиферацию, подвижность и установление первичных осей тела во время эмбриогенеза позвоночных [1-3]. Дефекты передачи сигналов Wnt участвуют также в патологических процессах, включая рак и дефекты нервной трубки. Wnt лиганды м. трансформировать клетки, а мутации компонентов сигнального пути Wnt, такие как β-catenin, выступают в качестве причины рака толстой кишки, тогда как мутации в Dishevelled (Dsh) участвуют в нарушениях закрытия нервных складок [1,4]. Кстати, 18 Wnt лигандов идентифицировано у людей [5,6]. Такому большому количеству лигандов соответствует такое же количество рецепторов и ко-рецепторов, которые кодируются Frizzled и low-density-related lipoprotein receptor 5/6 (LRP5/6) семействами генов, которые содержат 10 и 2 члена, соотв. в геноме человека [1,6].

A schematic representation of the Wnt signal transduction cascade. (a) For the canonical pathway, signaling through the Frizzled (Fz) and LRP5/6 receptor complex induces the stabilization of ?-catenin via the DIX and PDZ domains of Dishevelled (Dsh) and a number of factors including Axin, glycogen synthase kinase 3 (GSK3) and casein kinase 1 (CK1). ?-catenin translocates into the nucleus where it complexes with members of the LEF/TCF family of transcription factors to mediate transcriptional induction of target genes. ?-catenin is then exported from the nucleus and degraded via the proteosomal machinery. (b) For non-canonical or planar cell polarity (PCP) signaling, Wnt signaling is transduced through Frizzled independent of LPR5/6. Utilizing the PDZ and DEP domains of Dsh, this pathway mediates cytoskeletal changes through activation of the small GTPases Rho and Rac. (c) For the Wnt-Ca2+ pathway, Wnt signaling via Frizzled mediates activation of heterotrimeric G-proteins, which engage Dsh, phospholipase C (PLC; not shown), calcium-calmodulin kinase 2 (CamK2) and protein kinase C (PKC). This pathway also uses the PDZ and DEP domains of Dsh to modulate cell adhesion and motility. Note that for the PCP and Ca2+ pathways Dsh is proposed to function at the membrane, whereas for canonical signaling Dsh has been proposed to function in the cytoplasm; a recent study [10] implicates nuclear localization of Dsh in this pathway. See text for further details.

В результате интенсивных исследований был выявлен молекулярный путь передачи сигналов Wnt (Рис. 1). После соединения Wnt со своим рецептором, или Frizzled или с комплексом, представленным Frizzled и LRP5/6, сигнал передается на цитоплазматический фосфопротеин Dsh. Имеется 3 Dsh белка у млекопитающих (Dsh-1, Dsh-2, и Dsh-3), и члены семейства Dsh у всех организмов представлены тремя высоко консервативными доменами: N-терминальным доменом DIX (назван по Dsh и Axin), центральным PDZ доменом (назван по Postsynaptic density-95, Discs-large и Zonula occludens-1) и С-терминальным доменом DEP (по Dsh, Egl-10 and Pleckstrin)[7]. На уровне Dsh сигнал Wnt расходится по трем разным путям, т. наз. каноническому, не-каноническому или planar cell polarity (PCP) и Wnt-Ca²⁺ путям (Рис.1) [1,8,9]. Во всех трех путях Dsh является ключевым трансдуктором сигнала Wnt, который оперирует на плазматической мембране или в цитоплазме. Но теперь новые исследования [10] указывают на то, что Dsh функционирует также и в ядре.

Для канонической передачи сигналов, которая обеспечивает события генной индукции (Рис.1a), передача сигналов Wnt использует DIX и PDZ домены Dsh, чтобы индуцировать стабилизацию цитозольного β-catenin; это делает возможным накопление в цитоплазме и последующую транслокацию β-catenin в ядро [1]. Регуляция стабильности β-catenin обеспечивается посредством комплекса белков, включая Axin, glycogen synthase kinase 3 (GSK3), GSK3-binding protein (GBP) and casein kinase 1 (CK1). В отсутствие Wnt стимуляции, β-catenin отправляется на деградацию через протеосомный путь посредством β-transducin repeat containing protein (β-TrCP), но β-catenin стабилизируется, когда получает Wnt сигнал [1,6,11]. В ядре β-catenin формирует комплексы с членами семейства транскрипционных факторов LEF/TCF и др. транскрипционными факторами и обеспечивает транскрипцию Wnt генов-мишеней [1].

Не-канонический или PCP путь обеспечивает клеточную полярность, клеточную подвижность во время гаструляции и др. процессы путём передачи сигнала через домены PDZ и DEP в Dsh, это ведет к модификации актинового цитоскелета (Рис.1b) [8,12]. На уровне Dsh два независимых и параллельных пути ведут к активации малых GTPases Rho и Rac. Активация Rho нуждается в formin-homology protein Daam1, который соединяется с PDZ доменом Dsh, это ведет к активации Rho-ассоциированной киназы ROCK и обеспечивает ре-организацию цитоскелета [8,13,14]. Активация Rac не зависит от Daam1, нуждается в DEP домене в Dsh и стимулирует активность Jun kinase (JNK) [8,15,16]. Др. Dsh-связывающие молекулы, которые влияют на PCP путь, включают Strabismus и Prickle, но механизмы их действия остаются полностью неизвестны [8,12,17].

The Wnt-Ca²⁺pathway (Рис. 1c), как полагают, влияет на оба канонический и PCP пути[9]. Передача сигналов Wnt через рецепторы Frizzled ведет к высвобождению внутриклеточного Ca²⁺ в процессе, обеспечиваемом посредством гетеротримерных G-белков и с участи ем множества др. молекул, включая phospholipase C (PLC), calcium-calmodulin-dependent kinase 2 (CamK2) и protein kinase C (PKC) [9,18]. Путь Wnt-Ca²⁺ важен для клеточной адгезии и клеточных движений во время гаструляции.

Signal specificity

C таким устрашающим количеством Wnt лигандов и Frizzled рецепторов остаются два нерешенных вопроса действительно ли (и если да, то какие) Wnt лиганды являются специфическим для определенных путей и как сигналы канализуют (channeled) каждый путь. В особенности, когда некоторые Wnt лиганды известны как активирующие и канонически и не-канонический пути, такие как Wnt3a, тогда как др., такие как Wnt5a по-видимому, специфичны для неканонической передачи сигналов. Столь же неподдающееся пониманию и то, как сигнал передается от комплекса рецептор/корецептор к Dsh, хотя два недавних исследования выявили непосредственное взаимодействие между Dsh и Frizzled [19,20]. Более важно то, что способ, которым Dsh купируется с и распределяет передачу сигналов Wnt по трём сигнальным ветвям остаётся неясным.

Dsh занимает ключевую позицию на перекрестке всех ветвей Wnt сигнального каскада. Предполагается, что и субклеточная локализация Dsh и выбор эффекторных молекул стоящих ниже Dsh, управляют избирательностью активации специфических путей. Исследования по локализации Dsh у Drosophila [21] и у Caenorhabditis elegans [22] выявили корреляцию между локализацией Dsh на мембране и активацией PCP пути. В самом деле, мутации в домене DEP, который необходим для передачи сигналов PCP, обнаруживают нарушение мембранной локализации, что коррелирует с нарушением передачи сигналов по пути PCP [16,21]. Эти исследования выдвинули гипотезу, что мембранная локализация Dsh необходима, по крайней мере, для одного пути отправления сигналов Wnt. В не стимулированных клетках Dsh локализуется в точечных везикулярных структурах в цитоплазме [23] с помощью процесса, для которого необходим домен DIX; в ответ на некоторые Wnt лиганды Dsh транслоцируется на плазматическую мембрану или в околоядерную/ядерную область, а локализация на мембране во всех изученных случаях нуждалась в домене DEP [24,25]. Значение околоядерной/ядерной локализации остается невыясненным, но заслуживает внимания то, что ряд компонентов канонического сигнального пути, такие как APC, Axin, и GSK3β, по-видимому, переносится между цитоплазмой и ядром вместе с β-catenin [26-28].

Sokol и др. в Journal of Biology [10] идентифицировали два дополнительных домена в Dsh , которые модулируют как его субклеточное распределение, так и его способность активировать каноническую передачу сигналов Wnt. Первый из вновь идентифицированных доменов, располагается С-терминальнее от DEP домена, модулирует локализацию Dsh благодаря своему действию в качестве nuclear export signal. Dsh белок, лишенный этого домена или имеющий мутацию в критическом лизиновом остатке, накапливается в ядре как эмбрионов Xenopus , так и в культивируемых клетках млекопитающих. Неожиданно, однако, этот мутантный белок сохраняет свою способность обеспечивать каноническую передачу сигналов столь же эффективно, как и Dsh дикого типа. Фармакологические агенты, препятствующие экспорту из ядра, и исследования по клеточному фракционированию, предоставили дальнейшие доказательства, что эндогенный Dsh вступает в ядро, подтверждая тем самым мнение, что Dsh снуёт между цитоплазматическим и ядерным компартментами. Авт. затем идентифицировали второй домен, расположенный непосредственно С-терминальнее PDZ домена, который необходим для ядерной локализации; последовательности этого домена являются атипичными для nuclear localization sequence (NLS). Мутации в этом втором домене устраняют ядерное накопление Dsh в присутствии ингибиторов экспорта из ядра и что интересно, нарушают способность Dsh индуцировать стабилизацию β-catenin и передавать канонические Wnt сигналы. Интересно, что замещение этого атипичного NLS прототипическим NLS из T антиогена от simian virus SV40 перенаправляет Dsh в ядро и в основном восстанавливает передачу сигналов Wnt. Авт. далее подкрепили свои находки, продемонстрировав, что стимуляция культивируемых клеток млекопитающих с помощью Wnt3a приводит в результате к накоплению части эндогенного Dsh (Dvl2 и их случае) в ядро или в его окружение.

Making sense of nuclear localization

Итак, какова же роль Dsh в ядре и как эту роль м. соответствовать передаче сигналов Wnt? Эти новые находки [10] стали сюрпризом. Чтобы подтвердить свои заключения авт. показали, что Dsh обнаруживается в ядерных фракциях, но что этот подход не полностью доказателен, т.к. м. предположить, что Dsh имеет околоядерную локализацию и ко-фракционируется с наружной ядерной оболочкой. Самые строгие доказательства ядерной роли Dsh получены в экспериментах, в которых манипулировали с ядерным импортом и экспортом, показавшими, что импорт является критическим для функции. Теперь, когда основной вывод о ядерной локализации и функции Dsh воспринят, некоторые вопросы всё-таки остались. Если Dsh функция необходима в ядре для канонической передачи сигналов Wnt, то почему не наблюдается гиперактивации пути с помощью таргетинга Dsh в ядро? Авт. отмечают этот пункт и предполагают, что необходимо 'steady state' скорее, чем непосредственная локализация для функционирования. Однако, необходимо, по крайней мере, подчиниться утверждению, что β-catenin, который д.б. стабилизирован с помощью такого Dsh-targeted подхода, д. усиливать передачу сигналов, но этого не наблюдается.

Вообще-то наиболее бросающийся в глаз вопрос, почему многие исследования наблюдали транслокацию Dsh в плазматическую мембрану в ответ на Wnt стимуляцию или экспрессию Frizzled [8,12,17,29], но не обнаруживали Dsh в ядре. Возможно, что небольшой, но избирательный пул Dsh транслоцируется в ядро, чтобы обеспечить каноническую передачу сигналов, тогда как большинство Dsh поступает в мембрану. Если это так, является ли ре-локализация в мембрану большинства Dsh столь беспричинным клеточным поведением без последствий? Наконец, какова функция Dsh в ядре? Возможно, что ядерные Dsh участвуют в регуляции транскрипции независимо от β-catenin, чтобы обеспечить передачу сигналов Wnt, как Sokol и др. ранее предполагали это для Dsh-связывающего белка Frodo [30].