APC | ARE | AVE | Dkk | Fz | Gsk3β | HDAC | HSC | Lef | Lrp | mesd | Tcf

Хотя и был открыт в качестве онкогена 22 года тому назад [1], но наше понимание Wnts и сигнальных событий с ними связанных получены в основном на основании генетических и онтогенетических исследований у таких модельных организмов как Drosophila и Xenopus. Идентифицированы многие ключевые компоненты и вычленен канонический путь: связывание Wnt со своим рецептором Frizzled (Fz) и ко-рецептором Arrow/Lrp5/6 (lipoprotein receptor related protein) увеличивает цитоплазматический уровень и накопление в ядре β-catenin. β-Catenin м. затем связывать транскрипционные факторы, такие как Tcf/Lef (T-cell transcription factor/lymphocyte enhancer factor), чтобы активровать экспрессию генов мишеней [2-4]; см http:// www.stanford.edu/~rnusse/pathways/celldouble.html схематическую диаграмму).

Открыто несколько точек дивергенции от пути Wnt. Напр., Wnt5 м. служить в качестве сигнала наведния аксонов путем соединения с тирозин киназным рецептором у мух [5], так что лиганд полностью не связанный с Wnt м. активировать β-catenin обусловленную транскрипцию путем специфического связывания Fz4 рецептора у млекопитающих [6]. Тем не менее, ключевые цитоплазматические события канонического Wnt пути, т.e. Gsk3β; (glycogen synthase kinase 3β) обусловленная деградация β-catenin, селективная стабилизация β-catenin, ядерная локализация и последующая трансактивация, скорее всего происходят очень рано и приспособлены для регуляции процесса гаструляции, фундаментального онтогенетического события, которое создает зародышевые листки [7]. О неканонических Wnt путях с передачей сигналов Rho/Rac иd Ca2+ подробно говорится в обзоре Veeman et al. [8].

The canonical Wnt pathway

Центральным игроком в передаче сигналов Wnt является β-catenin. Однако, β-catenin не является исключительным только для Wnt пути, а выполняет и др. важную функцию в цитоплазме: формирование cadherins соединений [9]. В более специализированных клетках, таких как нейроны или клетках, проходящих митоз, β-catenin выполняет дополнительные критические функции [10-12]. Т.о., предпосылкой передачи сигналов Wnt является то, что в клетках, не подвергающихся воздействию Wnt, уровень и локализация β-catenin регулируются тонко для предупреждения активации транскрипции, тогда как в то же самое время обеспечивается поддержка др. клеточных функций. Не удивительно, что множественные механизмы используются для достижения этой цели.

Наиболее охарактеризован и понятен наиболее консервативный [7] Gsk3β-обусловленного фосфорилирования β-catenin и его последующая деградация с помощью протеосом, чтобы поддерживать уровнеь свободного β-catenin на низком уровне. Axin and APC (adenomatous poliposis coli) также необходимы для этого процесса, чтобы сформировать 'комплекс деструкции' с Gsk3β (reviewed in [2-4,13]). Однако, у эмбрионов Drosophila если уровень эндогенного β-catenin понизить с помощью двух гипоморфных аллелей, то потеря Gsk3β больше не вызывает повсеместной активации β-catenin и клетки восстанавливают свою способность отвечать на Wnt, указывая тем самым на то, что существует Gsk3β-независимая супрессия активности β-catenin. В такой ситуации, оставшаяся супрессия β-catenin приписывается Axin [14]. Механизм Axin обусловленной Gsk3β-независимой супрессии активности β-catenin неизвестен, хотя предполагается закрепляющая в цитоплазме активность Axin совместно с APC [13]. Однако, тот факт, что избыточно экспрессирующийся Axin сохраняет некоторую активность по супрессии передачи сигналов Wnt APC нулевых эмбрионов мух не совсем согласуется с этой гипотезой [15]. Cong and Varmus показали на культуре ткани, что экзогенный Axin снуёт между ядром и цитоплазмой и м. способствовать изменению локализации β-catenin из ядра в цитоплазму, указывая на ещё неизвестный механизм, с помощью которого Axin м. супрессировать активацию транскрипции [16].

Поиск партнеров, связывающих β-catenin, выявил третьий механизм, используемый клетками для супрессии активации генов-мишеней с помощью β-catenin в отсутствие стимуляции Wnt. Ядерный белок, Chibby, м. конкурировать с транскрипционными ко-факторами Tcf/Lef по связыванию β-catenin, чтобы репрессировать транскрипционную активацию. Анализ потери функции у эмбрионов мух подтвердил, что этот антагонист обязателен, даже если все др. механизмы ингибирования β-catenin всё ещё функционируют [17]. Т.о., множественные механизмы необходимы для супрессии активности β-catenin в отсутствие стимуляции Wnt. Активация передачи сигналов Wnt характеризуется накоплением β-catenin в ядре. Неясно, существует ли механизм, который способствует транспорту в ядро β-catenin после Wnt стимуляции. Однако, если Axin в самом деле активно сдвигает локализацию β-catenin в цитоплазму [16], то блокирование активности Axin м.б. достаточно для обратного накопления β-catenin в ядре. Более того, т.к. Axin необходим для функционирования комплекса деструкции, то манипуляции со стабильностью, локализацией или активностью Axin будут приводить к накоплению β-catenin в цитоплазме. В подтверждение этому было показано, что повторяющийся PPPSP мотив в цитоплазматическом хвосте ко-репрессора Arrow/Lrp м. фосфорилироваться после Wnt стимуляции, чтобы сформировать индуцибельный docking сайт для Axin [18]. Рекрутирование Axin в мембрану с помощью Arrow/Lrp м. инактивировать комплекс деструкции или путем деградации [13,14] или секвестрации Axin в клеточной мембране [15]. Используя экстракты из яиц лягушек, Lee et al. нашли, что концентрация Axin на несколько порядков величин ниже по сравнению с др. компонентами пути Wnt, включая APC и Gsk3β, которые также являются компонентами нескольких др. важных путей. Их математическая модель подтверждает, что с помощью манипуляций с Axin, передача сигналов Wnt м. оперировать с минимальными изменениями в уровнях APC и Gsk3β, вызывая тем самым меньше пертурбаций в др. путях [19].

Др. ключевой игрок в активации Wnt это белок Dishevelled (Dsh or Dvl), необходимый как для канонического, так и не-канонического Wnt пути [8,20]. Dsh/Dvl , как полагают, 'активируется' после Wnt стимуляции. Несмотря на тот факт, что выявлены многие партнеры по связыванию [20] и наблюдается повышенное фосфорилирование после Wnt стимуляции, механизм активации Dsh/Dvl всё ещё неясен. Исходя из их наблюдения, что Axin-GFP трансген обнаруживает Dsh/Dvl зависимую локализацию в мембране, Cliffe et al. предложили модель, согласно которой Dsh/Dvl постоянно переносит Axin-содержащий комплекс деструкции в плазматическую мембрану, где он м. удерживаться с помощью Arrow/Lrp после Wnt стимуляции [15]. Более того, из-за того, что PDZ домен у Dsh/Dvl м. соединяться с цитоплазматической порцией рецептора Fz непосредственно [21], он м. также доставлять Axin в клеточную мембрану независимо от LRP5/6/Arrow [3].

В конечном итоге β-catenin накапливается в ядре, где он соединяется с промоторами своих ниже стоящих генов мишеней путем взаимодействия с транскрипционными факторами семейства Tcf/Lef. β-catenin м. смещать транскрипционные ко-репрессоры, такие как Groucho и histone deacetylase (HDAC), рекрутируя при этом histone acetyltransferase CBP/p300 и хроматин-ремоделирующий энзим Brg-1, чтобы обеспечить транскрипционную активацию [4,22,23]. недавно было показано, что два ядерных белка, Legless и Pygopus, необходимы для активации транскрипции β-catenin [2,4]. В отличие от CBP/p300 и Brahma, которые соединяются с C-терминальной областью β-catenin, Legless соединяется с N-терминальными Armadillo повторами в β-catenin. Он затем рекрутирует Pygopus, который м. служить как трансактиватор. Будучи прикреплен непосредственно к Tcf, Pygopus активировать Wnt гены мишени в отсутствие β-catenin [24].

Хотя роль β-catenin в Wnt пути безусловно ядерная [25-27], Briata et al. выявили второй слой регуляции экспрессии Wnt генов мишеней, который, по-видимому, осуществляется в цитоплазме. Используя линию гипофизарных клеток, они показали, что воздействие Li или избыточная экспрессия активированного β-catenin м. специфически стабилизировать мРНК ряда известных транскрипционных мишеней Wnt, включая Pitx2, c-Jun, CyclinD1 и D2. Этот эффект обеспечивается путем усиления переноса ядро->цитоплазма HuR, мРНК стабилизирующего adenylate/uridylaterich element (ARE) связывающего белка и одновременно переносом цитоплазма->ядро KSRP и TTP, мРНК дестабилизирующих ARE-связывающих белков. Более того белок Pitx2 сам по себе играет критическую роль в этом процессе. т.к. избыточная экспрессия дикого типа Pitx2 достаточна для стабилизации мРНК до уровня, сходного с таковым при воздействии Li, тогда как избыточная экспрессия мутантной формы Pitx2 м. доминантно дестабилизировать мРНК даже при воздействии Li [28]. Это демонстрирует существование нового механизма, при котором транскрипционные мишени Wnt/β-catenin м.б. активированы умноженным и скоординированным образом.

Wnt signaling in mammalian development: axis formation and early patterning

хотя исследования на модельных организмах, таких как Drosophila и Xenopus выявили существенную роль передачи сигналов Wnt в эмбриогенезе, не всегда возможно непосредственно экстраполировать функционирование передачи сигналов Wnt в контроле развития и дифференцировки у млекопитающих.

Имеется, по крайней мере, 19 Wnt лигандов, 10 Fz рецепторов и два ко-репрессора (Lrp5 и 6) у мышей (http:// www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html), это указывает на значительное генетическое перекрывание затрудняет функциональную характеристику передачи сигналов Wnt. Это скорее всего происходит во время раннего эмбриогенеза (т.e. gastrulation), когда некоторые Wnts обнаруживают перекрывающиеся паттерны экспрессии [29]. В этой связи, удивительно, что мутации одиночных Wnt, Wnt3, нарушают гаструляцию путем блокирования первичной полоски и , следовательно, формирование мезодермы и дефинитивной энтодермы [30] (Рис. 1). Lrp5/6 двойные мутанты, также как и классический мутант mesd (mesoderm development) мышей, который делетирует ген, кодирующий Mesd, специфический хаперон для Lrp5 и 6, обладают очень сходными дефектами паттерна, как и Wnt3 мутанты [31,32]. Напротив, потеря функции β-catenin дает в результате дополнительные дефекты помимо неспособности образования первичной полоски [33,34,35]. В отличие от Wnt3, Lrp5/6 и mesd мутанты, у которых передняя спецификация нейроэктодермы с помощью AVE (anterior visceral endoderm) , по-видимому, происходит в отсутствие первичной полоски, β-catenin мутанты не способны ориентировать дистальную висцеральную энтодерму в переднюю сторону (Рис. 1). Анализ микромассивов и in situ показал, что экспрессия Cripto, гена, кодирующего ко-рецептор для передачи сигналов Nodal, являющаяся существенной для передней транслокации дистальной висцеральной энтодермы, отсутствует в эпибласте β-catenin мутантов [35]. Дальнейшие эксперименты с β-catenin мутациями с избыточностью функции и подходы с репортерными генами указывают на то, что Cripto м.б. непосредственной мишенью комплекса Lef/Tcf/β-catenin [35]. Из-за важной роли Arrow/Lrp5/6 в передаче Wnt сигналов, как указывалось выше, фенотипические различия между β-catenin и Lrp5/6 или mesd мутантами указывают на Wnt-независимую транскрипционную активацию с помощью β-catenin в формировании переднего организатора у эмбрионов мышей [35]. необходимо отметить, что , по крайней мере, на ранних стадиях эмбриогенеза, когда проводился анализ, удаление β-catenin, по-видимому, не меняет межклеточной адгезии, преимущественно из-за компенсаторной замены plakoglobin [33,34].

Довольно интригующе, но согласующаяся с экспериментами на лягушках и рыбках данио, последующая индукция переднего мозга нуждается в ингибировании передачи сигналов Wnt [29,36-39]. Как AVE , так и аксиальная мезодерма, происходящие из передней части первичной полоски, экспрессируют Dickkopf1 (Dkk1), секретируемый антагонист Wnt, который соединяется с Lrp5/6. Анализ химер, однако, показал, что экспрессия Dkk1 в AVE не существенна, а Dkk1, секретируемый в AME, достаточен для формирования передней части головы [39]. Исследования на курах и Xenopus подтвердили, что ингибирование передачи сигналов Wnt является также критическим и для формирования сердца [29,38]). В согласии с этими исследованиями, эксперименты с химерами и условными делециями у мышей показали, что β-catenin, а , следовательно, и предача сигналов Wnt не требуют клеточно автономного проявления в клетках эпибласта, чтобы внести вклад в кардиальную мезодерму [33,34]. Однако, у эмбрионов мышей, несущих гипоморфные мутации Apc, передний мозг укорочен, но кардиальная мезодерма м.б. специфицирована, судя по экспрессии маркерного гена, хотя в аномальной дорсальной локализации [36]. У химерных эмбрионов дикого типа вне-эмбриональные ткани м. восстанавливать неправильно локализованную кардиальную мезодерму у Apc гипоморфных мутантов, чтобы сформировать нормальные сердца, но не укорочение переднего мозга [36]. Т.о., ингибирование Wnt inhibition при формировании сердца у млекопитающих нуждается в более осторожном обращении в будущем.

В противоположность нейроэктодерме и мезодерме, β-catenin необходим для спецификации энтодермы. В отсутствие β-catenin энтодермальные клетки меняют свою судьбу и формируют кардиальную мезодерму [34]. Как β-catenin осуществляет выбор судьбы между энтодермой и мезодермой, неясно.

Wnt signaling in progenitor and stem cells in vivo

Исследования формирования паттерна головного мозга у кур привели к модели, согласно которой повышенные уровни Wnt вдоль передне-задней оси наделяют нейральные клетки с первоначально ростральными характеристиками градиентно более каудальными характеристиками [40]. В соответствии с этой моделью продолжающееся ингибирование передачи сигналов Wnt у мышей необходимо для спецификации переднего мозга после инициальной индукции головы. Транскрипционный фактор Six3 действует на этой ступени, по крайней мере, частично посредством ингибирования транскрипции Wnt1, чтобы поддерживать качественные особенности клеток, предназначенных судьбой формировать передний мозг [41]. Роль Wnt в формировании каудальных частей головного мозга мышей не изучена. Эксперименты по генному таргетингу выявили только, что Wnt1 и Wnt3a участвуют в клеточной пролиферации в диэнцефалоне, среднем и заднем мозге [42]. Во время последующего развития передача сигналов Wnt/β-catenin необходима для всей ЦНС для увеличения популяции клеток предшественников с помощью одновременного стимулирования клеточной пролиферации и блокирования апоптоза и дифференцировки [43].

A schematic diagram of early mouse embryogenesis. Phenotypic characterization of several mouse mutants suggest that whereas Wnt3 activates bcatenin through co-receptors Lrp5 and 6 to promote primitive streak formation in the posterior part of embryo, b-catenin may function in a ligandindependent fashion to orient distal visceral endoderm anteriorly to form AVE. (See main text for detail.)

Как в точности β-catenin способствует клеточной пролиферации в нервной системе остается неизвестным. В гипофизарных нейронах и клетках кардиального нервного гребня β-catenin м. увеличивать транскрипцию Pitx2 путем соединения с и смещением HDAC1 от Lef1, связанного с Pitx2промотором. Затем β-catenin превращает Pitx2 из репрессора в активатор путем замещения HDAC1 и тем самым активирует Cyclin D2 для помощи пролиферации [22]. Важно отметить, что этот механизм является специфическим для типов клеток. В раннем нативном нервном гребне β-catenin не оказывает влияния на клеточную пролиферацию, а скорее индуцирует специфически судьбу сенсорных нервных клеток [44].

Исследования линий клеток colorectal рака и трансгенных мышей, которые эктопически экспрессируют Dkk1, также продемонстрировало существенную роль передачи сигналов Wnt в поддержании стволовых клеток кишечника, содействуя пролиферации и блокируя дифференцировку [45-47]. Это достигается, по крайней мере, частино посредством активации Tcf-4 гена-мишени c-Myc, который в свою очередь репрессирует транскрипцию p21CIP/WAF1 [45,46]. В культивируемых C2C12 мышечных клетках, β-catenin м. активировать транскрипцию c-Myc путем связывания Pitx2 aи E2F/p130 pocket белкового ингибирующего комплекса, чтобы отделить HDAC1 от промотора [23]. Способность β-catenin активировать Pitx2 обеспечиваемую транскрипцию G1 рост контролирующих генов cyclin D1 и D2 в клетках рака толстой кишки, м. указывать на дополнительный механизм для передачи сигналов Wnt для обеспечения пролиферации стволовых клеток [23].

Интересный поворот происходит во время формирования волосяных фолликулов, где функция β-catenin атипична в зачатках волосяных фолликулов, происходящих из разрастаний стволовых клеток эпителия кожи. В противоположность своей конвенционной роли в конвертировании Lef/Tcf из транскрипционных репрессоров в активаторы, β-catenin репрессирует транскрипцию E-cadherin, благодаря связыванию Lef1 [48]. Пониженные уровни E-cadherin и ослабление межклеточной адгезии скорее всего являются критическими для морфогенеза фолликулов [48].

Wnt signaling in stem cells in vitro

Роль передачи сигналов Wnt в поддержании и дифференцировке мультипотентных стволовых клеток выявлена на очищенных из костного мозга haematopoietic stem cells (HSCs) [49,50]. Усиление передачи сигналов Wnt посредством или ретровирусной инфекции стабилизированного β-catenin или воздействия очищенного белка Wnt3a, блокирует дифференцировку и способствует само-обновлению, а также способности восстанавливать клетки крови, когда трансплантируются летально облученным мышам. Существенная роль передачи сигналов Wnt в поддержании судьбы само-обновляющихся HSCs в дальнейшем подтверждена наблюдениями, что блокирование предачи сигналов Wnt с помощью избыточной экспрессии или Axin или секретируемой формы Fz cysteine-богатого домена, которая конкурирует с эндогенным Fz рецептором для связывания Wnt, ингибирует пролиферацию in vitro и способность HSCs восстанавливать клетки крови in vivo. Напротив, производные мышц CD45⁺ стволовые клетки - которые обладают потенциалом дифференцироваться в HSC или миогенные предшественники - в смешанной Wnt5a, 5b, 7a и 7b кондиционной среде м. специфически способствовать миогенной дифференцировке этих клеток [51]. Возможно, что передача сигналов Wnt м. действовать на разные транскрипционные мишени в разных контекстах. В мышечных стволовых клетках, промотор Pax7 содержит несколько Tcf/Lef сайтов связывания и предполагается, что является непосредственной мишенью для передачи сигналов Wnt для последующей детерминации в миогенный клон [51]. Напротив, гены, участвующие в само-обновлении HSC, такие как HoxB4 м Notch1, как было показано усиливают свою активность после активации передачи сигналов Wnt в HSCs [50]. Являются ли эти гены прямыми мишенями для Wnt сигналов, неизвестно.

Conclusions

Over the past two decades, there have been major advances in our understanding of Wnt signaling during mammalian embryogenesis, owing to the use of multiple model organisms. In vitro studies in cell culture have shed light on the transcriptional targets through which Wnt signaling controls differentiation and stem-cell maintenance. A central question one may then ask is: how does the Wnt pathway regulate specific transcriptional targets in different cells at different times to achieve distinct outcomes? A better understanding of the integration between Wnt and other signaling pathways and the impact of epigenetic modifications on the transcription of Wnt target genes may help answer this question in the future.

The canonical Wnt pathway in early mammalian embryogenesis and stem cell maintenance/differentiation Jianbo Wang and Anthony Wynshaw-Boris Current Opinion in Genetics & Development 2004, 14:533–539

The canonical Wnt pathway in early mammalian embryogenesis and stem cell maintenance/differentiation
Jianbo Wang and Anthony Wynshaw-Boris
Current Opinion in Genetics & Development 2004, 14:533–539