Почти половина генов человека подвергается альтернативному сплайсингу (Lander et al., ). Подсчёты, базируются в основном на сравнении геномной ДНК с EST (expressed sequence tag) последовательностями (Mironov et al., ; Brett et al., ) и это вносит некоторую неопределенность, т.к. ESTs не обязательно соответствуют функциональным мРНК (см Using ESTs for genome annotation - predicting the transcriptome). Даже если устранить экспериментальные артефакты, такие как транскрипты с незавершенным сплайсингом, то всё равно остается проблема ошибок в самой кухне (machinery) сплайсинга, т. наз. аберрантный сплайсинг (см Tut: manufacturing EST libraries).
В самом деле, нормализация концентраций мРНК во время конструкции библиотек клонов ведет к секвенированию ESTs, возникающих из редких изоформ мРНК. Далее, компьютерный анализ продемонстрировал существование многочисленных cancer-специфических ESTs (точнее, ESTs, соответствующих cancer-специфическим альтернативным сплайс-изоформам, см Using ORESTES ESTs to mine gene cancer expression) (Wang et al., ; Sorek et al., ; Xie et al., ; Xu and Lee, ), появление которых м.б. обусловлено общим нарушением контролирующих механизмов в раковых клеточных линиях. Хотя однажды и было объявлено, что почти все гены человека обнаруживают некоторые признаки альтернативного сплайсинга, но если следовать строгим критериям (напр., по крайней мере, два ESTs д. подтверждать событие альтернативного сплайсинга) то фракция генов. подвергающихся альтернативному сплайсингу, снижается до 17-28% (Kan et al., ).
Новый поворот в этой дискуссии был добавлен, когда некоторые группы попытались сравнить альтернативный сплайсинг генов людей и мышей (Thanaraj et al., ; Modrek and Lee, ; Modrek et al., ; Nurtdinov et al., ). Неожиданно оказалось, что значительная фракция генов человека имеет альтернативные сплайс-изоформы, которые не законсервированы у мышей.
Два разных подхода были использованы для сравнения альтернативного сплайсинга у людей и мышей. Один из них связан с непосредственным сравнением ESTs человека и мыши. Этот подход продемонстрировал, что , по крайней мере, 15% splice junctions (интронов) у людей законсервированы и у мышей (Thanaraj et al., ). Сходные подсчеты были сделаны для разных типов элементарных альтернатив, рассмотренных отдельно, при этом было установлено, что события пропуска экзонов более законсервированы, чем сайты альтернативного сплайсинга (Sugnet et al., ). Однако, т.к. мышиные EST данные далеки от насыщения, то очевидна более низкая величина фракции законсервированного альтернативного сплайсинга.
Др. подход, базирующийся на сравнении белковых изоформ людей с мышиной геномной ДНК с использованием алгоритмов spliced alignment (Mironov et al., ; см Spliced alignment) или просто BLAST (Altschul et al., ; см IMPALA/RPS-BLAST/PSI-BLAST in protein sequence analysis). При этом считалось изоформа законсервированной, если альтернативная область соответствовала мышиному геному без сдвига рамки считывания и связана со стандартными GT-AG динуклеотидами. Очевидно, что такое определение дает завышенные подсчеты количества законсервированных изоформ, т.к. эти условия обязательны, но не достаточны: изоформа м. не существовать из-за изменений в позициях сплайс-сайтов, иных чем GT-AG, или из-за изменений в регуляторных сайтах, таких как splicing-энхансеры. Далее, это определение не учитывает события не законсервированных пропусков экзонов.
Этот подход (Nurtdinov et al., ) продемонстрировал, что, по крайней мере, половина (55%) из 166 альтернативно сплайсируемых генов человека имеют изоформы, не законсервированные в их ортологах у мышей. Это обусловливает почти 25% не законсервированных элементарных альтернатив. Сходные результаты были получены для элементарных альтернатив, подтвержденных с помощью мРНК (24% не законсервированных) и с помощью только ESTs (31%).
Значительно большая выборка в сходном подходе была проанализирована Modrek and Lee, (), где рассматривались только кассеты экзонов. Все такие экзоны были подразделены на экзоны, включенные в крупные изоформы (т.e., присутствовали в большинстве ESTs, перекрывающих соотв. область), и минорные формы экзонов. Первые были найдены законсервированными в 98% случаев, тогда как только около четверти (27%) из последних оказались законсервированными. Сходные результаты получены при менее масштабном сравнении человек-крыса. Средняя консервация экзонов обоих типов, 75%, довольно близка к степени консервации элементарных альтернатив, описанной Nurtdinov et al., ().
Возникает вопрос, являются ли эти не законсервированные альтернативы реальными или возникают в результате ошибок сплайсинга. Количество задокументированный функциональных не законсервированных альтернативных сплайс-изоформ не велико (Nurtdinov et al., ). Фактически предполагается, что большинство не законсервированных изоформ являются не функциональными (Sorek et al., ). Фракция не законсервированных кассет (пропущенных) экзонов, идентифицированная с помощью комбинационного EST анализа и геномных сравнений, была сходной с таковой в двух упомянутых выше исследованиях (75%). Однако, было продемонстрировано, что большинство не законсервированных экзонов (79%) или ведут к сдвигу рамки (т.к. их длина не содержит целых чисел количества триплетов) или содержит in-frame стоп-кодон. Напротив, только 27% законсервированных кассет экзонов, с разорванной рамкой считывания. Различия уменьшаются, если рассматриваются экзоны, подтверждаемые с помощью множественных ESTs, (46% прерванных экзонов среди экзонов, подтвержденных, по крайней мере 5 ESTs).
Разрыв рамки per se не делает изоформу не функциональной. В самом деле, примерно 40% человеческих (Modrek et al., ) и мышиных (Zavolan et al., ) альтернативных изоформ, идентифицированных с помощью EST и с помощью анализа кДНК полной длины имеют прерванную рамку считывания и несколько меньшие величины (22%) получены при анализе опубликованных экспериментальных данных (Thanaraj and Stamm, ). Промежуточные количества альтернативных изоформ (35%) сообщались Lewis et al., ();более того, было продемонстрировано, что большинство таких изоформ было предметом nonsense-mediated распада мРНК, т.к. стоп-кодон появлялся более чем на 50 нуклеотидов выше 5'-most exon-exon соединения. Т.к. эта тенденция сохраняется после отфильтровывания менее-reliable изоформ, то вероятно, что изоформы с разрывом рамки являются функциональными; допускается возможность, что они участвуют в регуляции сплайсинга, трансляции и деградации мРНК.
Существуют разные линии доказательств функциональности не законсервированных изоформ (Modrek and Lee, ). Во многих случаях минорные формы не законсервированных экзонов не только подтверждены с помощью множественных ESTs, но и также продемонстрированы доказательства ткане-специфической экспрессии и законности большинства из них в этой ткани.
Т.о., открытым остается вопрос не реальности не законсервированных изоформ, а их функциональности. Крупно-масштабные протеомные исследования необходимы для определения, транслируются ли эти изоформы и дают ли белковые продукты.
Dj всяком случае, альтернативный сплайсин, как было продемонстрировано, оказывает существенный эффект на структуру белков (Kriventseva et al., ). В самом деле, если сравнивать со случайной моделью, то альтернативный сплайсинг, как было показано, предпочитает перемещать полные белковые домены вместо разорванных доменов или попадающих в междоменовые области и функциональные сайты-мишени, если это происходит внутри домена. В самом деле, альтернативный сплайсинг часто использует домены, участвующие в межбелковых взаимодействиях (Resch et al., ). Далее, было установлено, что альтернативный сплайсинг имеет тенденцию удалять области генов, кодирующие сигнальные пептиды и одиночные трансмембранные сегменты, продуцируя секретируемые, связанные с мембранами и цитозолем белки (Xing et al., ; Cline et al., ).
Т.о., альтернативный сплайсинг является основным механизмом создания разнообразия белков как у существующих организмов, так и в эволюции. organisms and in evolution. Последнее объяснение подтверждается дополнительными наблюдениями: доказательства позитивного отбора базируются на анализе синонимных и не синонимных нуклеотидных замен (Iida and Akashi, ) и на том факте, что все Alu-производные белок-кодирующие области генов человека подвергаются альтернативному сплайсингу (Sorek et al., ). В самом деле, теория Modrek and Lee () утверждает, что альтернативный сплайсинг предоставляет организму возможность эксперимента наделения белков новыми функциями, не нарушая при этом старого белка. Если новый вариант предоставляет преимущества, то его фракция м. увеличиваться благодаря незначительным изменениям в регуляторных сайтах.
Однако, это не объясняет, почему генерация изменчивости белков не м.б. получена за счет удвоений генов. explain why generation of protein variability cannot be obtained by gene duplication. Др. менее оцененная роль альтернативного сплайсинга заключается в поддержании protein identity. В самом деле, во многих случаях клетки нуждаются в белках, которые отличаются некоторыми доменами и в точности идентичны в остальном. Наиболее впечатляющий пример этого предоставляется секретирующими мембранами и внутриклеточными изоформами различных рецепторов. Распознавания- или лиганд-связывающий домен д.б. тем же самым, поскольку мембранный якорь и сигнальный пептид кодируются альтернативными экзонами. Очевидно, что такое устройство не м.б. получено с помощью удвоения гена, т.к. для этого необходим дорогостоящий механизм для поддержания качественных особенностей этих ДНК фрагментов, которые д. кодировать идентичные домены.
Следующей ступенью исследований, по-видимому, будет слияние различных подходов с целью описания всех аспектов феномена альтернативного сплайсинга: эволюция структуры экзон-интрон и последовательностей в альтернативно сплайсируемых областях, регуляции, последствий для структуры и функции белков и т.д.. Ясно, что такой анализ не д.б. ограничен изучением млекопитающих (human-mouse-rat). Др. группы уже имеют доступные геномы, среди них два вида нематод (Caenorhabditis elegans и Caenorhabditis briggsae, см ) и плодовые мушки (Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura и др.) с малярийным комаром Anopheles gambiae; заканчивается секвенирование эукариотических геномов кур, рыб (Takifugu rubrupes, Danio rerio, cv The Fugu and zebrafish genomes), пчел и растений.
