Разнообразные механизмы, лежащие в основе генетических болезней, постоянно увеличиваются по мере увеличения нашего знания о геноме человека. Обычно мутации в кодирующих областях идентифицируются в качестве причины болезни, включая мутации, вызывающие кистозный фиброз и б-нь Геттингтона. Описаны генетические нарушения, которые возникают в результате мутаций в сплайс-сайтах мРНК, последовательностях полиаденилирования и вышестоящих и нижестоящих регуляторных элементах. Tufarelli и др. описали новую причину генетических болезней человека, которые возникают благодаря механизму антисмысловой транскрипции, ведущему к метилированию и молчанию гена в семье с α-thalassemia (Рис. ).

α-thalassemia обусловливается мутациями в кластере α-глобиновых генов. Кластер генов α-globin находится в теломерной области хромосомы 16 и состоит из двух идентичных α-globin генов (HBA1 и HBA2), двух эмбриональных globin генов (HBQ1 и HBZ) и ряда псевдогенов под контролем 5' HS-40 энхансерной области. Благодаря присутствию HBA1 и HBA2 на каждой из хромосом индивиды, несут 4 копии α-globin гена. Потеря одного или двух глобиновых генов ведёт к α-thalassemia, потеря трёх даёт тяжёлую форму α-thalassemia, называемую Haemoglobin H болезнью, а потря всех 4 α-globin генов вызывает фатальное для детей заболевание, называемое hydrops fetalis.

Barbour и др. описали в польской семье α-thalassemia (2). Анализ кластера α-globin генов выявил делецию, названную α-^ZF, в затронутой хромосоме, возникшей в результате потери HBA1 и HBQ1. Ген HBA2 globin и вышестоящий регулятор HS-40 структурно не изменены. Такая делеция д. вызывать потерю только одного α-globin гена, однако, гематологический фенотип оказался более тяжелым, чем ожидалось у пациента Z.F., это указывало на то. что ген HBA2 на затронутой хромосоме также бездействует. Дальнейший анализ показал, что CpG островок в промоторе HBA2 метилирован на этой затронутой хромосоме, вызывая молчание α-globin с этого локуса. CpG островки являются частыми в этой области хромосомы 16 и ассоциируют с неметилированной формой, во всех промоторах этой области. Др. CpG островки в области не затрагиваются α-^ZF делецией.

Tufarelli и др. исследовали механизм селективного метилирования и молчания гена HBA2. Делеция α-^ZF обусловливает непосредственное соединение укороченной копии LUC7L, повсеместно экспрессирующегося компонента комплекса U1Snrp, с 300-bp нижестоящим сайтом добавления polyA у HBA2. Ген LUC7L транскрибируется с антисмысловой нити по сравнению с геном HBA2. Более того, делеция α-^ZF удаляет финальные три экзона и сайт добавления polyA у LUC7L, тем самым открывается возможность продолжения транскрипции LUC7L на локус HBA2. RT-PCR анализ LUC7L антисмысловой транскрипции в эритроцитах от нормальных и затронутого индивида Z.F. показал, что не только укороченный LUC7L экспрессируется у пациента Z.F., но и транскрипция продолжается на HBA2 локус, по крайней мере, до CpG островка HBA2.

Были созданы трансгенные мыши с HBA2 и LUC7L ДНК. Одна из трансгенных конструкций воспроизводила генетический контекст делеции, сопоставляя LUC7L ДНК в антисмысловой ориентации с геном HBA2 (ZFαAS). Контрольная конструкция содержала ген LUC7L в смысловой ориентации (ZFαS). ZFαS взрослые мыши экспрессировали на ожидаемом уровне человеческий α-globin с неметилируемого локуса. Напротив, экспрессия α-globin отсутствовала у ZFαAS взрослых мышей, а HBA2 CpG островок был метилирован, воссоздавая ситуацию у человека. Метилирование CpG присутствовало в плодных и взрослых тканях ZFαAS мышей, указывая на то. что метилирование происходит рано в развитии. ZFαAS мыши скрещивались с трансгенными мышами для всей области α-глобиновых генов. Возникающее потомство обнаруживало метилирование CpG только в ZFαAS трансгене, указывая тем самым, что antisense-обусловленное метилирование осуществляется с помощью cis-действующего механизма.

Создание embryonic stem (ES) клеток, трансфицированных или ZFαAS или ZFαS конструкцией, сделало возможной дальнейшую проверку времени метилирования локуса во время развития. ES клетки обнаруживали паттерн метилирования только. когда они подвергались дифференцировке. Недифференцированные стволовые клетки экспрессировали α-globin и с ZFαS и с ZFαAS. Как только клетки дифференцировались, то происходило метилирование de novo и ZFαAS клетки прекращали продукцию α-globin из-за метилирования HBA2 CpG островка. Используя дифференцированные ES клетки исследователи изучали, м. ли др. мутации вызывать потерю экспрессии α-globin в результате метилирования ДНК. Удаление HS-40 энхансера и мутация CCAAT и TATA box промоторных элементов нарушали экспрессию α-globin, не приводя к метилированию ДНК, это явилось подтверждением, теории, что транскрипция антисмысловой РНК является причиной метилирования HBA2 . Исследователи заместили LUC7L промотором ubiquitin, транскрибирующимся в антисмысловом направлении.Транскрипция продолжалась на HBA2 локус и вызывала в результате метилирование и молчание HBA2.

Tufarelli и др. продемонстрировали причинную роль антисмысловых транскриптов в метилировании и молчании локуса HBA2 в семье с α-thalassemia. Молчание благодаря антисмысловым транскриптам происходит также в процессе генетического импринтинга и инактивации Х-хромосомы. Однако, это первое сообщение метилирования через антисмысловую транскрипцию в неимпринтируемом аутосомном локусе, приводящее к болезненному состоянию.