Посещений:
Каспазы

Механизмы Активации

Mechanisms of caspase activation
Kelly M Boatright and Guy S Salvesen
Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:725–731




Рис.1.  | 


Рис.2. Apoptosome  | Cytochrome C released from the mitochondria binds to the cytosolic protein Apaf-1. This interaction results in a conformational change in Apaf-1 which, when stabilised by the binding of ATP, allows molecules of Apaf-1 to associate with each other. This results in the formation of a wheel-like structure that contains 7 molecules each of Apaf-1, cytochrome C and ATP. This wheel-like structure, known as the apoptosome, permits the recruitment of 7 molecules of procaspase-9 to the complex. The exact mechanism of caspase activation is still uncertain although two possibilities have been proposed. In one case the Apaf-1, cytochrome C and procaspase-9 complex can act as a stage to activate cytosolic procaspase-9 as it is recruited to the apoptosome. In the other scenario two apoptosome have been proposed to interact with each other and to activate the caspase-9 located on the other apoptosome.

Caspases составлют семейство cysteine proteases - peptidases, которые используют остатки цистеина в качестве каталитических nucleophile - которые обладают совершенной специфичностью расщепления белков мишеней по сайту соседнему с остатком aspartic кислоты. Сочетанное действие caspases ответственно за апоптоз, специфическую форму запрограммированной гибели клеток, которая существенна для эмбрионального развития и патологии при многих болезнях. Помимо апоптоза подгруппа семейства каспаз участвует в воспалении, где они действуют как активаторы pro-cytokine [1]. Апоптические каспазы классифицируют на инициаторов или исполнителей в зависимости от места их вступления в апоптический каскад. Инициаторные caspases являются первыми, активируемыми в определенном пути гибели (Рис. 1), и они представляют первую ступень в минимум двухступенчатом каскаде, активируя исполнительные каспазы. Нерегулируемая активность каспаз д.б. летальной для клетки, поэтому чтобы предупредить это клетки накапливают каспазы в виде латентных предшественников - zymogens. Эти 'procaspases' нуждаются в активирующих событиях. Считается, что активационные механизмы initiator и executioner caspases полностью отличны, но устройства для стабилизации латентных зимогенов законсервированы фундаментально.

Initiator caspases


Многочисленные структурные и биохимические доказательства демонстрируют, что активные каспазы являются облигатными димерами идентичных каталитических единиц, каждая из которых содержит один активный сайт. Сегодня все трёхмерные структуры каспаз в их активной форме показывают, что каждая каталитическая единица состоит из одной большой и одной малой субъединиц. Эти субъединицы происходят из одной и той же молекулы предшественницы за счёт внутреннего расщепления по сайту, который демаркирует субъединицы и известен как линкерная область. Принимая во внимание доказательства, что активная форма каспаз содержит большую и малую субъединицы, было предположено, что все каспазы активируются в результате протеолитического расщепления своей линкерной области(2).
Недавние исследования показали, что расщепление не является ни необходимым, ни достаточным для активации initiator каспаз. Зимогены инициаторных каспаз существуют внутри клеток в виде неактивных мономеров. Эти мономеры нуждаются в димеризации для приобретения активной конформации и их активация не зависит от расщепления (Рис. 2a) [3-5]. Событие димеризации осуществляется на мультибелковых активирующих комплексах, к которым зимогены каспаз поставляются с посредством своего N-терминального recruitment домена. Используемый активирующий комплекс зависит от источника стимулов к гибели, который м.б. или внешним, или внутренним.

Extrinsic pathway (caspase-8 and -10)


Внешний путь ответственен за элиминацию нежелательных клеток во время развития, за обучение иммунной системы и удаление иммунной системой обусловленных опухолей (immunosurveillance). Он инициируется с помощью связывания трансмембранных death рецепторов из сверхсемейства tumor necrosis factor receptor type 1; в частности



Schematic overview of the apoptotic pathways. Engagement of either the extrinsic or the intrinsic death pathways leads to the activation of the initiator caspases by dimerization at multiprotein complexes. In the extrinsic pathway, the DISC is the site of activation for caspase-8 and, at least in humans, caspase-10. The active sites are represented by orange stars. Stimulation of the intrinsic pathway leads to activation of caspase-9 at the apoptosome. Caspase-9 is shown as having one active site as seen in its crystal structure. However, the number of active sites in vivo is unknown. Following activation, the initiator caspases then cleave and activate the executioner caspases-3 and -7.

члена этого семейства, Fas (известного также как CD95 или APO-1), он становится paradigm для изучения внешеного пути (6). После ligation, Fas рецептор образует микроагрегаты на клеточной поверхности, позволяя адапторной молеуле FADD (Fas-associated protein with death domain) присоединиться к его цитозольному концу с помощью многоступенчатого механизма [7]. FADD рекрутирует зимогены caspase-8 посредством гомофильного взаимодействия с их N-терминальным death effector domains (DEDs). Они оказываются внутри death-inducing signaling complex (DISC), который активирует инициаторную caspase-8. Первоначально предполагалась модель индуцированной близости, согласно которой небольшие количества активности наследовались procaspase-8, делая возможным расщепление в trans caspase-8 димеры, рекрутируемые в определенное пространство DISC, генерируя тем самым каноническую активную двухцепочечную форму(8).
Новые данные вызывали сомнения относительно этого механизма [4,5]. Расщепление, по-видимому, не нужно для формирования активного сайта. Скорее это событие расщепления обеспечивает стабильность генерируемому димеру во время образования DISC, а фундаментальным событием активации является димеризация мономеров caspase-8. Модель индуцируемой близости всё ещё используется, но в адаптированной версии гипотезы, согласно которой рекрутирование мономеров, делает возможными образование димеров, а не рекрутирование пред-сформированных димеров, что важно. После димеризации каталитически активной формы N-терминальные DEDs удаляются протеолитически, позволяя тем самым активированной каспазa высвобождаться в цитозоль [9].
Этот механизм активации указывает на ранее недооценённое свойство procaspase-8: что в своём неактивном состоянии она является мономером. Это свойство теперь



Cartoon representation of the two molecular mechanisms of pro-caspase activation. (a) Activation of initiator caspases. The zymogens of initiator caspases exist as latent monomers. These monomers are activated by dimerization, which allows translocation of the activation loop (depicted as a red ‘sausage’) into the accepting pocket of the neighboring dimer. The active site is represented by an orange patch. (b) Activation of executioner caspases. The zymogens of executioner caspases exist as preformed dimers. Their zymogen latency is maintained by steric hindrances imposed by the interdomain linker (depicted as a yellow ‘banana’). Cleavage of this linker permits translocation of the activation loop, facilitating formation of the active site. Notice that the fundamental process of activation, translocation of the activation loop, is conserved for both the initiator and the executioner caspases.

исчерпывающе демонстрируется как на рекомбинантном материале [5] так и на естественных эндогенных зимогенах [4]. Это находится в резком контрасте по отношению к исполнительным caspases-3 и -7, которые уже димерны в своей латентной форме.
Ортолог caspase-8, caspase-10, также является инициатором гибели клеток посредством death-receptor, по крайней мере, у людей (мыши, по-видимому, лишены гена caspase-10). Существуют противоречия относительно способности caspase- 10 замещать функционально caspase-8 в передаче сигналов death-рецепторами. Первые работы с caspase-8 дефицитными клетками, происходящими из Jurkat T-клеточной линии, привели к заключению, что caspase-8 существенна для death-рецепторами обусловленного апоптоза [10]. Однако, последующие исследования установили, что эта клеточная линия имеет также пониженные уровни и caspase-10 и что преходящая трансфекция этих клеток caspase-10 достаточна для сенсибилизации их к death-рецепторами обусловленной клеточной гибели [11,12]. В др. работе было найдено, что восстановление этих Jurkat T клеток с помощью стабильной трансфекции death рецептором DR4 в комбинации с caspase-10 не сенсибилизирует death-рецепторами индуцируемый апоптоз [13]. Люди с мутантной caspase-10 имеют autoimmune lymphoproliferative синдром, обусловленный дефектным апоптозом лимфоцитов [14]. Люди с мутантной caspase-8 также обнаруживают дефекты апоптоза лимфоцитов, но имеют дополнительные выраженные дефекты в своей способности активировать лимфоциты, в результате чего развивается иммунодефицит [15]. Важно, что последнее исследование выявляет, что дефицит caspase-8 совместим с развитие у людей, хотя он вызывает эмбриональную гибель у мышей [16]. Всё это указывает на то, что хотя и имеется некоторое перекрывание, но caspase-8 и -10 выполняют самостоятельные функции.
Интересным дополнением к механзму активации caspase-8 является вовлечение FLIP (FLICE-like inhibitory protein - FLICE одно из оригинальных имен caspase-8). FLIP является гомологом caspase-8 с определенными важными отличиями, напр., отсутствие каталитического cysteine, что обусловливает его неспособность к каталитической активности. Избыточная экспрессия FLIP в некоторых линиях клеток ингибирует death-рецепторами обусловленный апоптоз, преимущественно за счёт блокирования сайта, связывающего caspase-8 в DISC. Работа Chang и др. выяснила этот кажущийся конфликт, показав, что низкие уровни экспрессии (близкие к тем, что появляются в нормальных клетках) FLIP усиливают Fas-индуцируемую активацию caspase-8 в DISC; но только высокие уровни (обнаруживаемые в определенных опухолях, напр.) FLIP ингибируют активацию caspase-8 [17]. Это исследование было дополнено результатами работы, показавшей, что FLIP способен формировать гетеродимеры с caspase-8, которые обладают каталитической активностью [18], подтверждая механизм активации caspase-8 посредством димеризации.

Intrinsic pathway (caspases-9 and -2)


Внутренне присущие пути используются для элиминации клеток в ответ на ионизирующее излучение, химиотерапию, митохондриальные повреждения и некоторые онтогенетические сигналы. После запуска гибели митохондрии м. оказаться избирательно permeabilized, что ведет к высвобождению цитохрома c и рекрутированию и активации начальной каспазы внутренне присущего пути, caspase-9, в комплекс, известный как 'apoptosome' [19]. Центральным компонентом apoptosome является белок, известный как Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1), который и рекрутирует caspase-9 посредством своего N-терминального caspase-activation recruitment domain (CARD) [20]. В своём молчащем состоянии Apaf-1 является компактной молекулой с головкой (CARD domain), засунутой между её ног (два β-propellers, образуемые набором WD40 повторов). Цитохром c (который, что удобно, примерно того же самого размера, что и ) смещает головку, позволяя компактной структуре расправиться в более линейную структуру, которая полимеризуется после связывания с АТФ [21]. ЭМ исследования показали, что apoptosome является колесом с 7 карманами (seven-spoked) и с центральной ступицей, которая содержит домен, рекрутирующий caspase-9, который формируется с помощью CARD Apaf-1. К сожалению, конформация caspase-9 не видна на этой картине, но др. техники показывают переход от мономера к димеру, аналогичный тому, что наблюдается при активации caspase-8.
Хотя мономеры концентрируются в цитозоле, но трехмерная кристаллическая структура caspase-9 показывает, что активной формой является димер [22]. Интересно, что эти димеры содержат только один активный домен в результате стерического столкновения интерфейса димера. Др. домен димера находится в зимоген-подобной конформации с выведенными из строя детерминантнами специфичности и каталитическим аппаратом. Важно, что конформация неактивного домена почти идентична зимогенной форме caspase-7.
Как и в случае каспазы-8, не только расщепление необходимо для активации caspase-9, но оно также недостаточно для продукции активного энзима [3,23]. Каспаза-9 активируется с помощью мало-масштабной перестройки поверхностной петли, которая предопределяет расщепление субстрата и каталитические остатки [22]. В простейшей модели это достигается с помощью димеризации мономеров caspase-9 внутри apoptosome, с интерфейсом димера, обеспечивающим поверхность, подходящую к каталитической организации активного сайта.
Хотя caspase-9 является общим инициатором внутренне присущего пути, недавние исследования показали, что необходима caspase-2 для апоптической реакции на нейротрофическую deprivation [24] и повреждения ДНК [25], субнабор внутренних стимулов. Caspase-2, по-видимому, активируется с помощью взаимодействия с комплексом высокого мол. веса, который нуждается в CARD каспазы-2 [26]. Компоненты этого комплекса ещё не идентифицированы, но показано, что он независим от Apaf-1. Как и у др. инициаторных каспаз зимоген caspase-2 является латентным мономером (F Scott, K Boatright and G Salvesen, unpublished data) и не требуется расщепления для её активации [26]. Скорее всего, активная форма caspase-2 существует и в расщепленном и нерасщепленном состоянии, в комплексе с активатором высокого мол. веса неизвестного состава.

Executioner caspases-3 and -7


В сильном контрасте с инициаторными исполнительные зимогены caspase-3 и -7 существуют в цитозоле в виде неактивных димеров [4]. Они активируются с помощью ограниченного протеолиза внутри своего междоменового линкера, который осуществляется с помощью инициаторной каспазы или случайно с помощью др. протеаз в специфических условиях (Figure 2b). Caspase-6 изучена недостаточно по сравнению с caspases-3 и 7, но отнесена к исполнительным каспазам на основании отсутствия длинного pro-domain и своего презумптивного расщепления ниже инициаторов. Кроме того, в рекомбинантной форме её зимоген является димерным [27]. Кристаллическая структура зимогена caspase-7, активной caspase-7 и связанной с ингибитором caspase-7 служит в качестве модели, которая устраняет кажущийся конфликт между механизмом расщепления для активации исполнительных каспаз и механизмом димеризации для апикальной активации каспаз [28,29,30]. В цитозольных концентрациях в клетках человека зимогены caspase-3 и -7 уже димеры, но расщепление внутри их соотв. линкерных сегментов необходимо для активации [29,30]. ТО же самое переустройство каталитических и субстрат-связывающих остатков, наблюдаемый у caspase-9, происходит и у caspase-7, указывая тем самым, что фундаментальный механизм активации зимогенов эквивалентен. Различны только движущие силы: линкерный сегмент pro-caspase-7 блокирует переустройство активного сайта вплоть до расщепления, после которого ordering of the active site until cleavage, whereupon новые N- и C-терминальные последовательности помогают стабилизации активного сайта. Свойство, которое позволяет самостоятельным движущим силам сходиться на одном и том же механизме активации, благодаря необычной пластичности остатков, составляющих активный центр каспаз, который довольно необычно для протеаз преимущественно помещается в flexible петли, а не в области с упорядоченной вторичной структурой.
Почему зимогены исполнительных каспаз димерны, тогда как зимогены зачинающих каспаз мономерны при физиологических концентрациях? Частично это связано с относительно слабым гидрофобным характером интерфейса димеров у каспаз-8 и -9, которое сильно контрастирует с чрезвычайно гидрофобной природой интерфейса димеров каспаз-3 и 7. Так, Kd для димеризации caspase-3 более 50 nM [31], это больше на 3 порядка величин, чем Kd для caspase-8 (менее 50 mM) [5].
Исполнительные каспазы-3 и 7 имеют более короткие N-терминальные расширения, чем инициаторные каспазы и в течение некоторого времени роль этих prodomains оставалась неясной. они не участвуют в механизме прирожденной активации [32,33], но очевидно важны для эффективной активации исполнительных каспаз in vivo, возможно благодаря пространственной секвестрации или клеточной компартментализации [33,34].

Conclusions


Хотя инициаторные и исполнительные каспазы обладают разными механизмами активации - димеризация для initiators и расщепление между доменами для executioners - фундаментальный механизм латентности зимогена законсервирован: активация обоих типов каспаз нуждается в транслокации активационной петли. Для executioners, эта транслокация заблокирована с помощью стерического препятствия, накладываемого междоменовым линкером. Для initiators, сначала должна произойти димеризация, которая позволяет активационной петле взаимодействовать с соседним мономером. Мы предполагаем, что все инициаторные каспазы д. подвергаться действию механизма monomer-dimer активации, за счёт гомодимеризации или даже гетеродимеризации (как это предполагается для caspase-8 и FLIP [18]). Имеющиеся данные подтверждают, proximity-induced активация м.б. приложима к инициаторным каспазам, участвующим в воспалении. Установлено, что у людей caspases-1 и -5, по-видимому, собираются в ансамбль в interleukin-1β активаторном комплексе, наз. 'inflammasome' [35], тогда как генетические доказательства у мышей указывают на взаимодействия между белками ортологами caspases-1 и -11 [36]. Интересно, что это м.б. примеры гетеродимеризации, важные для активации цитокинов.
Пересмотр гипотезы для активации инициаторных каспаз имеет важные последствия для интерпретации эксперим. результатов, связанных с активностью каспаз. Напр., большинство исследований интерпретировало расщепление каспаз как доказательство их активации. Это приложимо только для исполнительных каспаз, которые активируются за счёт такого расщепления. Безусловно расщепление caspase-8 и -9, описанное в большинстве публикаций обычно является следствием их активации. Расщепление инициаторных каспаз не способствует их активности несмотря на то, что они уже в димерной конфигурации. В этом контексте концепция обратной (feedback) активации executioners (caspases-3 и -7) с помощью initiators (caspases-8, -9 и -10) м.б. неправильной.
Разумно полагать, что инициальное активирующее событие на протеолитическом пути не м.б. самим протеолизом. В самом деле, большинство протеолитических каскадов инициируется с помощью кофакторами управляемых конформационных изменений в зимогенах протеаз. В случае апоптоза специфические конформационные изменения, управляемые с помощью кофакторов (DISC или apoptosome), это димеризация. Induced proximity преодолевает энергетический барьер для димеризации инициаторных каспаз, чтобы превратить бимолекулярные взаимодействия в одномолекулярные. Как только сгенерирован первый протеолитический сигнал м. начинаться специфический протеолиз, чтобы направить вперед каскад. Мы полагаем, что механизм активации исполнительных каспаз является недавним приобретением. Исходным же механизмом м.б. proximity induced димеризация.

Update


Две группы недавно выявили неожиданный аспект внутреннего пути активации. В противоположность простейшему процессу, представленному на Рис. 1, активации caspase-8 в Fas-индуцированном DISC, активация caspase-8 с помощью TNF пути происходит не на ассоциированном с мембраной сигнальном комплексе [37,38]. Скорее caspase-8 активируется с помощью ассоциации с цитозольным комплексом во время TNF-индуцированного апоптоза. С др. стороны, описана кристаллическая структура caspase-2 в комплексе с aldehyde ингибитором [39]. В этой структуре caspase-2 была расщепленным димером с интерфейсом, стабилизированным с помощью дисульфидных связей. Это подтверждает роль redox условий в модуляции активации caspase-2 с помощью димеризации.
Сайт создан в системе uCoz