Reis, T. & Edgar, B. A. Negative regulation of E2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell117, 253–264 (2004) | | | |
In Cell, Reis and Edgar shed light on the regulation of cell-cycle timing by showing that the transcription factor can modulate cell-cycle-phase length in Drosophila melanogaster wing-disc cells.
Избыточная экспрессия регуляторов клеточного цикла Cyclin E () и Cdc25 (известен как String () у D. melanogaster) укорачивает G1 и G2 фазы, соотв. Однако, однако общая скорость клеточных делений сохраняется за счёт удлинения др. фаз клеточного цикла. Если существует активный механизм, который отслеживает и сохраняет общую продолжительность клеточного цикла, то экспериментальное удлинение фаз клеточного цикла д. приводить к сходному результату сохранения скорее, чем к удлинения клеточного цикла.
Авт. удлиняли G1 фазу в личиночной ткани посредством избыточной экспрессии CycE-Cdk2 ингибитора dacapo (; гомолога у D. melanogaster p21CIP1 и p27KIP1). Анализ клеток крылового диска показал отсутствие общего увеличения клеточного цикла за счёт компенсаторного укорочения последующих S и G2 фаз. Транскрипция stg, который является скорость ограничивающим фактором для G2-M перехода, усиливается в клетках, избыточно экспрессирующих dap, это объясняет увеличение скорости прохождения G2-M. На транскрипцию stg влияет активность E2F1 и др. E2F1 генов-мишеней, ribonucleotide reductase-2 () и cycE, активность которых также усиливается в этих клетках. Иммуноокрашивание таких клеток выявляет увеличение количеств белка E2F1, которое коррелирует с усилением активности E2F1 генов-мишеней.
Затем авт. вызывали избыточную экспрессию wee1, который удлиняет G2 фазу посредством ингибирования Cdk1. Уровни мРНК и белка E2F1 мишеней stg, rnr2 и cycE в этих клетках увеличены, это снова коррелирует с увеличением количеств белка E2F1. Общая длина клеточного цикла сохраняется за счёт укорочения G1 фазы, эффект, который м.б. приписан увеличению количества CycE. Сходные результаты наблюдались в клетках, в которых G2 фаза удлинялась за счёт избыточной экспрессии др. регулятора клеточного цикла, Tribbles. Итак, редукция активности Cdk расширяет специфическую gap фазу, увеличивая уровни E2F1 и даёт в результате компенсаторное укорочение complementary gap phase.
Манипулируя активностью Cdk путём избыточной экспрессии активаторов или ингибиторов Cdks, было подтверждено, что активность Cdk регулирует уровни белка E2F1. Двойное мечение клеток крыловых дисков по белку E2F1 и по маркёрам, которые специфичны для разных фаз клеточного цикла, было показано, что уровень E2F1 осциллирует в ходе клеточного цикла - он присутствует в G1, G2 и M фазе, но отсутствует в S фазе. Однако, специфичное для клеточного цикла распределение E2F1 не испытывает влияния со стороны активности Cdk. Боле того, когда e2f1 искусственно экспрессируется в ходе клеточного цикла, то белок E2F1 по прежнему отсутствует во время S фазы, это указывает на то, что E2F1 белок удаляется из клеток в S-phase.
Затем авт. манипулировали с клеточным циклом в клетках, лишенных активности E2F1 благодаря мутации в , который является существенным коактиватором E2F1. Они установили, что активность E2F1 необходима для усиления активности генов stg, rnr2 и cycE в Cdk2-inhibited клетках и компенсации цикла в Cdk1- и Cdk2-inhibited клетках. Более того, избыточная экспрессия белков, которые способствуют клеточному росту (таких как Rheb или Myc), обычно ускоряет G1-S переход и удлиняет G2 фазу, но в DP-мутантных клетках эффект выражен в значительно меньшей степени. Эти клетки также обладают высоким уровнем апоптоза, это указывает на то, что в отсутствие активности E2F1 клетки не м. выносить изменения в фазах клеточного цикла, которые индуцируются физиологическими промоторами роста.
Авт. приходят к выводу, что "...in Drosophila, E2F1 is a central component of a regulatory circuit that allows cells to sustain alterations in the lengths of individual cell cycle phases without compromising overall cell cycle timing." Они полагают, что фосфорилирование E2F1 с помощью Cdks м.б. ответственным за targeting E2F1 на деградацию белка.