The Nature Reviews Drug Discovery Ion Channel Questionnaire Participants Nature Reviews Drug Discovery3, 239-278 (2004); doi:10.1038/nrd1361
Ion channels represent a rich and relatively untapped vein of future therapeutic targets, but realizing their potential is proving harder than first imagined. The unexpected setbacks, resulting in an ever-lengthening list of failed drug development programmes based around ion channels, highlight our need for a greater understanding of the underlying biology and physiology of ion channel function. To this end, Nature Reviews Drug Discovery has attempted to survey the field by posing 20 questions of fundamental importance to the development of the field to 20 of the world's leading authorities on ion channel research, and here we present their answers.
Рис.1. | Structure of an assembled potassium channel.
Рис.2. | Gating of voltage-dependent potassium channels.
Рис.3. | Long-QT syndrome is an example of a well-characterized channelopathy.
Рис.4. | Ion channels present a multitude of opportunities for points of intervention by pharmaceutical agents.
Рис.5. | >Natural products, including venom peptides110, can be sources of specific chemical modulators.
Рис.6. | Accurate knowledge of the structure of a ligand-binding protein can yield structural information on the ligand-binding domain of related ion channel proteins.
Рис.7. | The remarkable similarity of K+ channel pore regions presents a challenge in the design of channel-specific blockers.
Рис.8. | Selectivity of drug action can be achieved by blocking, or modulating, particular states of an ion channel.
Табл.1 | Mutations in several ion channels can cause inherited LQTS
1. What are the new technologies that are having the greatest impact on your area of ion channel research?
Trevor Smart. Самое сильное влияние на исследование ионных каналов оказало усовершенствование существующих технологий. Сюда входит и техника клеточной биологии и imaging, с помощью которых выявлено перемещение ионных каналов (trafficking) в реальное время и доставка определённых частей клеточных мембран (напр., синапсов); использование , которая сделала возможной более высокие разрешения атомной структуры кристаллизованных каналов; новаторское получение мутантов ионных каналов, таких как мутации репортёров, чтобы сделать возможной интерпретацию функции каналов, используя электрофизиологию; и тщательное использование knock-in животных, у которых эффекты едва уловимых мутаций ионных каналов м.б. оценены на организменном фенотипическом (поведенческом) уровне.
John Peters. Хотя и не совсем новая технология, но способность генерировать knock-in животных с transmitter-gated ионными каналами, которые слегка изменены в отношении своей фармакологической модуляции (скорее, чем значительное устранение функции, получаемое у knockouts), является важной областью, которая потенциально связывает молекулярную структуру, а также клеточную и системную физиологию через поведение и выявляет мишени для терапевтического вмешательства. Наилучшим примером, по моему мнению, является работа Hanns Mohler and Uwe Rudolph, а также исследователей Merck, Sharp and Dohme (Harlow, UK), которые оказались способными выяснить репертуар поведения лигандов для классических benzodiazepine рецепторов (включая sedative, amnestic и anxiolytic действие), связанное со специфическими изоформами GABA (γ-aminobutyric acid) рецепторов , которые дифференциально экспрессируются в ЦНС1. В сочетании со знанием регионального распределения мутантных субъединиц возможно описать специфические поведенческие действия определённых нервных дуг (circuits). Столь же важны эти исследования для идентификации определенных изоформ, GABAA-рецепторов в качестве мишеней для действия лекарств.
Chris Miller. Рентгеновская кристаллография - старая технология уже давно используется в исследованиях ионных каналов.
Michael Sanguinetti. По моему личному впечатлению, наиболее важным достижением было выяснение трехмерной структуры K+ каналов группой MacKinnon из Rockefeller University2-4 (Рис. 1 и 2). Это сделало возможным более целенаправлено изучать структуру и функцию, используя сайт-направленный мутагенез, и это позволило моделировать взаимодействия лекарство-канал.
David Clapham. Структуры высокого разрешения ионных каналов, полученные Rod MacKinnon и коллегами оказали огромное влияние2-4. Две ключевые области функции ионного канала, о которых не было определенной ясности, это избирательность и пропускная способность (gating); MacKinnon внёс значительный вклад в понимание их, определив механизм K+ и Cl- избирательности на атомном уровне и распространив структурную информацию на механизм пропускной способности (открытия и закрытия) канала. Хотя технология была и не новой, но MacKinnon достиг значительного успеха по кристаллизации этого трудного мембранного белка (Box 1). (Мембранные белки благодаря их присутствию в липидном би-слое почти в 100 раз труднее очищать, чем растворимые цитоплазматические белки, очищенные из ряда структур).
Box 1 | The fine art of ion-channel crystallization. The fine structural detail of proteins at the atomic level can be analysed by X-ray crystallography of the protein constrained in an ordered state (that is, as a crystal structure). Although the process of protein crystallization has been applied successfully to many soluble proteins, it has been far harder to achieve for membrane proteins. But why is it so problematic? There are two main issues: first, as receptors and channels are present in the membrane at relatively low concentrations, it is often difficult to obtain sufficient quantities of purified protein for crystallization; and second, the purification process can cause a membrane protein to become structurally unstable, and the detergents used for membrane extraction can hinder crystallization.
Increasing membrane protein availability
It is no coincidence that systems in which channels are expressed at high density, such as the nicotinic acetylcholine receptor in the electric organ of Torpedo electric rays, have yielded the most information to date on channel structure. If natural sources of high-density ion channels are unavailable, recombinant proteins can be overproduced by transfecting heterologous expression systems with vectors that incorporate powerful promoters. Methods range from using yeast and bacterial systems, such as Pichia pastoris and Escherichia coli, to insect-cell-based systems, such as Sf9 cells infected with baculoviruses101-103. However, vital post-translational modifications and the correct folding of the protein cannot always be guaranteed in some heterologous systems. This has led to investigations into the use of mammalian cells as vehicles for high protein expression, particularly using viral infection, so that the cell's protein synthetic machinery can be commandeered into producing the ion channel of interest104.
Solving the protein-purification problem
If sufficient protein can be produced and correctly processed in a suitable cell type, the issue of purification becomes key.
The antibody approach. Although antibodies can aid purification, membrane proteins must be removed from their supportive lipid environment for complete isolation. Membrane proteins are naturally amphipathic, with largely non-polar surfaces that contact the membrane lipid phase, and polar surfaces that face the aqueous environment and the polar groups of the lipid bilayer; these properties mean that their extraction and solubilization usually requires the use of detergents. The protein–detergent complex isolated after purification is a flexible structure, which can prevent the protein from assembling into the rigid lattice-like arrays that are required for crystallization. To overcome this problem, the polar surfaces of the isolated proteins can be increased or accentuated by antibody binding. Native antibodies are considered unsuitable because of their own inherent structural flexibility; however, antigen-binding fragments (Fabs) can produce a more rigid structure by providing a protein scaffold. This approach has been successful for several proteins105, and was recently used by MacKinnon and colleagues in their crystallization of bacterial potassium channels4.
The lipidic cubic phase approach. As an alternative, a molecular scaffold or matrix can be used as a 'seeding site' for crystalline protein growth. In this regard, recent work on 'lipidic cubic phases' shows promise. The phase is constructed by combining the membrane protein and its solubilizing detergent with lipids in water. The polymorphism of the lipids in solution produces a micellar phase and a structured bicontinuous phase; the latter has several components that are conducive to crystallization, including a lipid matrix that supports the membrane protein (plus the detergent) in a 'pseudo bilayer' without any disruption to the lipid structure itself; a matrix that allows crystal formation from seed sites; and aqueous channels that penetrate deep into the phase, allowing more protein to flow into the structure to 'feed' the crystal seeding sites. These characteristics were adequate to allow the growth of bacteriorhodopsin crystals22.
Interpreting static images of ion channels
Even if crystallization is achieved, we must consider the particular state in which the once highly dynamic protein has been captured. In the cell membrane, such proteins will exist in several open, shut, desensitized (ligand-gated) or inactivated (voltage-gated) states; however, crystallization might require the protein to be forced into a specific or unusual conformation (possibly by antibody binding). The isolated protein will also be devoid (most probably) of intracellular anchoring proteins, kinases and other regulatory features that could influence its structure. Essentially, the crystal is just one static image of a dynamic protein. Nevertheless, with careful investigation, such images are likely to be informative about fundamental questions about the operation of ion channels and their regulation by drugs.
Trevor Smart
Dennis Dougherty. Кристаллография бактериальных каналов стала возможной. С 1998 была выявлена кристаллическая структура нескольких прототипных ионных каналов, в первую очередь благодаря достижениям Rod MacKinnon и Doug Rees. Как уже отмечалось MacKinnon's структуры оказали существенное влияние, а 3 структуры, выявленные группой Rees 5-7, существенно расширили наше понимание структуры каналов. Две самые последние структуры из этих лаб. - KvAP, voltage-gated K+ канала из бактерий Aeropyrum pernix от MacKinnon4, и small-conductance mechanosensitive (MscS) канала от Rees5 - это чувствительные к эл. напряжению каналы. Несмотря на два совершенно различных способа, м. оказаться, что фундаментальные чувствительные к напряжению механизмы сходны.
Эти структуры создают чрезвычайно удобные стереотипы для выяснения механизмов действия широкого круга важных каналов. Однако надо помнить, во всяком случае, что это бактериальные каналы. Необходимо определить, до какой степени эти структуры информативны в отношении ключевых игроков в ЦНС. Очевидно всё же, что значение структуры бактериальных ионных каналов основополагающее для будущих экспериментальных исследований каналов млекопитающих.
Мутагенез с не-естественными аминокислотами также очень важен. Это существенная часть моих собственных исследований. Важно осуществить экспериментальные, функциональные тесты степени, до которой кристаллические структуры модельных мембранных белков м. иметь отношение к желаемым мишеням у млекопитающих. Существенно, что функциональные зонды довольно сравнимы с таковыми рентгеновских кристаллографических структур, и мутагенез не-естественных аминокислот является безупречным в этом отношении. Эта методология используется несколькими группами для изучения растворимых белков; наша группа в сотрудничестве с Henry Lester, сконцентрировалась на использовании unnatural аминокислот для зондирования ионных каналов8.
Sarah Lummis. Рентгеновская кристаллография (атомное разрешение) определения структуры является сегодня самым существенным толчком в моей области исследований ионных каналов (взаимоотношения между структурой и функцией в ligand-gated ионных каналах). К сожалению, сегодня недоступны такие структуры для любых Cys-loop рецепторов, которые включают nicotinic acetylcholine (nACh), GABAA, и 5-hydroxytryptamine (5-HT)3 рецепторы. Однако опубликованная структура acetylcholine-binding protein (AchBP) оказала драматическое влияние на эту область9. Она позволила исследователям идентифицировать критический связывающий сайт и меж-субъединичные остатки nACh рецептора, а в комбинации с имеющимися данными ЭМ структуре становится возможной идентификация возможного механизма перемещения в сайте связывания, который д. запускать открытие канала. Сочетание данных ЭМ с известной информацией по последовательностям и структуре10 , позволило предложить возможный механизм, с помощью которого конформационные изменения сайта связывания м. открывать канал; это позволяет предложить гипотезу, которую м. тестировать, и которая позволит прояснить этот вопрос.
Francisco Bezanilla. Спектроскопическая техника, включая (EPR), nuclear magnetic resonance (NMR) спектроскопию и флюоресценцию в дополнение к экспрессии, очистке и восстановлению бактериальных каналов важна для спектроскопии и кристаллизации.
Senyon Choe. Рентгеновская кристаллография и открытие бактериальных эквивалентов и не-избирательных каналов оказала существенное влияние на мою область исследований ионных каналов. Я полагают. что NMR спектроскопия и рентгеновская кристаллография вскоре будут оказывать более существенное влияние, чем до этого на определение структуры каналов из эукариот. Для этого имеются 2 причины. Во-первых, NMR технология доросла до стадии использования её для крупно-размерных ионных каналов, она предоставляет новую информацию относительно динамики конформаций ионных каналов. Эта критическая информация будет дополнять структурную информацию, полученную с помощью x-ray кристаллографии и методов оптической спектроскопии. Переходы между состояниями являются возможно характеристиками функциональной способности ионных каналов. Технология спектроскопии, которая позволяет детализировать конформационные изменения индивидуальных атомов, следуя временной шкале, с которой оперируют ионные каналы, м. оказаться инструментом, позволяющим завершить наше понимание структурных механизмов функциональной способности каналов. Во-вторых, технические достижения были использованы для продукции достаточных количеств эукариотических ионных каналов для структурных исследований. Это делает возможным знания, полученные на каналах бактерий верифицировать, тестировать и улучшить так, чтобы мы смогли непосредственно адресовать вопросы нейрологии, такие как, каково влияние ligand-channel и межбелковых взаимодействий на регуляцию каналов, исходя из новых структурных перспектив.
Dale Benos. Масс-спектрометрия и анализ микромассивов имеют важное значение. С очень чувствительными спектрометрами и ассоциированными протеомными базами данных сегодня возможно идентифицировать белки, находящиеся в низких концентрациях, ассоциированные или составляющие часть комплекса ионного канала. Анализ микромассивов делает возможным идентификацию генов ионных каналов, которые или активируются или подавляются при специфических наборах физиологических условий или болезненных состояниях. Напр., используя анализ микромассивов, в нашей лаб. был идентифицированы мириады ионных каналов, аквопоринов и транспортёров на уровне мРНК, которые отличаются в нормальном головном мозге и при очень злокачественной glioblastoma multiforme головного мозга11. Мы и др. использовали mass spectrometry/proteomics для анализа белковых компонентов в биологических жидкостях и чтобы идентифицировать или подтвердить присутствие определенных субъединиц ионных каналов в геле.
Kenneth Chien. Геномные базы данных используются для выявления новых ко-регуляторов каналов в дополнение к новым assay systems для выяснения их пересечения с определёнными сигнальными путями в клетках и интактных организмах. Напр., недавние исследования открыли семейство генов для voltage-gated K+ (Kv)-channel-interacting protein (). Специфические, ограниченные тканями изоформы играют ключевую роль в количественно регулируемом (Ito) в сердце, а потеря регулятора увеличивают чувствительность к кардиальной 12. KChIPs динамически регулируются с помощью путей передачи кардиальных сигналов во время приобретенных форм болезни, подтверждая тем самым потенциальную связь между наследственными и благоприобретенными болезнями. Возникает вопрос, существуют ли дополнительные классы канальцевых акцессорных белков и цитоплазматических модуляторов, которые экспрессируются в специфических субнаборах клонах возбудимых клеток, которые могли бы позволить разрабатывать терапевтические стратегии, которые модулируют данный ток, вместо того чтобы взаимодействовать непосредственно с самим каналом. Базы данных м.оказаться информативными в обнаружении подобных кандидатов, а новая технология по обеспечению на чипах в формате массива позволит высокопроизводительную оценку таких кандидатов (Box 2).
Box 2 | The challenge of developing higher-throughput patch clamps
The ionic current through ion channels can be recorded by connecting an electrode inside the cell to another outside. An accurate measurement requires accessing the inside of the cell without introducing extra pathways through which the current can leak . The preferred method for small cells is patch clamping. This technique consists of approaching the tip of a very clean pipette (diameter ~1 μm) to a cell, making contact and obtaining a high-resistance seal (gigaseal) by applying gentle suction between the glass and the cell surface. Next, by applying greater suction or a large voltage, it is possible to break the membrane and thereby make direct electrical contact between the cell interior and the contents of the pipette. Different voltages can then be applied to the pipette, and the currents measured represent the current through the cell membrane, which includes the current carried by the ion channels present.
An ultra-low-throughput technique
Although patch clamping is the central tool for studying ion channels at present, it is time consuming and requires a highly trained experimenter. There is a need to develop more convenient and higher-throughput methodology to enable many cells to be studied simultaneously.
Achieving high-throughput patch clamping
It is first necessary to automate the patching procedure, and then scale it up to many cells in parallel. Several academic and industrial laboratories have approached this challenge by developing a 'patch-on-a-chip' concept using various polymers, silicon or glass as substrates17-20. The concept is summarized in the figure, which shows one of possibly hundreds of unit cells built on a chip. Each cell has a top and bottom compartment that communicate through a hole of ~1 μm diameter. The compartments are connected to a network of microfluidics, allowing solutions to be exchanged independently. Reversible electrodes are built into both compartments and connected to a current-to-voltage converter and a voltage generator (see figure, panel a). The cells are deposited by a robotic arm into the top compartment, and the electrical resistance between the compartments is monitored continuously. Suction or electric fields are then applied to direct a cell to the hole (panel b). When the cell blocks the hole, the resistance rises, signalling the control system to decrease the pressure until a high-resistance seal is formed (>1 gigaohm; panel c). It is then possible to record the currents from one to several individual ion channels in this area. If the whole-cell current is sought, the membrane in the hole must be broken by applying negative pressure in the bottom compartment (panel d), or a large voltage pulse between the compartments. Whole-cell membrane current (Im) recording is done by applying different voltage waveforms (V). At any time, drugs can be applied to the top compartment, while the electrical recording continues (panel e).
The main hurdle of this technique is the reliability of obtaining gigaseals, a process that is still not understood. Of the several substrates being tested (see above), silicon is particularly attractive, because it would be possible to include the required patch-clamp electronics (using very large-scale integration (VLSI)) and microfluidics control systems on a single chip. Alternatively, the complete system can be assembled with a mixture of different substrates using microfabrication techniques. A multiple-cell system with microfluidics and electronics in one device would result in a disposable chip that could be used to simultaneously study hundreds of compounds and conditions in cells expressing the ion channel of interest.
Francisco Bezanilla and Chris Miller
Новая технология по переводу соматических генов самих регуляторов на (RNAi) стратегию м. выяснить in vivo значение этих находок.
Walter Stuhmer. Технологии, которые оказали наибольшее влияние, это молекулярная биология и patch-clamp записи. Молекулярная биология позволяет идентифицировать и манипулировать самими каналами, в дополнение к продукции трансгенных мышей с модификациями кодирующих каналы гены. Patch-clamp recording делает возможным более детальную характеристику ионных каналов. Я считаю, что будущие технологии, которые будут оказывать существенное влияние на исследования ионных каналов будут: электрофизиологическими, высоко-произодительными скринирующими машинами, использующими patch-clamping технику; массивы генов для идентификации ионных каналов и взаимодействующих с ними партнёров; и humanized моноклональные антитела. Последние имеют огромный потенциал для использования в диагностике и терапии, принимая во внимание, что ионные каналы естественно имеют внеклеточные половинки и что моноклональные антитела к ним м. различать сходные, но самостоятельные ионные каналы (см. вопрос 12).
Richard Lewis. Благодаря недавним технологическим успехам оказываются коммерчески доступными несколько параллельных patch-clamp систем (напр., IonWorks HT система, Molecular Devices; PatchXpress, Axon Instruments; см. дальнейшую информацию на websites компаний). Высоко-производительный patch-clamp анализ м. значительно ускорить открытия, ведущие к разработке лекарств для ионных каналов. Техника контроля потенциала клеточных мембран обеспечивает функциональные измерения активности ионных каналов. Использование этого подхода, который традиционно проводился на одиночных клетках, гарантирует, что эффекты большого числа соединений м.б. определены на ионных каналах, поддерживаемых при физиологических и патологических состояниях. С этой техникой, use-dependent ингибиторы (лиганды, которые предпочитают соединяться с состояниями каналов, обнаруживаемыми в болезненных скорее, чем в нормальных тканях) и избирательные ингибиторы патологических состояний м.б. идентифицированы рано скринирующими программами. Параллельная и автоматизированная электрофизиология ооцитов сегдня также доступна, напр., eight-channel OpusXpress от Axon Instruments. Этот подход наиболее пригоден для изучения соединений, которые действуют на внеклеточную сторону ионных каналов, особенно для тех каналов, которые трудно экспрессировать в клетках млекопитающих (напр., voltage-sensitive Na+ channel Nav1.8).
Birgit Liss. Техники микромассивов и в реальном времени проводимые quantitative polymerase chain reactions (PCR) оказывают существенное влияние на область исследований ионных каналов. Последняя техника способна выявлять количественные различия в экспрессии субъединиц ионных каналов и позволяет оценить данные микромассивов на уровне одной клетки. Кроме того, технология клеточно-специфической доставки RNAi/ (siRNA) м. стать многообещающим инструментом.
Alan Verkman. Наша работа по выявлению лекарств в области ионных каналов связана с идентификацией ингибиторов cystic fibrosis transmembrane conductance regulator () белка и активаторов мутантных CFTRs, которые вызывают кистозный фиброз13,14. Широкие (GFP) мутанты со строгой halide-чувствительной флюоресценцией м.б. ключом для эффективного высоко-производительного скрининга в kinetic cell-based assay для идентификации ингибиторов и активаторов CFTR-обусловленных утечек halide15,16.
Dennis Dougherty. Высоко-производительная электрофизиология (см. вопрос 6). Этот инструмент скорее всего станет доступен индустриальным лабораториями очень скоро, позднее его получат академические лаборатории.
Michel Lazdunski. Большинство классических физиологических моделей, такие как electrophysiological recording, адаптированное к мышам (для knockouts), в дополнение к высоко-производительным 'electrophysiological' технологиям для фармакологии.
Kenneth Chien. Я полагают, что мы найдем новое использование для каналов в будущем, также как и новые технологии для исследования их функций станут более распространёнными и будут использоваться помимо электрофизиологических лаб.; это произойдет, если функциональные assay будут низведены до уровня, на котором они смогут легко использоваться молекулярными биологами и учеными-медиками, как это произошло сегодня с базирующимися на GFP системами. Затем я полагаю, что мы сможем использовать их в качестве 'electrophysiological fingerprints' для идентификации специфических сердечно-сосудистых клонов и клонов нервных клеток. Специфическая комбинаторная группировка каналов м. открыть новый путь построения специфичности для каналов, которые широко экспрессируются.
Способность применять высоко-производительное, single-cell recordings к разнообразным клонам первичных cardiovascular-derived клеток м. оказаться важным для разработки лекарств. Большинство высоко-производительных скринингов для малых молекул было проведено на суррогатных клеточных системах (напр., human embryonic kidney 293 клетках), в которых интересующие каналы экспрессируются стабильно, вместо использования интересующих нативных клеток (таких как кардиальные и нейрональные клетки). Возможно существование уникальных, специфичных для типов клеток комплексов белков, которые регулируют функцию ключевых каналов в возбудимых клетках, но эта специфичность м.б. потеряна при первичном скрининге, что препятствует обнаружению новых классов ведущих соединений, которые м. иметь желаемую активность.
David Clapham. Большинство кристаллических структур ионных каналов с разрешением в 2-3-A будет доступно. Избирательность фильтров Na+ и Ca2+ каналов решена не будет, необходимы многие данные для всех конформаций voltage-gated ионных каналов во множественных конфигурациях их пропускной способности. Кроме того станут доступными высоко-производительные patch-clamp методики с много-волновыми записями при гигаОмных или более высоких seal сопротивлениях. Для академических лабораторий 16 волновые будут наиболее используемыми. Для фармакоцептической индустрии будут использоваться 96 волновые или выше. Основным препятствием для получения реальных высоко-резистентных seals будут идентификация и массовое производство идеальных оболочек, которые окажутся способными фофрмировать cell-membrane seal с субстратом. Умные программные обеспечения, которые заняли годы электрофизиологических тренировок по распознанию артефактов, также существенны в дополнение к большинству доступных технологий по идентификации белков, ассоциированных с ионными каналами, таких как простые приготовления мембран для масс спектрометрии (это необходимо для более успешного масс-спектироскопического анализа в присутствии детергентов).
Michael Sanguinetti. Высоко-производительная voltage-clamp instrumentation м. революционизировать способ, с помощью которого будут скринированы лекарства, связанные с активностью ионных каналов. В настоящее время самым серьёзным, скорость-ограничивающим фактором в связи со сбором данных в электрофизиологии является voltage-clamp техника, которая м.б. приложена только к одиночной клетке в данный момент. Кроме того техника трудна для обучения и выполнения, это ограничивает число лаб.. которые рутинно используют её для количественной оценки биофизических свойств ионных каналов. Высоко автоматизированные и с довольно большой производительностью voltage-clamp техника появится до конца 2004, и это увеличит выход от экспериментов на 1-2 порядка величин, а упрощение процедур с помощью автоматизации станет выполнимой целью, такой как получение гигаОмных seals, разрушение мембранных участков, обмен жидкостей в экспериментальных камерах и т.д. Кроме того, эти новые инструменты станут даже лучше для автоматизированного сбора данных и анализа.
Francisco Bezanilla. Высоко-производительное, multiple patch clamping станет использоваться на практике и некоторые компании уже разрабатывают такие технологии, включая Sophion Bioscience, Aviva Biosciences Corporation и Nanion Technologies. Хотя эта техника всё ещё в разработке имеется, по крайней мере, 3 разные группы работающие над достижением гигаОмных seals в разных типах субстратов (silicon, glass или resin) с высокой надёжностью17-20,116. Одна из таких систем уже на рынке (PatchXpress 7000A, Axon Instruments).
Кроме того, я хотел бы увидеть флюоресценцию одиночных молекул и спектроскопическую технику в реальном времени, такую как second harmonic generation, infrared and Raman spectroscopy.
Trevor Smart. Необходимо улучшить imaging инструменты для получения более качественных картин ионных каналов в реальном времени, чтобы понять, как дискретные домены (такие как лиганд-связывающие сайты и ворота каналов) ионных каналов взаимодействуют (напр., техники оптического взаимодействия, такие как (FRET)). Необходимы также инструменты для гарантии более лёгкой кристаллизации ионных каналов и рецепторов для анализа их трехмерной структуры. Таким образом, мы окажемся способными картировать лиганд-связывающие сайты в разных состояниях каналов (открытом, закрытом, desensitized и т.д.); это позволит получить ясные молекулярные матрицы для связывания лекарств с индивидуальными ионными каналами, это нацелдит на разработку новых лигандов. Имеется также необходимость в базе данных по каналам, которая позволяла бы более лёгкое cross-referencing исследование структуры и функции, особенно если они будут содержать мутации ионных каналов.
Sarah Lummis. Я хотела бы иметь инструменты для специфического мечения индивидуальных аминокислотных остатков без нарушения структуры белка. Это бы позволило последующую идентификацию перемещений и/или взаимодействий во время активации и каналов. Сегодня возможно отследить перемещения определённых аминокислот, но это обычно достигается с помощью мутагенеза (напр., в цистеин), сопровождаемого мечением (напр., с помощью флюоресцентного остатка)21. Хотя это и даёт пригодную информацию, но не повреждающий и более гибкий подход был бы намного информативнее. Я полагают, что такие лиганды м.бы быть разработаны химиками, но к сожалению очень мало химиков, интересующихся проблемами в этой области.
Richard Lewis. Хотя высоко-производительное patch clamping и флюоресцентрные краски доступны, но существующие платформы имеют ограничения, или из-за цены hardware или пределов доступных assay formats, которые ограничивают их использование, особенно биотехнологическими компаниями и малого размера фармацефтическими компаниями. Успехи в nanotechnologies и химии красок (таких как Na+-селективных красок) позволят расширить использование технологий, базирующихся на флюоресценции для разработки лекарст для ионных каналов. Кроме того, необходимо преодоление трудностей по экспрессированию определенных ионных каналов в клетках млекопитающих (напр., Nav1.9) за счёт идентификации новых ко-факторов или хаперонов.
Alan Verkman. Na+- и K+-чувствительные GFP мутации м. бы быть использованы для первичного выско-производительного скринирования. Прямое измерение внутриклеточных концентраций ионов при первичном скрининга м. обеспечить чувствительный и специфический отсчёт транспорта ионов, чтобы отобразить membrane-potential-based read-outs. Эффективный электрофизиологический анализ соединений для вторичного скрининга также необходим, включая улучшение методов автоматического oocyte two-electrode voltage-clamp и patch-clamp клеток млекопитающих. Также автоматизированные Ussing chamber/short-circuit current измерения открывают технологически относительно простой подход к сбору электрофизиологических данных по регуляции ионных каналов. Разные техники уже м.б. использованы для выяснения специфических аспектов регуляции и пропускной способности каналов, такие как замены ионов, пермеабилизация апикально/базолатеральных мембран и специфические антагонисты/ингибиторы.
Jamie Vandenberg. Улучшение инструментов/технологий для облегчения очистки (и кристаллизации) мембранных белков очень необходимо. Сюда м. включить, напр., разработку lipidic cubic phases для солюбилизации мембранных белков. Lipidic cubic phases являются термодинамически стабильными решетко-подобными структурами, состоящими из липидных компонентов с трехмерной периодичностью, наполненными с помощью взаимосообщающейся системы водных каналов22. Кроме того, хорошо бы разработать интегрированные модели клеточной электрофизиологии: т.е. модели, которая включает детали всех в клетках, также как и пути, которые их модифицируют, включая, напр., метаболические пути и сигнальные пути. Безусловно такие модели, д. также включать сигнальные пути, которые регулируют транскрипцию генов, внутриклеточный трафик и и межклеточные общения, сопровождаемые разработкой моделей целых органов, таких как разработанные Peter Hunter и коллегами из University of Auckland, New Zealand (23). Наконец, открытие модельного организма, который имеет кардиальный электрический фенотип более сходный с тем, что у людей, который бы м. позволить его оценить (мыши являются очень плохой моделью для вентрикулярной у людей).
Birgit Liss. Необходима надёжная техника амплификации РНК для получения достаточных количеств мРНК или кДНК для профилирования microarray-based экспрессии из ограниченного количества ткани. Идеально иметь амплифицированные нуклеиновые кислоты беспристрастно; чтобы не было нарушены относительные количества каждого транскрипта. Сегодня доступны метод PCR-based амплификации и методы амплификации антисмысловой РНК (такой как T7 polymerase). Первая техника легка для исполнения, но она экспоненциально амплифицирует молекулы ДНК с разной эффективностью. Последняя техника однако м. амплифицировать нуклеиновые кислоты линейным способом. Недавно стали доступны некоторые kits , которые позволяют умножать РНК/кДНК, но пока это не рутинный инструмент. Т.к. техника микромассивов и выделения мРНК из одиночной клетки (используя patch-clamp pipettes или laser microdissection) сегодня рутинные техники, а процедура амплификации всё ещё остаётся узким горлом в экспериментах подобного типа. RNAi протоколы для культур срезов головного мозга также очень ценны, они позволяют проведение электрофизиологического patch-clamp анализа до и после генного молчания.
Alan North. Большинство из упомянутых выше технологий (см. вопрос 1); усовершенствованная микроскопия, включая варианты поверхностной микроскопии и ; и каналы на чипах для высоко-производительного скрининга.
Frances Ashcroft. В списке моих желаний флюоресцентные зонды для быстрого, лёгкого и аккуратного измерения внутриклеточных нуклеотидов (ATФ, AДФ) для выявления корреляций между клеточным метаболизмом и ATФ-чувствительной активностью K+ (KATP)-каналов; хорошо бы fluorophore купировать для FRET, чтобы они не давали 'bleedthrough', и чтобы были достаточно малы, чтобы не нарушать функции каналов, и чтобы м. ли бы легко использоваться для мечения белков в интактных клетках; простой способ измерения митохондриального метаболизма в одиночных клетках; избирательные лиганды для разных типов (Kir); хорошая аннотированная база данных по структуре, функции, экспрессии и т.д. ионных каналов; и система экспрессии для продукции по большой шкале мембранных белков эукариот.
3. How close are we to being able to integrate understanding of the cellular physiology or biophysics of ion channels with their role in disease states?
Chris Miller.Физиология чревата сложностями и в очень редких случаях, когда функция специфична, молекулярно определяемые ионные каналы м.б. отслежены детально до физиологических реакций.
Irwin Levitan. Я полагают, что молекулярные биофизические подходы, которые доиминруют в исследованиях ионных каналов, хотя и являются исключительно продуктивными, грядет время использования клеточных физиологических подходов. Структурные успехи последних лет, сколь они ни показательны, также сместят фокус в более reductionist и не-физиологическом направлении. Имеется множество захватывающих задач особенно в области увязки определенных белков ионных каналов со специфическими мембранными токами прежде, чем мы получим надежду понять патофизиологию болезней ионных каналов. К сожалению, имеется минимальное взаимодействие между молекулярными биофизиками и клеточными физиологами.
Trevor Smart. Мы всё ещё далеки от ясного понимания. Самым большим пробелом исследований ионных каналов является связь между функцией каналов и мутациями и поведением организма. У простейших организмов имеются некоторые многообещающие связи, но у видов более высокого порядка остаётся на повестке выяснение взаимоотношений между функцией каналов, сигнальными путями, поведением сетей клеток (таких как нейроны) и в конечном счёте поведением. Необходимы базовые исследования для изучения того, как ионные каналы влияют на одиночные клетки и сетевые функции. Напр., хотя GABAA рецептор и является главным ингибирующим рецептором в головном мозге, связь мутаций в этом рецепторе с заболеваниями ЦНС трудна, несмотря на эмпирические наблюдения, что многие классы лекарств (напр.,benzodiazepines и некоторые anaesthetics общего действия) влияют на эти рецепторы с хорошим терапевтическим эффектом24. Однако более перспективным кажется то, что некоторые формы пугающей болезни людей () м.б. ассоциированы (хотя и не исключительно) с мутациями в 25.
Alan North. Мы ещё довольно далеки, т.к. детали функциональной роли каналов в индивидуальных клетках ещё не поняты кроме как в непосредственно сигнальных (электрических) терминах. Я полагают, что электрические взаимодействия, которые вызываются просто течениями токов (и которые м.б. смоделированы проводами (cables), разветвлениями проводов, сужениями проводов, резисторами или capacitors), и которые осуществляют свои эффекты на электрически возбудимые молекулы, такие как voltage-gated Ca2+ (CaV), Nav и KV каналы - это классические синаптические соединения (integration). Электрические сигналы от каналов быстро распространяются и охватывают влиянием большие области, тогда как химические сигналы от каналов очень локальны. Необходимо, следовательно, сконцентрироваться на выяснении микродоменов - т.е. эффектах изменений концентрации ионов на соседние молекулы внутри комплекса скорее, чем на цитоплазматических концентрациях. Это уже происходит (напр., передача сигналов Ca2+-channel-to-K+-channel и от Ca2+ каналов в ). Прекрасным примером является работа Neil Marrion, в которой показано, что Ca2+ поступающий через N-type Ca2+ каналы быстро актививрует высоко-проводящие активируемые Ca2+ K+ каналы, тогда как Ca2+, ступающий через L-type Ca2+ каналы, более медленно активирует низко-проводящие Ca2+-активируемые K+ каналы26.
Frances Ashcroft. В большинстве случаев мы ещё далеки! Напр., несмотря на тот факт, что ген CFTR клонирован уже много лет тому назад, но наше понимание в точности того, как он вызывает кистозный фиброз, всё ещё ограничено. Корреляция между генотипом и фенотипом неясны также для мутаций и для многих др. генов ионных каналов. Часто невозможно скоррелировать тяжесть болезни с функциональными эффектами данной мутации, а некоторые мутации м. вызывать разные эффекты у разных пациентов27. Ясно, что генетический фон играет существенную роль; поэтому идентификация др. генов, которые влияют на чувствительность/тяжесть болезни, очень важна.
Alan Verkman. Мы конечно ближе чем 10 лет назад, но не очень близки. Напр., хотя известна биофизика и клеточная функция CFTR, механизм, с помощью которого CFTR кистозный фиброз остаётся неизвестным. Субъекты с муковисцидозом страдают от повторных лёгочных инфекций и нарушений функций лёгких, а также от проблем вне лёгких, таких как неправильная абсорбция в результате панкреатической недостаточности. Имеется множество гипотез, но мало прямых указаний на то, как дефектные CFTR вызывают легочные нарушения, такие как аномальная функция подслизистых желез дыхательных путей, изменение состава жидкости поверхности воздушных путей или rheology и внутренне присущая гипер-воспалительная реакция28, 29. Сложность физиологии млекопитающих и компенсаторные изменения при болезнях остаются основной задачей связи дисфункции белка с клиническими проявлениями.
Francisco Bezanilla. Мы знаем что определенные мутации м. делать с ионными каналами. Однако клинические аспекты обычно намного сложнее и они не м.б. объяснены непосредственными эффектами, наблюдаемыми на изолированных ионных каналах. Чтобы получить полную картину необходимо изучение физиологии клеток in vivo с мутациями и разработать более подходящие модели операций каналов, включая их взаимодействия с остальными частями клетки. Напр., и , которые вызываются мутациями NaV каналов в волокнах скелетных мышц (30). В одном случае hyperkalemic periodic paralysis мутация вызывала большое перекрывание активации и инактивации, генерируемой направленным внутрь током, который депоялизует волокна31. Однако, как в действительности возникает событие паралича неясно и необходимы детальные исследования всех ионных токов, идеально в мышечных волокнах из биоптатов, чтобы оценить роль всех проводников ионов и их взаимодействий в продукции финальной после соотв. стимулов.
Sarah Lummis. В области ligand-gated ионных каналов идентифицирован ряд специфических мутаций, связанных с болезненными состояниями, а их характеристика показала, что они ответственны за возникающие в основе болезни физиологические состояния. Одной из наиболее интересных из них является заболевание autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE), для которого известен ряд мутаций, но всё ещё существуют противоречия относительно интеграции лежащей в основе физиологии с последующими клеточными эффектами. Daniel Bertrand с коллегами, напр., полагают, что при ADNFLE избыточная функция рецепторов (т.е., они более эффективны) м.б. ответственной за инициацию изменений, которые обязательно вызывают эпилептические припадки32. Однако Bruce Cohen с сотр. полагают, что ADNFLE мутации снижают зависимость от Ca2+ индуцируемой ацетилхолином реакции, которая м. запускать судороги в результате увеличения высвобождения nACh-receptor-mediated glutamate во время приступов синхронных повторяющихся активностей головного мозга33. Для большинства болезненных состояний однако, как я полагаю, мы далеки от понимания, хотя секвенирование генома человека и успехи микромассивов и протеомики (см. вопрос 9) , по моему мнению, существенно продвинули наше понимание в этом отношении.
David Clapham. Мы имеем достаточно информации о channelopathies, вызванных одиночными генами, но это мы лишь скребем поверхность. Дальнейший прогресс будет зависеть от более сложного анализа генетики человека и более экстенсивного анализа физиологических основ у модельных трансгенных мышей. Реальная необходимость в улучшении тестов функции нервной системы у нокаутных моделей.
Michel Lazdunski. Мы уже делаем это; такая интеграция будет теперь происходить быстрее для ряда болезней человека. И прогресс будет быстрее, если будут доступны соотв. животные модели.
John Peters. В некоторых случаях мы очень близки. Многочисленные channelopathies, которые ассоциируют со специфическими болезненными состояниями подтверждают это (см. вопрос 14).
Kenneth Chien. мы приближаемся, но одним из препятствий является то, что необходимо множество междисциплинарных подходов с привлечением компьютерных, структурных и клинических экспертиз.
Dale Benos. Со временем ассоциации ионных каналов с болезнями человека будут выявлены. Нарушения функции каналов и/или модулирующих путей, биохимических изменений, ионной среды и т.д. во многих случаях окажутся непосредственно ответственными за физиологию, ассоциированную с определенными болезнями. Напр., , известный как результат мутаций на С-конце или β- или γ-субъединицы эпителиальных Na+ каналов (), ведущих к возникновению геперактивных резорбтивных Na+ каналов в дистальных нефронах и собирающих протоках34. Выяснение подобных альтераций в функции позволят понять и саму болезнь.
Michael Sanguinetti. Channelopathies хорошо охарактеризованы и существуют мышиные модели для некоторых. Long-QT syndrome (LQTS), связанный с нарушением реполяризации в желудочках. который предрасполагает затронутых индивидов к летальной кардиальной аритмии, является прекрасным примером (Рис. 3a). LQTS был распознан как редкий синдром, которые м.б. наследственным (Table 1) или благоприобретенным (напр., как нежелательный побочный эффект некоторых общераспространённых медикаментов (Рис. 3b)). Мол. генетические исследования, проведенные в лаб. Mark Keating's показали, что наследуемая форма LQTS обусловлена мутациями с избыточной кардиальных Na+ каналов или мутациями потери функции в α- or β-субъединицах двух разных 35. Это открытие определило LQTS как гетерогенное заболевание и показало, что разные стратегии лечения необходимы для предупреждения аритмий. Напр., мутации с избыточной функцией Na+ каналов м. лечиться Na+-channel-блокирующими агентами, тогда как LQTS обусловленные мутациями потери функции K+ каналов м. лечиться активаторами K+-каналов. Наиболее эффективные лекарства по этим причинам ещё не разработаны, частично из экономических соображений (небольшой рынок), но теперь, когда поняты основы болезни становится возможной рациональная разработка новых лекарств.
Вызванные лекарствами LQTS почти всегда являются результатом блокады ether-a-go-go-related gene (HERG) человека K+ канала, как нежелательный побочный эффект. Структурная основа сайта связывания частично установлена36. Если эти знания скомбинировать с (QSAR)данными, то окажется возможным осуществление in silico (virtual) скрининга соединений по их способности соединяться с каналами. Этот подход сильно ускорит идентификацию лекарств, которые устраняют блокирующую активность HERG-каналов.
Jamie Vandenberg. При многих 'моногенных' заболеваниях, таких как LQTSs, причинные взимоотношения между аномальной активностью ионных каналов и болезненными состояниями хорошо известны. Однако несмотря на на это мы всё ещё неспособны предсказать клиническое течение болезни. Напр., почему один член семьи погибают в детстве, а др. затронутые члены семьи доживают до взрослой стадии? В самом деле, почему почти все затронутые индивиды живут многие годы, а в некоторых случаях десятки лет, почти бессимптомно? Имеются возможно две главные причины: во-первых, несмотря на присутствие моногенного нарушения клинический исход почти определенно модифицируется компенсаторными реакциями (на уровне транскрипции генов), которые д. варьировать от индивида к индивиду; и во-вторых, хотя аномальные ионные каналы существенно увеличивают риск внезапной смерти, однако летальная аритмия все-таки должна быть запущена в конечном итоге (обычно в ответ на средовые стрессы). Поэтому мы нуждаемся в большей информации в отношении того, какие гены имеют изменённый паттерн экспрессии в ответ на 'knocking out' индивидуальных ионных каналов, а также лучше понимать связь между средовыми стрессами и регуляцией клеточной электрофизиологии. В первую очередь необходимы долговременные исследования изменений в экспрессии генов и идентификация влияний генов-модификаторов (такие как анализ в нескольких генерациях модельных организмов). Во-вторых, необходима разработка лучших моделей, которые включают нарушения активности ионных каналов, метаболических путей, сигнальных путей и межклеточных коммуникаций.
Walter Stuhmer. Диабет затрагивает большое количество людей и показатели быстро растут в основном благодаря огромному потреблению углеводов. Высокие показатели вместе с тем фактом, что болезнь поддаётся лечению, побудили интенсивные исследования различных процессов, затрагиваемых при диабете. Один определенный тип K+ каналов, который зависит от внутриклеточного АТФ, как установлено, играет важную роль в детерминации секреции инсулина37. Модуляция этого канала лекарствами, такими как sulphonylureas, интенсивно исследовалась с целью лечения диабета и мы постепенно стали понимать болезнь38.
Др. группой заболеваний, для которых связь ионных каналов известна на биофизическом уровне, являются мышечные дистрофии. Это обусловлено тем фактом, что большинство из этих болезней генетически связано с ионными каналами27,39.
Для многих др. болезней наши знания в младенчестве и область 'channelopathies' только вырисовывается. Уверенность, что ионные каналы являются исключительными объектами для использования биофизики, являются исключительными мишенями для диагностики и терапии, довольно нова. Имеется огромный потенциал для увеличения нашего понимания, который недоучитывается клиницистами. В этом контексте надо иметь в виду, что значительная доля лекарств, используемая в настоящее время, прямо или косвенно влияет на ионные каналы.
4. As we enter a post-structural era in voltage-gated ion channel research, what big questions remain at the structure/function interface?
David Clapham. Много усилий необходимо, чтобы понять различные механизмы пропускной способности каналов, особенно зависящей от напряжения и лигандов пропускной способности. Механизмы избирательности для K+ и Cl- каналов в основном решены, но всё ещё необходимо выяснение с высоким разрешением структуры пор Na+ и Ca2+ каналов.
Jamie Vandenberg. Необходимо понять динамику внутримолекулярных перемещений в voltage-gated ионных каналах. Это возможно при комбинировании экспериментов по мутагенезу (в комбинации с модификациями побочных цепей аминокислот), стимуляции молекулярной динамики и imaging техники, такой как NMR спектроскопия, EPR спектроскопия и FRET. Необходимо также определить структурные основы специфичности субтипов; напр., в терминах различий в скоростях voltage-сенсорных движений и в рангах чувствительности к напряжению.
Senyon Choe. Помимо фундаментальных физико-химических вопросов, таких как избирательность ионов, ключевым является выяснение регуляторных механизмов, уникальных для каждого эукариотического ионного канала. Ответы на эти вопросы позволят приложить структурную информацию непосредственно к биологии этих каналов, особенно к регуляции функциональной способности индивидуальных каналов. По очевидным причинам регуляторные механизмы будут разными, но д.б. общие нити, связывающие их трансмембранным доменом каналов, т.к. все эти механизмы должны безусловно регулировать избирательность фильтра каналов ('business end' ионного пути), которая строится на общих физических принципах, управляющих заряженными ионами. Я полагаю, что возникнет некоторое консолидированное мнение на фундаментальные механизмы на базе ряда структур родственных каналов, чтобы объяснить, как в целом контролирующие сигналы - будь это эл. напряжение, малые молекулы или цитоплазматические белки - осуществляют свои эффекты, и используют ли они общие механизмы контроля. Какие фундаментальные вопросы возникнут в результате подобных исследований трудно предсказать; но в целом, как я подозреваю, это будут вопросы межбелковых взаимодействий внутри клетки, механизмы, контролирующие их взаимодействия на атомном и молекулярном уровне, и , наконец, механизмы, контролирующие внутри- и межклеточную локализацию каналов, скорее всего будут нас занимать в то время.
Alan North. Эра пока ещё 'post-structural'! Мы нуждаемся ещё во многих структурах. Кристаллические структуры мембранных белков не являются теми же когда они выделяются из липидного окружения, а ассоциированные белки и др. свойства клеточной среды оказывают выраженное влияние на функцию каналов. Хотя структуры одиночных белков известны в деталях, мы не способны понять полностью, напр.. рибосомальный перенос электронов в intermediary метаболизме, когда мы имеем дело со структурами из больших (функциональных) комплексов.
Irwin Levitan. По моему мнению преждевременно делать вывод, что мы вступили в 'post-structural' эру. Выявлена лишь кучка структур и действительно все они из одной лаб. (the MacKinnon laboratory). Хотя эта лаб. сверх продуктивна, но необходимо не забывать, что воспроизводимость является центральным признаком научного успеха. У меня нет вопросов к любой из этих структур, просто нет времени для критического тестирования. Главным сегодня является вопрос, до какой степени опубликованные структуры 'реальны'. Напр., недавняя структура Kv канала была выяснена только с помощью моноклональных антител, путём насильственного введения белка, как обозначают это авт., в искусственную конформацию4.
Francisco Bezanilla. Кристаллическая структура KvAP, которая недавно была опубликована4,40, не представляет собой структуру канала в нативной мембране. Это потому, что хотя кристаллическая пора находится в открытой конформации, но сенсор напряжения находится на внутренней стороне бислоя, в положении, которое соответствует закрытой конформации. Кроме того, авт. нашли, что фрагменты Fab, которые прикреплены к сенсору напряжения и используются, чтобы кристаллизовать канал, не взаимодействуют изнутри с функциональным каналом, восстановленным в бислое, потому что в кристалле сенсор находится внутри. Это установлено авт., которые модифицировали структуру путём пристыковки к области поры др. кристаллической структуры, они установили первые 4 трансмембранных сегмента и предложили новую модель активации канала. Однако с помощью этой новой модели трудно объяснить более 20 экспериментальных наблюдений на эукариотических voltage-зависимых каналах. (41,42,117). Среди этих наблюдений и то, что линкер между сегментами 1 и 2 является внеклеточным, тогда как в модели он заключен в бислой. Кроме того имеется существенное расхождение в измерении расстояний с использованием привязанных блокаторов или resonance energy transfer (FRET and lanthanide-based resonance energy transfer (LRET)) между двумя эквивалентными остатками в сегменте 4 из двух субъединиц, которые составляют примерно половину значений расстояний, предлагаемых новой моделью.
Исходом этого явилось то, что несколько исследователей предприняли серию биофизических экспериментов, чтобы тестировать старую и новую модель, а др. сконструировали новые модели с помощью модификаций кристаллической структуры иными способами нежели это делали авт. KvAP работ42. Есть надежда, что новые кристаллические структуры будут получены в ближайшее будущее с использованием разных наборов Fab фрагментов или разных техник для иммобилизации очевидно мягких (floppy) структур сенсоров напряжения. Кроме того, иеются др. бактериальные voltage-зависимые каналы, такие как channels, such as NaChBac (a Na+ channel from Bacillus halodurans), структура которых м.б. установлена в ближайшем будущем. Др. словами, большой вопрос структурно/функциональных операций сенсора напряжения всё ещё открыт, за исключением того, что сегодня мы имеем грубые структурные путеводные нити, предоставленные нам кристаллическими структурами.
Michael Sanguinetti. Рентгеновская кристаллография будет чрезвычайно полезной, информируя нас о статической структуре каналов, отловленных в специфических состояниях, но она м. оказаться бесполезной для определения природы промежуточных состояний или того, как меняется пропускная способность канала в ответ на изменение напряжения или связывание лиганда. Кристаллические структуры некоторых ионных каналов, которые были недавно опубликованы лаб. MacKinnon стали гигантским скачком 'giant leap for mankind' в глазах биологов ионных каналов2-4. Внесена ясность во внутреннюю работу, во-первых, избирательности фильтров и , во-вторых, сенсоров эл. напряжения, этого невозможно было предсказать на базе имеющихся биофизических данных. KcsA (K+ канал из Streptomyces lividans) предоставляет беспрецендентную картину закрытого состояния2, а MthK (a K+ канал из Methanobacterium thermoautotrophicum) даёт картину открытого состояния Kv каналов3. Недавно структура KvAP удивила нас тем, как сенсор напряжения легко перемещается в ответ на изменения эл. напряжения в мембране4. Несмотря на это, эти структуры оставляют большинство сложных проблем без ответа: как движение voltage-сенсора связано с активацией (открытием) канала?
Dennis Dougherty. Остаётся определить степень, с которой статические картины бактериальных аналогов каналов млекопитающих повлияют на процессы разработки лекарств. Задача сегодня заключается в разработке методов химической шкалы, которые оценят структуры и сообщат нам до какой степени они в действительности соответствуют природе каналов у млекопитающих. Одновременно с ненатуральными аминокислотными методологиями, упомянутыми выше (см. вопрос 1), разработаны и др. инструменты, включая введение химических зондов с помощью модификаций цистеина, FRET и EPR исследования (напр., Eduardo Perozo's работа43).
Кроме того, структуры порождают огромное стремление к компьютерной симуляции каналов - построению гомологичных моделей каналов млекопитающих, исходя из бактериальных структур. Однако моделирование без тщательного экспериментального тестирования моделей являются бесплодными усилиями. Только тесное взаимодействие теории и эксперимента м. дать надежду yg получение информации, пригодной для разработки лекарств. Итак, задачей для структурно-функциональных исследований является достижение высочайшей точности понимания, которое позволит осуществить строгую проверку предсказаний структурных моделей.
Trevor Smart. Имеется множество нерешенных вопросов. Отсутствие знания, касающегося трехмерной структуры огромного большинства каналов, не позволят ни точно локализовать сайты связывания лиганда, ни понять, как разные домены ионного канала взаимодействуют, когда канал активирован. Необходимо транслировать линейные аминокислотные последовательности канала в динамический, трехмерный функциональный белок. Кстати, мы близки к достижению этого для и некоторых бактериальных K+ каналов2,3,7,10,44-46. Это возможно, т.к. nACh рецепторы м. найти в очень высокой плотности в электрических органах рыб, таких как Torpedo electric ray, что делает эти органы идеальным источником материала для изучения структуры этих каналов с помощью электронной микроскопии. Сходным образом м. получать большие количества очищенных бактериальных K+ каналов, что облегчает кристаллизацию белков каналов. С помощью такого подхода мы надеемся установить, как сигналы передаются через белки каналов, тем самым это позволить целенаправленно интерпретировать мутации каналов, которые м. или затрагивать непосредственно связывание лиганда или затрагивать реакцию на лиганд посредством аллостерических эффектов. Сегодня мы не способны определить сайты связывания только анализом мутаций, это трудно и чревато проблемами.
Richard Lewis. Хотя кристаллические структуры ионных каналов получены, только AChBP дает пригодную картину части ионного канала, которую м. использовать как мишень для лекарства (nACh рецептор)9. Необходимо знание высокого разрешения кристаллических структур ионных каналов, вовлеченных в болезненные состояния или близкие к ним состояния, прежде чем будет установлены достоверные structure-activity relationships (SARs) для классов молекул, имеющих значение для терапии. Особое значение имеют кристаллические структуры voltage-sensitive Na+ и Ca2+ каналов млекопитающих, полученные с или без лигандов. Эти структуры позволят рационализировать существующие обширные SARs для многих важных классов лекарств, включая локальные анестетики, антиэпилептики, антиаритмические и антигипертензивные средства. Имеется реальный потенциал, что такое понимание позволит разрабатывать новые молекулы с улучшенной избирательностью. Углубление понимания структурной основы use-dependent активности ключевых мишеней ионных каналов, скорее всего благодаря комбинации crystal structures и компьютерного подходов, обеспечит дальнейшие успехи в терапии, направленной на ионные каналы.
Walter Stuhmer. В этой области клинические аспекты станут центральными, более интересными в академическом смысле. Однако экстенсивные и детальные знания, получаемые в биофизических и физиологических исследованиях на уровне одиночных молекул окажутся пригодными для идентификации путей вторичных мессенджеров, которые участвуют в модуляции каналов и сигнальной трансдукции. Эти вторичные пути м.оказаться интересными мишенями в channelopathies.
Kenneth Chien. C клинической точки зрения лекарства, направленные непосредственно на сами каналы, м. оказаться разочаровывающими, т.к. многие из них м. иметь серьёзные побочные эффекты. Хорошо бы найти пути модулирования функции каналов без непосредственного влияния на сами каналы, влияя на сигнальные пути или на ко-регуляторы каналов. Прекрасным примером первого являются TRP каналы, которые активируются в первую очередь сигналами путей передачи47 (Рис. 4) , а примером последнего является регуляция с помошью KChIP2 белков канала Kv4.2/4.312.
Michel Lazdunski. Я особенно поражен выявлением трехмерной структуры некоторых каналов. Я верю, что эти рентгеновские структуры помогут понять биофизику каналов на атомном уровне. Однако я не верю, что они помогут разработке новых лекарств. Даже если мы имеем в руках рентгеновскую структуру Nav канала, мы не смогли бы открыть антиэпилептическое средство или типа I антиаритмическое лекарство, которые мы уже имеем, и определенно не открыли бы pyrethroids, которые являются мощными инсектицидами. Я не верю, что рентгеновская структура L-type Ca2+ канала смогла бы привести к открытию dihydropyridines, diltiazem (Cardizem) или verapamil (Calan, Isoptin), которые используются для лечение сердечно-сосудиствх заболеваний. Важные усилия предпринимаются для разработки фармакологических средств, направленных на взаимодействующие поверхности ионных каналов и их белковых партнёров (которые м. серьёзно модифицировать их активность) или направленных на сами взаимодействующие белки.
Alan Verkman. Думаю очень пригодны, т.к. природа использует высокого сродства токсины и др. модуляторы ионных каналов.
Francisco Bezanilla. Они чрезвычайно полезны для тестирования структуры каналов и м. ожидать, что еще больше их окажется доступными.
Alan North. Знание молекул из естественных источников по прежнему важно из-за их высокого сродства, высокой избирательности , их поддатливости для мечения и т.д. Далее, должны быть открыты новые молекулы.
Walter Stuhmer. Молекулы, происходящие из натуральных источников, сохраняют свою важность благодаря доступности большого резурвуара, особенно в виде морских и тропических организмов. Эти соединения интересны также как ведущие соединения. Однако в качестве лекарств из-за их низкой избирательности, но лучшей доступности они равноценны моноклональным антителам.
Kenneth Chien. Они пригодны, когда они специфичны, избирательны и конечно имеют мало побочных эффектов in vivo. Они м. использоваться для обеспечения химических нужд, чтобы затем осуществить более рациональный поиск лекарств (Рис. 5).
Dale Benos. Я думаю, что естественные продукты были и будучи чрезвычайно полезными. Большинство естественных соединений, будучи ингибиторами или активаторами ионных каналов, высоко специфичны и действуют с высоким сродством. Имеется уже несколько чудесных примеров ядовитых компонентов, успешно используемых для распутывания сложной структуры ионных каналов; напр., большое семейство neurotoxin пептидов (α-K+-токсинов), обнаруженных в ядовитых скорпионах, установленное с помошью charybdotoxin.
Jamie Vandenberg. Естественные соединения были и будут использоваться. Токсины скорпионов, напр., обладают значительно более высокой специфичностью к индивидуальными ионным каналам по сравнению с большинством фармацефтических соединений, т.к. они соединяются с subtype-specific эпитопами (в этом отношении они аналогичны антителам ). Они поэтому очень пригодные инструменты для тестирования структурных основ различий между гомологичными ионными каналами.
John Peters. Исторический прецендент, м. видеть в примере tetrodotoxin, α-bungarotoxin, (+)-tubocurarine и многих др., который подтверждает, что они продолжают оставаться важными избирательными лигандами, которые позволяют делать различия между субтипами ионных каналов с отличающимся субъединичным составом. Так, α-conotoxins из морских улиток рода Conus являют собой пример ядов, которые отличают субтипы nACh-рецепторов48.
Frances Ashcroft. Маловероятно, что мы откажемся от ряда токсинов, присутствующих в природе, которые нацелены на ионные каналы, а новые скорее всего окажутся также ценными для изучения ионных каналов. Большинство соединяется с высоким сродством и специфичностью и м. использоваться для биохимической очистки белков каналов, картирования структуры связывающих сайтов при анализе мутантов и т.д. Новые агенты которые различают разные субтипы K+-каналов, или которые взаимодействуют с β-субъединицами, были бы очень кстати.
Sarah Lummis.Токсины из природных организмов чрезвычайно важаны для нашего понимания многих ионных каналов (напр., α-bungarotoxin позволяет очищать и безусловно клонировать субъединицы nACh-рецепторов49), хотя они стали и менее популярными в последние годы, главным образом из-за восприятия, что молекулярно биологические подходы более современны. Однако, учитывая очень высокую специфичность большинства таких соединений и сегодня они необходимы для тестирования деталей структуры ионных каналов.
Richard Lewis. Природные продукты, которые нацелены на ионные каналы, останутся центральными для понимания их структурно-функциональных взаимоотношений и физиологической роли. Напр., пептидные токсины часто высоко избирательны к ионным каналам или классам ионных каналов и поэтому используются для экспериментального выяснения их роли in vitro и in vivo моделях нормальных и болезненных состояний. Природные продукты продолжают оставаться ключевым источником новых химических и структурных матриц, на которых разрабатываются новые терапевтические средства. Напр., Elan Pharmaceuticals предполагает выпустить New Drug Application (NDA) для ziconotide (Prialt; перовклассный N-type Ca2+-channel ингибитор, ω MVIIA, для боли) во втором квартале 2004.
Michel Lazdunski. Токсины неоценимы для понимания ионных каналов на молекулярном уровне. Они существенны для идентификации ионных каналов, ещё тогда, когда мы даже не знали являются ли каналы белками; для очистки ионных каналов (напр., tetrodotoxin, saxitoxin, scorpion toxins, sea anemone toxins, veratridine, batrachotoxin, pyrethroids, grayanotoxins, brevetoxins и ciguatoxin для voltage-sensitive Na+ каналов; и mast-cell degranulating (MCD) peptide, dendrotoxins and apamin для K+ channels); для локализации каналов уже в то время, когда ещё нельзя было использовать иммунологическую технику или гибридизацию in situ; для выявления различий каналов внутри семейства (они различают разные типы Nav каналов (tetrodotoxin-чувствительные и tetrodotoxin-резистентные) и K+ каналов (Ca2+-активируемые K+ каналы, чувствительные к apamin или к charybdotoxin)); и для понимания физиологической роли каналов. Очень специфический токсин является, по крайней мере, лучше, чем классический нокаут, т.к. отсутствует компенсация из-за экспрессии др. генов.
Кроме того, физиологический и фармакологический анализ эффектов токсинов предоставляет важную информацию о channelopathies, еще до открытия мутаций ионных каналов у человека с их помощью были выявлены эти нарушения, когда не существовало ещё самого понятия 'channelopathies'. По моему мнению токсины будут оставаться важным инструментом в изучении ионных каналов. Многие ядовитые пептиды будут в свою очередь использованы в качестве лекарств и конечно будут использованы как "директивы" ('leads') для будущей разработки лекарств.
Trevor Smart. Натуральные продукты будут оставаться ценными для тестирования функции каналов. Они часто имеют высокую избирательность и потенцию, обусловленные частично длительным периодом эволюции под действием естественного отбора. Они часто важны для целей очистки белков рецепторов и каналов и используются как матрицы для разработки синтетических лигандов. Области K+ и Ca2+ каналов были выявлены благодаря использованию батареи токсинов из улиток и пауков, некоторые из которых повлияли на классификацию каналов ёщё до их клонирования. Они также оказались чрезвычайно полезными в нативных клетках, в комбинации с электрофизиологией, для дедукции, какие типы каналов присутствуют и какова их возможная функция. Последнее является очень важным методом и сегодня он единственный для выявления функциональных последствий активации каналов.
Сегодня несколько центров занимается продукцией рецептор-специфических и субтип-специфических лигандов на базе рациональной синтетической химии. Эти подходы довольно успешны в выяснении роли рецепторов и каналов, на это указывает, напр., их использование в исследованиях metabotropic glutamate рецепторов и GABAB рецепторов.
David Clapham. Токсины от ядовитых животных очень важны для понимания структуры и функции: т.к. антитела, которые блокируют функцию, отсутствуют; др. продукты, такие как потенциальные терапевтические средства из растений, изучены плохо. Поэтому наиболее пригодными фармацефтическими агентами для продукции, высвобождения и абсорбции являются малые молекулы.
Природные продукты часто трудно выделить и часто невозможно синтезировать. Кроме того, т.к. они обычно используются как агенты для биологической защиты или для уменьшения конкуренции за пространство, пищу и воспроизведение, то они чаще всего токсичны. Наконец, чтобы выжить у людей развилась очень эффективная иммунная и др. защитные стратегии против таких агентов. Усилия природы не направлены на разработку молекул, которые бы лечили болезни.
Тем не менее имеются некоторые примеры использования растительных молекул, которые оказываются важными терапевтическими средствами, такие как quinine (cinchona bark) для малярии, atropine (belladonna или смертельно опасные паслёновые растения) для контроля секреции и увеличенной скорости сердцебиений и digitalis (наперстянка) для застойной сердечной недостаточности. Существует значительно больше субстанций, о которых м не знаем или использует недостаточно.
s Michael Sanguinetti. Токсины, выделенные от ядовитых животных всегда играли важную роль в тестировании различных аспектов структуры каналов и помогали понять пропускную способность каналов. Однако я не думаю, что природные токсины будут более важными, чем синтетические лекарства. Потенциальные структурные различия у синтетических соединений превосходят таковые у природных соединений. Кроме того, поиск новых природных соединений медленный, неорганизован и относительно редок. Напротив, комбинаторные химические методы предоставляют возможность систематического поиска среди почти бесконечного ряда соединений, включая и пептиды.
Chris Miller. Природные молекулы становятся всё менее важными в исследованиях ионных каналов. 'Structure/function studies' в области ионных каналов не являются больше способом, когда 'we study function and wish we had a structure'. Натуральные повреждающие каналы токсины от ядовитых улиток, пауков, скорпионов, медуз и dinoflagellates использовались в качестве зондов ('probes') для структуры каналов в физической близи к связывающим сайтам или для электростатического состояния в них. Необходима была большая работа и немного везения, чтобы получить картину с довольно низким разрешением очень локального места в канале. Теперь с приходом прямого определения структуры мы м. видеть (всё еще с большой дозой усилий и везением) глобальную структуру при большом увеличении.
Dennis Dougherty. Молекулы, происходящие из натуральных источников всё ещё более или менее пригодны. Природные продукты, наиболее вероятно токсины, были чрезвычайно ценными инструментами для выделения каналов и для первоначальных исследований, но в наши дни роль их снизилась. Требуются значительные усилия, чтобы охарактеризовать взаимодействия токсин-канал, но я чувствуют, что усилия по разработке лекарств будут лучше применены в исследованиях действительных взаимодействий лекарство-рецептор.
Kenneth Chien. Существует новая технология для patch-clamp массивов и я полагаю, что этот прототип будущего.
Richard Lewis. Высоко-производительный patch clamping м. увеличить биофизические данные, а кристаллография станет более автоматизированной. Однако структуры большинства из 'low-hanging fruit' в области мембранных белков будут скорее всего установлены в ближайшие 5 лет.
Michael Sanguinetti. Высоко-производительные patch-clamp инструменты, став коммерчески доступными д. революционизировать процесс разработки лекарств (Axon Instruments, Molecular Devices, Nanion Technologies). Эти инструменты д.б. способны воспринимать 396-волнового формата пластинки и быть полностью автоматизированными.
Alan North. Имеется множество потенциально пригодных инструментов для обеспечения высоко-производительного, cell-based скрининга ионных каналов. Напр., Axon Instruments, Molecular Devices and Sophion Bioscience разрабатывают именно такие инструменты.
Francisco Bezanilla. Это будет меняться в пользу более изощренной оптической техники, такой как генетически закодированное, cell-type-directed быстрое оптическое зондирование, чтобы отслеживать мембранный потенциал клеточных популяций, объектов экспериментальных манипуляций, и возможность patch clamping массивов из клеток, используя множественные и автоматизированные patch-clamp системы.
David Clapham. Если будут выделены ключевые компоненты ионных каналов в их нативной конфигурации, которые контролируют пропускную способность, то они быстро смогут быть тестированы в отношении нахождения ключевых сайтов связывания с помощью малых молекул и пептидов.
Trevor Smart. Это м.б. стоящим, разделить цели этих методов в отношении скрининга лекарств широкой избирательности, с одной стороны, и для определения механизмов действия лекарст и точного расположения связывающих сайтов в ионном канала, с др. стороны. Первое будет предоставлено самому себе для быстрого скрининга в комбинации с библиотеками лекарств и соединений, если автоматизированные методы для patch-clamp и внутриклеточной электрофизиологии продолжат свою реализацию. Однако для детального выяснения механизмов действия и детерминации сайтов связывания на структурном уровне, вряд ли методы быстрого скрининга окажутся пригодны, т.к. потребности в детальном, трудоёмком, экспериментальном подходе и интерпретации данных редко соответствуют концепции массового скрининга.
Dennis Dougherty. Успехи в высоко-производительной электрофизиологии очень обнадёживают. Они будут важной частью процесса разработки лекарств. Я имею в виду два инструмента. Один это OpusXpress от Axon Instruments. Он делает возможным электрофзиологические исследования ионных каналов, экспрессируемых в ооцитах Xenopus laevis почти автоматически. Мы используем один такой в нашей лаб. около 6 мес. и это привело к ускорению производительности почти в 10 раз. Он всё ещё далек от того, чтобы видеть растворимые белки, но это важное преимущество. Система ооцитов Xenopus не идеальна, но она очень ценна в некоторых ситуациях.
Второй инструмент, это один из тех, что оказывает существенное влияние, это высоко-производительная технология patch clamping (Molecular Devices/Essen Instruments, Axon Instruments). Она м. работать с клетками млекопитающих, которые часто имеют очень большое значение для процесса разработки лекарств, и она более производительна, чем OpusXpress - но пока не более 100,000 соединений в день, но значительно больше функциональных screen с большей скоростью. Эти инструменты уже коммерчески доступны. Я уверен, что фармакоцефтическая индустрия возьмёт на вооружение эти устройства и что они существенно облегчат процесс разработки лекарств в отношении ионных каналов и др. мишеней в ЦНС.
Хотя маловероятно достичь ультра-высокой производительности в связи с познанием структуры, но никогда прежде методы не обещали оценки сфокусированных, тщательно разработанных библиотек с адекватной производительностью. Сегодняшняя деятельность фармакоцефтической индустрии указывает на то, что такие сфокусированные библиотеки являются предпочтительными в процессе разработки лекарств и что эти тенденции конвергируют.
Sarah Lummis. Растут попытки увеличить производительность как биофизической, так и структурной биологии. В биофизике полу или полностью автоматизированные электрофизиологические системы успешно разрабатываются, такие как OpusXpress (Axon Instruments), которые м. независимо пронзать и записывать со многих ооцитов одновременно. В терминах структурных методов исследователи кристаллографии обнадёжены тем, что они смогут анализировать кристаллы, базируясь на , сохраняя тем самым время и энергию на продукции кристаллов белков, чтобы сконцентрироваться на продукции большего их количества. Мультизаписывающие устройства, такие как описанные выше, м. несомненно, способствовать разработке лекарств, но я думаю, они мене критичны для структурных методов, т.к. точное знание о структуре одиночного ионного канала м. дать больше информации о большем числе потенциально активных соединений. Структура AChBP, напр., сегодня позволила создать модель структур связывающих сайтов у nACh50,51, GABAA52 и 5-HT3 рецепторов53 (Рис. 6). Они имеют определенные локализации критических остатков, и начаты эксперименты, чтобы показать, как различные лиганды ассоциируют с отдельными остатками.
Senyon Choe. Я не совсем согласен, что биофизические и структурыне методы являются противоположными высоко-производительным методам. Хотя установление кристаллической структуры м.б. бесконечным процессом, я надеюсь на быстрый прогресс в этой области благодаря успехам высоко-производительных методов. Скрининг большого количества родственных генных фрагментов от родственных организмов будет успешным в критической ступени структурного анализа: продукция и препарирование белков для биофизических исследований. По мне идея сканирования по разнообразным геномным базам данных сама по себе является высоко-производительной стратегией, предназначенной для биофизических и структурных исследований. Более того, высоко-производительная разработка лекарств получит преимущества благодаря знаниям, полученным при анализе межбелковых interfaces и комплексов лекарство-белок, с одной стороны, и из знания геномных баз данных. с др.
7. What, if any, will be the importance of ion channels for bionanotechnology?
Sarah Lummis. Развите patch-clamp технологии позволяет нам изучать характеристики отдельных белковых молекул in vivo. Ионные каналы м. , следовательно, играть большую роль в бионанотехнологии; напр., как сенсоры.
Senyon Choe. Разработка мианютиризированных устройств для детекции молекулярной идентичности, скомбинированной с электрическими и оптическими сигналами, по-видимому, разумный подход к нанотехнологии. Я не знаю как новые технологии будут возникать, но лучшее понимание физических принцыпов проводимости и регуляции ионных каналов м., по-видимому, создать солидную базу, из которой будут генерироваться новые пути engineering основанных на белках биотехнологических продуктов или даже искусственных circuitry, использующих ион-избирательные функции.
Francisco Bezanilla. Комбинация нанотехнологии и функции каналов поможет в будущем понять интегрированную физиологию клетки. Она будет также важна для диагностики; напр., это м.б. достигнуто при использовании автоматизированного patch clamping, скомбинированного с микрожидкостями (microfluidics) и нанодетекционными устройствами, которые м. действовать как сенсоры для специфических молекул. Такие системы м.б. использованы для диагностики на живых клетках из подозреваемой ткани.
Alan North. Каналы обладают потенциалом революционизировать бионантехнологию. Мембранные каналы являются потенциальными sequencing технологиями; напр., α-haemolysin каналы м. определять проникновение индивидуальных оснований нуклеиновой кислоты54, a каналы на чипах являются способом разработки biological-silicon interface для in vivo мульти-электродных записей.
s Dale Benos. Если области ионных каналов, которые действуют как механические или химические 'сенсоры' м.б. идентифицированы и функционально изолированы, то они теоретически м.б. соединены с microcantilevers и\или piezoelectric устройствами, чтобы чувствовать локальные концентрации запахов, загрязнителей или изменения давления в очень ограниченных местах. Напр., используя микроэлектромеханическую систему, внутрь которой внесены домены специфических рецепторов ионных каналов, можно будет связывать или абсорбировать данные молекулы, теоретически они могли бы определяться в небольших жидких или газообразных компартментах, таких как кровеносные сосуды или др. полости тела. Более того, соотв. сконструированные устройства м.б. быть использованы для определения уровней специфических молекул или изменения давления в закрытых средовых компартментах, подобных тем, что имеются в космических (space) капсулах.
David Clapham. Kf,/ используют ионные каналы в попытках высоко-производительного секвенирования ДНК - индивидуальные нуклеотиды м.б. быть дедуцированы по изменениям электрической сопротивляемости, когда они проскальзывают через пору некоторых ионных каналов.
Многие исследователи интересуются использование ионных каналов в качестве биосенсоров для выявления токсинов (напр., neurotoxins) - ионные каналы являются часто мишенями летальных агентов, так что м.было бы помещать их на искусственные платформы в виде непосредственных электронных детекторов связывания токсинов. Ключевая проблема в создании надёжной поддержки для белка, который предназначен природой быть ломким, в 30-A-толщиной липидном слое. Эти проблемы м.б. быть решены с помощью адаптации токсин-связывающих сайтов с более conventional полупроводниковыми элементами, или с помошью определения связывания токсинов с белковым субстратом по изменениям светорассеивания.
Ионные каналы м. также использоваться для создания батарей как в клетках или биосовместимых переключателей.
8. Is there a bifurcation taking place in ion channel research between physiology/pharmacology and structural biology/molecular biophysics? And if so, how does one re-integrate ion channel research?
David Clapham. Нет, для тех, кто читает литературу. Беда только в том, что литаратура обширна.
Alan North. Нет, я не думаю, что имеется такая развилка. Ведущие фигуры в структурных работах (Rod MacKinnon, Thomas Jentsch, Eric Gouaux и Mark Mayer) все имеют солидную основу в функциональных принципах. Если ре-интеграция и необходима, то образовательная. Студенты д. держать в уме функции клеток и тканей, когда тестируют молекулярные структуры.
Jamie Vandenberg. Совсем напротив - я думаю, что существенные успехи, достигнутые в структурной биологии и молекулярной биофизике являются информативными в значительной степени для фармакологических исследований (напр., исследования группы Mike Sanguinetti's и др. по структурным основам лекарствами индуцированного LQTS36). Ключом к дальнейшему прогрессу для физиологов и фармакологов является использование новых структурных методологий и, по крайней мере, понимание того, что они нам сообщают, даже если мы сами не можем активно проводить подобные эксперименты.
Dennis Dougherty. Я не вижу такого расхождения; совсем напротив. Вопрос 4 не является противоречием, структура KvAP показывает, что подобные усилия м.б. успешными55. Неизбежно знание структуры б. отражаться на фармакологии, т.к. только тогда условия для разработки базирующихся на структуре лекарств станут реальными. Эти результаты вместе с высоко-производительными функциональными методиками (см. вопрос 6), смогут революционизировать процесс разработки лекарств для ионных каналов.
Trevor Smart. В некоторых областях, я уверен, существует конвергенция технологий, напр., в области K+-каналов, где структурная биология (рентгеновская кристаллография) начала использоваться, чтобы выяснить пропускную способность некоторых из этих каналов...
John Peters. Не обязательно. Недавнее выяснение структуры AChBP9 даёт хороший пример структурного исследования, которое особенно впечатляюще в фармакологической перспективе. Вновь выявленная структура создаёт основу для интерпретации десятков ранее проведенных исследований с использованием химических модификаций и сайт-направленного мутагенеза аминокислотных остатков внутри N-терминального лиганд-связывающего домена nACh рецептора. Соответствие между структурой и функцией замечательное. Структура породила также серию модельных исследований родственных рецепторов семейства Cys-loop, которые помогут в будущем функциональным исследованиям и созданию family that will help direct future functional investigations and the generation of .
Senyon Choe.Я не уверен, что эти области расходятся на уровне научных вопросов, но я думают, что это происходит в отношении экспериментальных средств и научных терминов, используемых для описания и путей предоставления гипотез. Лишь относительно небольшое число групп переступило через границу, как они этого хотели. Но научные вопросы часто общие: напр., что является молекулярной основной для сборки каналов и как это влияет на их функцию. Я думаю две области неотделимы и что люди в них продолжают глядеть в одном и том же направлении. Они становятся взаимо-зависимыми в своём прогрессе скорее, чем ре-интегрированными. По мне, так это естественная эволюция, т.к. области созревают, появляются подразделы, которые более специализированы.
Michael Sanguinetti. Из-за разных образовательных и исследовательских основ учёных неудивительно, что сохраняется некая щель между традиционными физиологическими/фармакологическими подходами для характеристики функции ионных каналов и более 'современными' подходами, имеющими отношение к структурной биологии и биофизике (эта проблема не уникальна для исследований ионных каналов). Наилучшая интеграция дисциплин будет достигнута удержанием современных тенденций по маргинализации департаментов физиологии и фармакологии в медицинских школах и подавлению стремлений населить эти департаменты молекулярными биологами в ущерб физиологам клеток, органов и организмов.
Sarah Lummis. В последнее время физиологические/фармакологические подходы к исследованиям ионных каналов в моей области в основном отошли на второе место по сравнению со структурной биологией и молекулярной биофизикой. Однако, т.к. оба эти подхода (а особенно первый) создали ряд потенциальных моделей ионных каналов, некоторые из которых объясняют открытые и закрытые состояния, то существенно, чтобы функциональные данные оказались пригодными для понимания полностью функционального значения молекулярных деталей этих структур. Я предвижу возрождение более классических подходов для изучения ионных каналов, таких как проверка эффектов широкого круга различных лигандов в экспериментах на клетках и органах.
Michel Lazdunski. Наиболее важная часть исследований ионных каналов теперь на границе между физиологией и фармакологией.
Francisco Bezanilla. Такое расхождение существует также как существует разделение между biophysics/structural, biology/physiology и pharmacology. Однако имеются точки контактов, в которых фармакология используется для выяснения структурно-функциональных взаимоотношений. Чем больше мы будем выяснять структурно-функциональные взаимоотношения, тем больше будет происходить интеграция с фармакологией.
Irwin Levitan. Я полагают, что такое расхождение существовало некоторое время тому назад (см. вопрос 3). Фактически физиология фармакология ионных каналов играли роль второй скрипки более 10 лет. Ре-интеграция трудна, т.к. очень редко столь разного типа экспертизы проводятся в одной лаборатории. Фармакоцефтическая индустрия д. играть большую роль в достижении ре-интеграции, т.к. большие компании м. собрать междисиплинарные группы, объединяющие исследования всей области исследований ионных каналов.
Birgit Liss. Я согласна с существованием расхождений. Это м.б. естественным ходом развития пост-клональной эры. Мы знаем почти всё о генах для субъединиц каналов. Следующей критической ступенью является понимание, с одной стороны, их разных ролей в предопределении/модулировании физиологических и патологических функций клеток и, с др. стороны, как в точности эти белки функционируют на атомной шкале. Эти две области исследований требуют разных техник и экспертиз.
Kenneth Chien. Я согласен, что имеются подобные расхождения. Ученые медики безусловно заполнят этот пробел в сотрудничестве со structural людьми, подобными Rod Mackinnon, David Clapham и Lily Jan и затем продолжат исследования с такими группами, как наша, которая более интегрирована и ориентирована на болезни. Мы предполагаем увидеть людей, подобных этим, в нашей программе; т.е., M.D.-Ph.D. и кандидаты с комбинированными степенями, работающие в таких лаб. будут затем заканчивать свою клиническую практику и осуществлять свои postdoctoral исследования в нашем институте (Institute of Molecular Medicine, University of California, San Diego, USA).
Chris Miller. Разделение началось декаду тому назад, а теперь разделение полное.
Frances Ashcroft. Это расхождение неизбежно, т.к мало людей способных или желающих охватить все аспекты функции каналов, от атомного до животного, в своих исследованиях. Однако я верю, что ре-интеграция произойдет на базе междисциплинарного сотрудничества и интегральных программ, подобных OXION, недавно запущенной в Oxford University, UK56.
9. How will the sequencing of the human (and other) genomes affect ion channel research?
Michel Lazdunski. Секвенирование человеческого (и др.) геномов оказывает влияние на исследования ионных каналов благодаря открытию новых каналов или новых форм каналов.
Francisco Bezanilla. Оно важно для распознавания семейств каналов и понимания роли законсервированных областей, которые м.б. связаны с функцией.
Birgit Liss. Секвенирование геномов даёт нам списки возможных игроков. Сегодня необходимо найти какие специфические субнаборы в ионных каналах функционально экспрессируются в разных типах клеток и как они взаимодействуют и комплементируют др. с др., чтобы обеспечивать клеточно-специфические физиологические функции.
David Clapham. Существенно влияние на исследования ионных каналов выявление строительных блоков для понимания комплексов ионных каналов и их регуляции и для выявления ранее нераспознанных каналов. Оно позволяет также интегрировать данные от более доступных генетических экспериментов на Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, рыбках данио и т.д.
Irwin Levitan. Во-первых, секвенирование геномов доказывает существование огромного количества K+ каналов у организмов от червя до человека. Это ставит фундаментальный вопрос клеточной физиологии, почему так много каналов, которые отличаются лишь незначительно по своим функциональным свойствам. В-вторых, эволюционная консервация специфических последовательностей в белках ионных каналов проливает свет на на критические функциональные домены. И, наконец, последовательности помогают вести разработку лекарств с помощью идентификации регионов, специфичных для одного или немногих каналов, которые м.б. послужить мишенями для лекарств.
Dennis Dougherty. Наиболее значительное влияние оказало открытие столь многих бактериальных каналов, которые открыли дорогу для структурных исследований. Human Genome Project не мог оказать существенного влияния - сегодняшние знания последовательностей каналов м. помочь немногим. Они являются динамичными молекулами со множественными состояниями и существенно повысить наше знание о взаимо переходах между этими состояниями - следовательно, необходимы функциональные исследования (вопрос 6). Более того, комбинации множественных субъединиц, которые м. варьировать динамически в дополнение к обширным пост-трансляционным модификациям, ограничивают пригодность простой геномной информации.
Sarah Lummis. Секвенирование геномов м. (и уже действует в некоторых случаях) дать важную информацию о новых белках и субъединицах помимо выявления новых регуляторных последовательностей ДНК. В моей непосредственной области, напр., это привело к открытию трёх новых 5-HT3-рецепторных субъединиц благодаря использованию базы данных последовательностей человека и последующего клонирования с помощью (RACE)57.
Alan North. Оно обеспечивает нас полной vocabulary и оказывается информативным для выявления новых семейств взаимоотноешний между каналами. Оно привело к взрыву открытий channelopathies и как следствие к новому пониманию функций каналов. Оно продолжает влиять в области открытия комплексов каналов и всех взаимодействующих белков и особенно в выяснений функций некоторых каналов, которые не вытекают непосредственно из 'hole-down-the-middle' механизма (напр., киназная активность и цитоскелетные взаимодействия).
Alan Verkman. Быстрый геномный скрининг в отношении каналов и аналогов каналов обходит скорость-лимитирующие барьеры на ступени идентификации генов, хотя функциональная характеристика по-прежнему необходима. В практическом плене редко возможно отобрать, не имеея предварительных знаний, имеющие отношение к делу гены, ответственные за специфическую функцию. База данных функциональной геномики остаётся слишком неполной в большинстве случаев, чтобы её м. было эффективно эксплуатировать применительно к информации о последовательностях при идентификации мишеней; однако базы данных межбелковых взаимодействий и белковых функций быстро увеличиваются.
Trevor Smart. Секвенирование генома влияет на исследования ионных каналов благодаря выявлению новых рецепторов или субъединиц каналов, а также соотв. хаперонов или взаимодействующих белков. Возможно также, что такой скрининг позволит установить, что мы открыли все субъединицы для определенного семейства channel/receptor, и тем самым прекратить дальнейшие поиски. Протеомный подход имеет значение для быстрого установления всей сети белков ( и возможно идентификации сигнальных путей), которые взаимодействуют с индивидуальными видами ионных каналов (как показано с помощью протеомного скрининга в отношении N-methyl-D-aspartate (NMDA) рецептора, напр.,58. Для выполнения этой работы с NMDA рецепторами с помощью двугибридного дрожжевого метода потребовались бы годы.
Kenneth Chien. Секвенирование геномов помогло в идентификации новых классов регуляторов каналов и сигнальных комплексов.
Michael Sanguinetti. Наиболее важен поиск белков, которые взаимодействуют с ионными каналами или как акцессорные субъединицы, которые затрагивают пропускную способность каналов, или как поддержки, которые соединяют каналы с др. регуляторными белками, такими как киназы.
Chris Miller. Вообще-то это лучше не обсуждать. Большинство последних публичных предсказаний относительно значения геномного секвенирования оказались несостоятельными в частности в отношении непосредственного скачка в понимании болезненных состояний, а некоторые действительно поражающие следствия геномики не были предсказаны вовсе, такие как существование в геномах прокариот гомологичных нейробиологических семейств ионных каналов.
10. How might microarrays and proteomics contribute to research on ion channel diseases and/or to basic research on channel function at the single-cell level?
Michel Lazdunski. Они определенно составляют существенную часть набора инструментов для исследований ионных каналов; они становятся рутинными.
Sarah Lummis. Микромассивы и протеомика уже вносят вклад в исследования болезней ионных каналов и это будет расширяться на одноклеточном уровне, на котором присутствие определенного гена или генного продукта м. иметь существенное значение.
Francisco Bezanilla. Протеомика и микромассивы б. играть основную роль в понимании значения ионных каналов в клеточном гомеостазе. Имеются многочисленные примеры того, как популяция ионных каналов меняется в здоровых и больных клетках в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол или беременность.
Dennis Dougherty. Информация о пространственном и временном распределении специфических ионных каналов и специфических типов субъединиц неоценима для разработки терапевтических подходов. Ключом в разработке лекарств к ионным каналам является специфичность субтипов, а протеомные стратегии способны выяснить, какие субтипы являются коректными мишенями.
Alan North. Каналы экспрессируются на разных уровнях во время истории жизни клетки и во время болезни. Они выполняют разные функциональные роли в зависимости от клеточного цикла, клеточных соединений и клеточного развития. Микромассивы м.б. использованы для тестирования этого. Кроме того каналы критически затрагиваются interactors, a протеомика м. это установить.
Kenneth Chien. Зависимые от состояния изменения функции каналов - т.е., ковалентные модификации или регуляция с помощью динамических сигнальных комплексов - будут ключом в понимании болезней возбудимости в будущем. Эта область помимо катологизации мутаций самих ионных каналов окажется более интегрированной в основной поток передач клеточных сигналов , особенно для каналов, связанных с приобретенными формами болезней, таких как сердечная недостаточность или внезапная гибель от летальных аритмий, фибрилляции предсердий и т.д.(см. вопрос 1 и ссылку 12).
David Clapham. Microarrays и протеомные подходы будут использоваться, т.к. ошибки и шумы в этой системе редуцированы. Они сегодня обеспечивают корреляции, которые дают идеи о регуляторных путях, которые затрагивают ионные каналы и модуляторы транскрипции трансляции и таргетинга ионных каналов
Richard Lewis. Болезни, такие как боль сложны, с участием усиления и подавления активности широкого круга мембранных белков, включая иные каналы59,60. Эти up- и downregulation варьируют при разных состояниях моделируемой боли in vivo, добавляя дальнейшие уровни сложности в нашем понимании боли. Микромассивы и протеомика способны адресовать эту сложность прямым путём туда, где больше вопросов, чем ответов. Биопсии (которые проблематичны для нераковых нервных биопсий), чтобы посмотреть целенаправленно регуляцию при заболеваниях у людей, используют массивы генов и позволяют оценивать терапевтические мишени до клинических испытаний для агентов с новой фармакологией.
Birgit Liss. Профили генной экспрессии особенно строгие в комбинации с patch-clamp техникой, в качестве комбинированного подхода позволяют выявляют функциональные различия индивидуальных клеток, которые м.б. скоррелированы и сравнены с их специфическими профилями экспрессии генов ионных каналов. Предварительным условием для такого microarray подхода является объективная амплификациям РНК или кДНК одиночной клетки, чтобы получить достаточно материала для гибридизации массива (см. вопрос 2). Применение техники laser-microdissection к одиночным клеткам из (post-mortem) материала доступно, но без информации о клеточной функции и возбудимости.
Trevor Smart. Использование микромассивов и протеомики без сомнения поможет нашему пониманию ионных каналов путём получения дальнейших доказательств того, как эти рецепторы и каналы существуют в клеточных мембранах, которые вряд ли являются изолированными единицами, свободно плавающими в мембране. Одним из достигнутых успехов в нашем понимании будет то, как каналы закреплены в точных местоположениях (напр., в синапсах) в мембране и как они физически и функционально связаны с путями передачи сигналов. Это м.б. достигнуто с помощью
динамического связывания различных белков из платформ (rafts) с межклеточными поверхностями каналов, таких как протеин киназы, которые фосфорилируют белки. Очевидно, что каналы динамически закреплены с помощью белковой сети внутри клеток, которая обеспечивает поддержку и поставку и способна модулировать функцию. Она м. представлять собой целую серию новых терапевтических мишеней (целенаправленная доставка лекарства внутри клетки, но это совсем др. вопрос!).
Возникает вопрос, что же представляют собой эти мишени. Сегодня нет полного понимания поддерживающих белков и их роли, что мешает точной идентификации; однако вряд ли новые лекарства будут нацелены на молекулы, которые выполняют широко распространённую роль во многих сигнальных путях, каких как 'generic protein-kinase blockers', напр. Значительная степень избирательности м.б. быть достигнута путём идентификации мест, где рецепторы/каналы действительно связывают эти белки и затем путём проверки влияния на эти процессы соотв. лигандов. Напр., для рецепторов с 4 transmembrane (TM) доменами, такими как GABAA рецепторы, необходимо нацеливать лекарства на внутриклеточные домены между TM3 и TM4 (61). Итак, протеомные подходы м. помочь узнать, какие куски необходимы для завершения 'intracellular protein jigsaw', которые связаны с ионными каналами. Затем нужно будет понять их функциональную роль и где в точности эти белки связываются с ионными каналами.
Dennis Dougherty. Незнание структуры, незнание производительности, (см. вопрос 1 и 6) и плохое понимание функции ионных каналов, даже если мы знаем структуру.
Michel Lazdunski. Сходство областей пор, по крайней мере, в области K+ каналов. Нужно помнить, что есть анлаы, которые не имеют фармакологии совсем.
Irwin Levitan. Основным перпятствием является ненормальное количество близко родственных каналов и трудность в идентификации специфических молекулярных мишеней - лекарство, которое нацелено на пору одного из K+ каналов, напр., вряд ли будет затрагивать многие др. Сходной проблемой является возможность перекрывания функций, так что даже когда определенный канал будет специфически выведен из строя, др. близко родственный, м. заполнить брешь.
Dale Benos. Я думают, что самым большим препятствием в достижении ионным каналом лиганд-специфичности является большая перекрываемость структурных доменов у разных ионных каналов; отсутствие знаний по третичной и четвертичной структуры ионных каналов на атомном уровне; отсутствие информации, связанной с белками, действительно представляющими ионные каналы в разных тканях. В зависимости от молекулярных механизмов действия лигандов специфичность м.б. в значительной степени определяться самой тканью, а не только гетерогенностью ионных каналов, а также возможной тканевой уникальностью в отношении цитоплазматических сигнальных комплексов.
Richard Lewis. Многие терапевтические классы модуляторов ионных каналов, включая локальные анестетики, нацелены на находящиеся в мембране гидрофолдные домены ионных каналов, которые обычно структурно наиболее законсервированы в нутри калсса ионных каналов62. Т.к. основная библиотека фрмациефтических лекарств представлена довольно гидрофобными молекулами, то большинство идентифицированных 'хитов' скорее всего нацелено на эти гидрофобные домены. Доступ к разнообразной и новой химии, обеспечиваемый библиотеками натуральных продуктов создаст возможности широкой идентификации классов взаимодействий. Напр., ядовитые пептиды, которые нацелены на ионные каналы обычно действуют на структурно законсервированные элементы, которые обнаруживаются в петлях, которые выступают из мембраны наружу клетки, такие как μ-conotoxins, которые нацелены на внеклеточные поры чувствительных к напряжению Na+ каналов63.
Jamie Vandenberg. Проблема со множеством лигандов ионных каналов. Они соединяются с мотивами, которые общи многим ионным каналам, чаще всего областям пор. Пока мы знаем недостаточно о структурных различиях между субтипами ионных каналов, чтобы быть способными предложить 'rational' стратегию разработки лекарств. Даже если мы это делаем, я не убежден , что таргетинг индивидуальных ионных каналов обязательно правильный путь. В кардиальной области. по крайней мере, наиболее упешными лекарствами не являются специфические блокаторы ионных каналов, а лекарства, которые модулируют пути передачи сигналов, которые регулируют интегрированные реакции ионных каналов, такие как beta-блокаторы. Даже amiodarone (Cordarone; Wyeth Pharmaceuticals), по общему мнению неспецифический блокатор ионных каналов, м. осуществлять некоторые из своих эффектов модулируя передачу сигналов тироидного гормона64.
Michael Sanguinetti. Самым большим препятствием является открытие агентов, которые специфически затрагивают близко родственные каналы. Напр., связывающий сайт для лекарства, блокирующего пору, обычно расположен на S6 трансмембранном домене ионных каналов36,65. Последовательность этого домена почти идентична для членов Kv1-Kv4 каналов, это делает затруднительной избирательность (Рис. 7).
Alan North. Барьером к достижению специфичности является тот факт, что определенные субъединицы используются очень широко при формировании каналов и в тканях с разными функциями. Примером м. служить неожиданная находка α7 nACh рецепторов в макрофагах66; кто это м. предполагать? Наиболее критической ступенью является молекулярная идентификация канала в интересующих клетках, в желаемых условиях (напр., при старении, боли или воспалении). Такая идентификация с высоко-производительным скринингом м. привести к специфичности.
Sarah Lummis. Ligand-gated ионные каналы имеют довольно небольшие связывающие карманы, а их специфичность ко многим лигандам, особенно к малым, определяется числом аминокислотных остатков, присутствующих в этом кармане. Однако это ограниченное количество аминокислот также является одним из барьеров к достижению специфичности, особенно у родственных рецепторов, у которых критические аминокислоты м.б. законсервированы. Напр., tryptophan (Trp)149 у nACh рецепторе и эквивалентный Trp183 остаток в 5-HT3 рецепторе важны как лиганд-связывающие остатки и обнаруживают сходное взаимодействие с нейротрансмиттерами (в этом случае формируется cation-π взаимодействие с заряженной группой67,68). Становится ясно, что в этом классе рецепторов все сайты связывания сконструированы прежде всего из ароматического box69, это позволяет нейротрансмиттерам связываться обратимо. Ограниченный репертуар из ароматических аминокислот, который доступен для создания этого box и обусловливает отсутствие специфичности для ряда связывающих лигандов, особенно для малых.
David Clapham. Главным препятствием является отсутствие высоко-производительных методов. которые бы обеспечили то же самое качество информации, что и patch clamp. Это м.было бы решить за несколько лет , учитывая современные коммерческие попытки нескольких компаний, включая Aviva Bioscience, Axon Instruments, Molecular Devices, Nanion Technologies and Sophion Bioscience. Вторым препятствием является необходимость в структурной информации более высокого разрешения для множественных состояний пропускной способности каналов. Третьим барьером является ограниченность библиотек соединений, которая, я надеюсь, частично с помощью комбинационной химии. Четвертым препятствием является отсутствие механизмов доставки пептидов и белков и наше плохое знание того, как осуществляется поддержка для малых молекул.
Trevor Smart. Специфичность м.б. интерпретирована на двух уровнях: специфичность между совершенно различными популяциями каналов, такими как K+ и Na+ каналы, и специфичность для индивидуальных изформ каналов внутри популяции (напр., чувствительные к напряжению K+ каналы Kv1.1 и Kv2.1). Одним из основных препятствий достижения специфичности является наше ограниченное знание основ receptor/channel гетерогенности внутри популяций из одних и тех же каналов. напр., где каналы располагаются и каковы их отличительные физиологические функции? Возможно, что гетерогенность физиологически важна или напротив она выглядит как шум 'Darwinian evolutionary noise' при производстве каналов и сто подобная вариабельность в структуре не имееет значения. Доказательства подтверждают первое более правильно (70), это создает дополнительный стимул для разработки subtype-selective лигандов ионных каналов.
Побочные эффекты действия лекарств являются вредными, их не следуепт путать с нежелательными эффектами; напр., большинство действий benzodiazepines используется в клинике, но необязательно, что все они провоцируются одним лекарством при разных дозах, используемых при одном, специфическом заболевании.
Когда мы установим, где разные рецепторы и каналы локализуются в клетках и поймём их разные функции, тогда разработка subtype-selective лекарст получит рациональную основу. Используя трансгенную технологию и внося незначительные мутационные изменения в рецепторы (knock-in техника), которые позволят животным оставаться неповрежденными помимо их реакции на определенные лекарства, м.б. исследовать естественную роль разных изоформ рецепторов и каналов. Напр., benzodiazepines модулируют функцию многих разнообразных изоформ GABAA-рецепторов и продуцируют ряд клинических эффектов в пределах от sedation, amnesia, anxiolysis и myorelaxation до противосудорожных эффектов. Но для ясности отметим, что anxiolytic свойства benzodiazepines обеспечиваются в основном посредством α2-subunit-содержащих GABAA рецепторов, тогда как α1-субединичные рецепторы обусловливают седативные эффекты71. Это разделение эффектов benzodiazepine между разными изоформами рецепторов свидетельствуют о разных ролях рецепторов в головном мозге и в будущем необходимо будет синтезировать лекарства специфически модулирующие только избирательные изоформы рецепторов.
Др. крупной областью, которая становится всё более важной, является связь между генетическим у индивидуального пациента и его реакцией на определенные лекарства. Область фармакогенетики м. оказать существенное влияние на будущее уменьшение побочных эффектов и на целенаправленную лекарственную терапию72.
12. Could there be an approach to ion channel pharmacology based around monoclonal antibodies or other biologicals, rather than small molecules?
Richard Lewis. Да, но выяснение in vivo функции без побочных эффектов м.б. затруднительным.
David Clapham. Да, и некоторые используют этот подход с антителами или фрагментами Fab. Проблема здесь в потенциальной иммуногенности и протеолизе.
Kenneth Chien. Это м. срабатывать, если имеется чёткая, специфическая связь между рецептором и активацией данного канала, который задействован в болезни; напр., muscarinic acetylcholine receptor, adenosine receptor и т.д. . Я уверен в усилении роли многих, новых, орфановых G-protein-coupled рецепторов в сердце и выяснении их роли в контроле функции каналов; RNAi нокаутные мыши м. оказаться информативными в этом отношении.
Michel Lazdunski. Да. Обоснованность использования антител продемонстрирована в моей лаб. с открытия моноклональных антител, которые м. работать теперь подобно токсинам скорпионов; т.е. путём изменения кинетики пропускной способности Nav каналов73.
Sarah Lummis. Моноклональные антитела и др. биол. продукты, такие как токсины распознаются с высокой избирательностью определенными ионными каналами. Их относительно большие размеры гарантируют, что они обладают потенциалом соединяться со многими различными областями ионных каналов и тем самым м.б. высоко специфичными. Однако это само по себе создаёт проблемы, такие что молекулы м. также очевидно соединяться специфически с совершенно разными областями белка. Следовательно, хотя использование этих молекул м. иметь преимущества, их использование д.б. в комбинации с др. подходами.
Irwin Levitan. В принципе, это идеальный путь достижения специфичности. Я полагаю, что плохо используемыми мишенями являются взаимодействие доменов между субединицами, образующими пору ионного канала, и его auxiliary субъединицами или др. ассоциированными белками, поэтому или антитела или пептидные последовательности, которые влияют на ассоциацию этих доменов, м. служить мощным фармакологическим инструментом. Проблема конечно же в доставке таких больших молекулярных реагентов к местам взаимодействия внутри клетки.
Alan North. Преимущества моноклональных антител в том, что ионные каналы, экспрессируются на поверхности клетки и , следовательно, доступны антителам, полученным против эктодоменов. Однако всё еще остаётся проблема доставки. Но в принципе это м. работать как в случае tumour-necrosis factor (TNF)-α рецепторов. Напр., infliximab (Remicade; Centocor) являются химерными анти-TNF-α моноклональными антителами с мощным анти-воспалительным эффектом, который возможно базируется на апоптозе воспалительных клеток. Многочисленные испытания продемонстрировали их эффективность и при ревматоидном артрите и болезни Crohn's74.
Walter Stuhmer. Определенно, учитывая высокую специфичность моноклональных антител и значительную вариабельность ионных каналов внутри каждого семейства (особенно K+ каналов). Потенцальным недостатком этого подхода м.б. генерация иммунного ответа на внешние антитела. Однако использование гуманизированных или человеческих антител, по-видимому, сможет уменьшить этот побочный эффект до минимума как в случае trastuzumab (Herceptin; Genentech), humanized моноклональные антитела, направленные против HER2, который является рецептором epidermal growth factor (EGF) и который избыточно экспрессируется при некоторых типах обухолей75,76. Многие подобные антитела прошли клинические испытания и channelopathies являются идеальными кандидатами для такого типа подходов, учитывая внеклеточные эпитопы ионных каналов.
John Peters. Этот вопрос скорее касается терапии ионных каналов, чем их фармакологии, т.к. моноклональные антитела являются основным инструментом локализации специфических субтипов ионных каналов. Хотя безусловно моноклональные антитела м. использоваться как терапевтические агенты, направленные против ионных каналов. Моноклональные антитела обладают высокой избирательностью, поэтому усиливается их использование в качестве терапевтических агентов для лечения рака, воспалительных, сердечно-сосудистых, респираторных и др. заболеваний, хотя в основном для госпитального применения. Недавно описаны кристаллиновые моноклоанальные антитела для подкожного применения, это открывает возможность более удобного их использования77. Вообще-то более многообещающими являются пептидные молекулы, базирующиеся на структуре натурально возникших токсинов (таких как α-conotoxins; упомянутых в вопросе 5).
Jamie Vandenberg. Учитывая, что развиваемые специфические блокаторы ионных каналов м. оказаться не оптимальными, по крайней мере в отношении таргетинга кардиальных аритмий, использование биол. веществ, которые ингибируют ионные каналы со значительной специфичностью, безусловно окажется стоящим. Однако я полагаю плохой идею, согласно которой лиганды, которые м. специфически находить мишени (с высоким сродством) определенных ионных каналов, которые преимущественно экспрессируются в данной ткани, и м. б. использованы для переноса лекарств в эту определённую ткань. Согласно этому сценарию antibody/biological (или полимеры, использующие мотивы, базирующиеся на biologicals с высокой избирательностью к интересующим ионным каналам) не б. блокировать ионные каналы, а будут использовать каналы в качестве наводящих устройств, обеспечивающих ткане-специфическую доставку их груз лекарств. В этом случае лекарства будут переноситься в ткань мишень не обязательно с целью модулирования электрической активности, а будут, напр., химиотерапевтическими агентами.
Trevor Smart. Теоретически это м.б. высоко избирательным подходом для нахождения специфических ионных каналов, но выбор эпитопов будет критическим и даже более того не будет гарантом функционального исхода после присоединения антител. Известно, что антитела влияют на ионные каналы, особенно ionotropic glutamate receptors (у которых некоторые аутоантитела к GluR3 рецепторам ассоциируют с синдромом Rasmussen's encephalitis78,79 и мышечные nACh рецепторы, которые м. вызывать многочисленные дефекты трансмиссии80,81. Однако имеются и многочисленные примеры, при которых антитела не оказывают влияния на функцию ионных каналов. В принципе использование антител обеспечивает значительную избирательность в нахождении рецепторов, но они м. вызывать и проблемы благодаря их размерам, которые м. заставлять их интернализовать рецепторы внутрь клетки. Они м. также препятствовать или взаимодействовать с мембранным trafficking и м. оказаться не идеальными, легко обратимыми лигандами. Более того, их структура представляет существенные трудности, если рассматривать вопрос доставки лекарств в специфические органы и системы тела, ЦНС является наглядным примером. Напр., оральный приём неэффективен несмотря на все ухищрения. Скорее всего селективные пептиды для определенных сайтов связывания окажутся более пригодными для терапевтических целей, чем антитела; однако антитела найдут клиническое применение для лечения ревматоидного артрита и б-ни Crohn's (напр., etanercept (Enbrel; Amgen/Wyeth) и infliximab), a также для лечения некоторых раков, таких как рак груди, опухоли простаты (напр., pertuzumab (Omnitarg; Genentech) и trastuzumab), но не для targeting ионных каналов.
13. What are the main hurdles that will need to be overcome to creating further successful therapeutic approaches based around the modulation of electrical activity?
Trevor Smart. Самой большой трудностью является разработка subtype-избирательных агентов. Способность модулировать часть популяции ионных каналов д.б. лишена побочных и нежелательных эффектов. Необходимо также лучше понимать физиологические последствия для белков каналов от присоединения лекарств. Необходимо понять, что каналы и рецепторы являются довольно динамическими системами.
Michel Lazdunski. Проблемы вызываемые слишком сильной sedation или слишком высокой активностью, дают в результате activity, resulting in в сердце или эпилепсию в ЦНС соотв.
Alan North. В отношении модуляции электрической активности, эффекты на кардиальную функцию (напр., LQTS screening) и лёгкие эффекты на функцию головного мозга возможны в случае преодоления барьеров. Но функция каналов осуществляется с помощью их химических сигналов, а также их электрических сигналов, и это наименьшая из проблем по отношению к сердцу и головному мозгу.
Sarah Lummis. Одной из главных проблем является отсутствие специфичности лигандов (см. вопрос 11). Существует также проблема потенции; т.е., лиганд м. полностью блокировать или гиперактивировать канал, тогда как более благоприятный подход будет вызвать легкие модуляции. Т.о.. соединения, которые модулируют активность каналов, такие как benzodiazepines для GABAA рецепторов, м. в принципе оказаться более пригодными для терапии.
Birgit Liss. Необходимо найти больше специфических лекарств, которые будут избирательно модулировать активность каналов в определенной популяции клеток.
David Clapham. Необходимо более детальное понимание лежащей в основе физиологии, в частности в нервной системе. Для сердечных antiarrhythmic лекарств основной проблемой является потенциальная токсичность, такая как ненамеренная продукция LQTS в субпопуляциях чувствительных пациентов или продукция LQTS комбинацией лекарств. Большой проблемой является подавление или адаптация ионных каналов или рецепторов после продолжительного приёма лекарств.
Jamie Vandenberg. Необходимо лучше понимать интегрированную реакцию клеточной электрической активности на средовые стрессы, включая и то, как ионные каналы, метаболические пути и сигнальные пути взаимодействуют др. с др. в разных временных шкалах; т.е., остро (от секунд до минут) хронически (от часов до дней). В последнем случае временная шкала оказывается более сложной, т.к. паттерн транскрипции буде обязательно затронут. Необходимо также лучше понимать долговременные эффекты модуляций ионных каналов по сравнению с острыми эффектами. Это довольно трудная проблема, т.к. требует времени и денег - , следовательно, необходимы хорошие модельные организмы.
Kenneth Chien. Я думаю надо начать думать на целенаправленными модуляторами каналов и сигнальными путями, контролирующими каналы скоре, чем над целенаправленной модуляцией самих каналов. В сердце лекарства, которые нацелены непосредственно на оккупацию каналов, ассоциируют с повышенной смертностью. Очевидно, что уровень активности каналов тщательно контролируется в сердце и что основные эффекты в любом направлении (активирование или ингибирование) м. давать фенотипы, сходные с arrhythmogenesis. Т.о., модулирующие подходы - т.е., легкое ингибирование активности каналов с помощью разработанных ингибиторов естественно возникших позитивных ко-регуляторов каналов, или инициация изменений в вышестоящих сигнальных путях, которые регулируют ко-регуляторы - м.б. лучше, т.к. не будет вызывать полное закрытие или открытие интересующих каналов. Необходимо предусматривать эффекты на пропускную способность, активацию, трафик или инактивацию, в зависимости от роли модуляторов скорее, чем разрабатывать малые молекулы, которые непосредственно связываются с белками самих каналов и оказывают избирательный эффект непосредственно на один из аспектов функции каналов.
Walter Stuhmer. Я вижу проблему в том, что в большинстве своём мы имеем дело с кратковременными эффектами и взаимодействиями с ионными каналами. Это указывает на то, что в большинстве случаев имеющие отношение к болезням долговременные эффекты, неизвестны. Это снижает доверие лекарственных кампаний к ионным каналам, как потенциальным мишеням, т.к. они не видят механизмов, связывающих каналы с соотв. болезнями. Напр., связь между раком и ионными каналами. Cl- и K+ каналы давно связывают с раком, а механизм действия в основном сводится к регуляции клеточного цикла82. Ионные каналы , следовательно, довольно косвенно связаны с прогрессированием опухолей. Однако растут доказательства причинной связи клеточной пролиферации с определенными типами ионных каналов, таких как Kv1.3, HERG и ether-a-go-go (EAG)83. EAG м. рассматриваться как онкогены, т.к. их эктопическая экспрессия способствует неконтролируемой клеточной пролиферации considered an oncogene, as its ectopic expression promotes uncontrolled cell proliferation84. Однако механизм или сигнальный каскад этого совершенно неизвестен.
Kenneth Chien. Болезни возбудимых клеток, особенно те, которые иннервируются. Однако, я думаю, что функция каналов жизненно важна и при мнодих др. болезнях у человека. Функции, такие как наведение, миграция и контракция как мышечные, так и немышечных клеток, скорее всего будут выявляться. Роль каналов в воспалительных путях также интересна.
Sarah Lummis. Разнообразные болезни сегодня строго связаны с нарушением функции ионных каналов. Примеры в области ligand-gated ионных каналов включают ADNFLE (см. вопрос 3) и наследуемая миоклония Poll Hereford cattle85,86.
Alan North. Во-первых, channelopathies непосредственно связаны с функцией ионных каналов, а , следовательно, известно уже несколько сотен таких27. М. ожидать, что их количество будет расти, по мере установления функциональной роли др. больших семейств ионных каналов (напр., transient receptor potential (TRP) каналы, ClC и P2X). Во-вторых, имеется много болезней, которые уже успешно лечатся лекарствами, действующими на ионные каналы; напр., antiarrhythmics, anaesthesia, epilepsy и essential hypertension. В-третьих, имеется множество болезней, ионные каналы при которых активно исследутся как потенциальные мишени; список слишком большой, но он включает воспаление (с участием TRPM2 канала и ATP рецепторов P2X7), нейропатические боли (acid-sensitive ионные каналы, TRPs и P2X3), остеопороз, опухоли головного мозга и др.
Michel Lazdunski. Болезни, которые строго сцеплены с аберрантными ионными каналами включают кардиальные arrhythmias; epilepsy; боезнь Parkinson's; гипертензию, включая лёгочную гипертензию; гипотензию; type 2 диабет; incontinence; claudication; болезни сетчатки; мышечные болезни; респираторные болезни; ощущения боли; психиатрические заболевания, включая депрессию; и некоторые формы рака.
Dale Benos. Имеется ряд заболеваний, которые непосредственно связаны с нарушением функции ионных каналов. Некоторые из них генетически обусловлены, такие как синдром Liddle's , болезнь поликистоза почек, многие миотонии, включая и конечно прототипическое генетическое заболевание ионных каналов кистозный фиброз. Болезни, непосредственно связанные с ионными каналами, м. также б. результатом не мутаций генов, кодирующих собственно сами ионные каналы, а результатом дисфункции регуляторных путей, контролирующих активность ионных каналов. Гипертензия в результате медулярных опухолей надпочечников, которые избыточно продуцируют aldosterone является одним из таких примеров. Др. пример, это аутоиммунные заболевания, такие как . Очевидно, из-за того, что ионные каналы повсеместны и обеспечивают множество разнообразных функций, отклонения от 'нормального' поведения м. иметь драматические физиологические последствия.
Frances Ashcroft. Многие болезни, связанные с аберрантнрой функцией ионных каналов, обусловлены или мутациями генов самих ионных каналов иди мутациями белков, участвующих в экспрессии ионных каналов (таких как транскрипционные факторы), мембранном targeting или регуляции активности каналов. Напр., существуют доказательства, что дефектная секреция инсулина, обнаруживаемая при моногенных формах диабета, возникает из-за неправильной активности KATP каналов в панкреатических β-клеток, в результате мутаций в метаболических генах и транскрипционных факторах. Возможно, что многие поведенческие болезни обусловлены аберрантной электрической активностью головного мозга, а значит нарушенной активностью ионных каналов.
John Peters. Существуют хозяйские channelopathies, в которых аберрантная функция ионных каналов, по-видимому, обусловливает болезненность. Селективные к анионом ионные каналы дают несколько примеров. Мало сомнений относительно мутаций в гене CFTR и муковисцидоза, но детали действия их до сих пор не изучены в деталях. Многие точковые мутации в strychnine-sensitive glycine рецепторе вызывают hyperekplexia (болезнь испуга и неонатальная гипертония). Мутации в ClC1 Cl- каналах вызывают myotonia congenita, которая м.б. или аутосомно доминантной (Thomsen's disease) или рецессивной (). Bartter's синдром (классический () и ) ассоциируют с мутациями ClC-Kb Cl- канала, a мутации barttin (ClC channel 'accessory protein') вызывает синдром Bartter's . Мутации в гене ClC7 ассоциируют с некоторыми формами остеопороза у людей.
David Clapham. Большинство из приведенных одинаково хорошо связаны: arrhythmias, обусловленные продолжительным плато потенциала действия сердца, такие как LQTS (NaV и KV каналы); гипертензия (особенно почечтная гипертензия, Liddle's синдром и Bartter's синдром); polycystic kidney disease (PKD1 и PKD2); мужская стерильность (PKDL, CATSPER2); cystic fibrosis (CFTR); мышеная слабость; периодические параличи и миотония (NaV и CaV каналы); атаксия; аутоиммунные channelopathies, такие как (CaV каналы); myasthenia gravis (nACh рецептор); персистирующая hyperinsulinaemic hypoglycaemia детей (SUR, KIR6); злокачественная гипертермия (ryanodine рецептор); б-нь Dent's; Charcot-Marie-Tooth нейропатия; б-нь Thomsen's (ClC1 chloride channel); diabetes insipidus (AQ1); и глаукома (aquaporin). Менее изучены, но возможно: внутриклеточные б-ни лизосомного накопления (mucolipidosis; MCOLN); от разных причин глухота и слепота; и диабетические нейропатии. Имеющиеся данные указывают на то, что все они более тесно связаны с ионными каналами, чем, скажем, б-нь Alzheimer's или рак. Следующая волна ионных каналов, связанных с болезнями, будет из TRP каналов; они открыты лишь недавно.
Trevor Smart. Имеется много болезней, обнаруживающих только предварительную связь и нуждающихся в подтверждении; однако б-ни с относительно хорошей и чёткой связью с дисфункцией ионных каналов включают myasthenia gravis с рецепторами nACh; синдром Lambert-Eaton syndrome с пресинаптическими кальциевыми каналами; некоторые формы hyperekplexia с glycine рецепторами (α1-субъединица, напр.); Bartter's синдром с inward-rectifier potassium channels (Kir1.1), chloride channels (ClC-Kb) и Na+/K+/Cl- co-transporter; а также LQTS с натриевыми и калиевыми каналами (KCNQ1). Вовлечение ионных каналов в болезнь не обязательно означает только мутации белков каналов или их выведение из строя с помощью аутоантител, но и также затрагивающие аберрантную поставку этих белков к поверхности мембраны.
15. What are the pitfalls and advantages of animal models that seek to recapitulate the human channelopathies?
Sarah Lummis. Животные модели никогда полностью не воспроизводят проблемы каналопатий у людей, но Animal models will never completely recapitulate the problems of human channelopathies, но есели их оценить по достоинству, то они безусловно очень пригодны для тестирования различных лекарств.
Michel Lazdunski. Имеются только преимущества, если вы достаточно разумны не ожидать слишком многого от этих моделей. В ближайшем будущем мы возможно увидим типы нокаутов не у мышей, которые м. оказаться более информативными (прежде всего нокаутные крысы).
Alan North. Большинство человеческих channelopathies не являются мишенями для терапии. Учитывая уроки муковисцидоза, для которого животные модели (Cftr-нулевые/мутантные мыши) не смогли помочь в понимании лёгочных проявлений этой болезни87.
Jamie Vandenberg. Всегда будут существовать различия между модельными организмами и людьми и любые данные, полученные на модельных организмах, если это возможно, должны проверяться на людях. Самым значительным преимуществом использования модельных организмов является способность изучать влияние модификаторов в деталях, практически на генетическом уровне.
Irwin Levitan. Польза от них, конечно. огромная. Использование генетически легко поддающихся влиянию организмов, таких как черви, мухи и мыши, позволяет быстро тестировать потенциальные терапевтические средства в отношении эффективности и токсичности. Главным неудобством является то, что результаты от таких моделей не всегда экстраполируются на людей (см. вопрос 18), по ещё неясным причинам.
Birgit Liss. С нокаутными/трансгенными мышами всегда имеется возможность функциональной компенсации - напр., с помощью родственных каналов - или неспецифических эффектов, обусловленных генетическими модификациями. Однако животные модели каналопатий представляют собой ценный инструмент для изучения молекулярных механизмов родственных болезней. Я уверена, что общая физиологическая концепция будет сходной и у мышей и у людей.
Frances Ashcroft. Животные модели м. пролить свет на физиологические функции данного ионного канала в целом организме или органе (если используется ткане-специфическая экспрессия). С их помощью часто идентифицируется новая и важная информация о ионных каналах и их роли в болезнях. Однако, очевидно люди не мыши (тем более не черви) и животные модели не обязательно смогут рекапитулировать фенотипы болезней человека. Безусловно имеется только один золотой стандрт - человеческое существо.
David Clapham. Выгоды ясны - они наиболее пригодны для экспериментов, чем люди. Сегодня практически не имеется замены тестам на животных. Конечно, в зависимости от видов будут существовать существенные различия между людьми и животными. Компенсаторные механизмы являются часто различными у разных животных. основным препятствием является то, что методы, особенно изучения функций высшего порядка, таких как память, ограничены у животных и предполагается, что они м.б. некорректными.
Kenneth Chien. Электрофизиология мышей, является предпочтительной системой для генетических моделей болезней человека, однако она совершенно отлична у людей, так что в этом имеется наследственное расхождение. Существуют нужда в др. системах; Я думаю, что мы увидим появление альтернативных моделей, таки как использование из сердца и головного мозга, которые м. открыть дверь для прямых исследований собственно человеческих клеток - это было бы идеальным. Понимание, почему некоторые пациенты, имеющие мутации LQT, не обнаруживают фенотипа внезапной смерти, было бы очень информативным, особенно если бы это отражало, как мутации влияют на потенциал действия лёгким способом.
Richard Lewis. Животные модели являются прямым и относительно недорогим способом определения, являются ли соединения, обладающие интересующими in vitro активностями, эффективны и in vivo и имеют ли нежелательные или побочные эффекты. Для проверок фармакологических классов в отношении терапевтических свойств у людей, модели являются прекрасным средством выявления сходной эффективности у людей. Для соединений с известными химическими классами, вопрос о побочных явлениях м.б. легко предсказан. Однако с развитием новой фармакологии и химии риски будут выше. Животные модели вряд ли смогут предсказывать, если физиологическая/патофизиологическая роль специфических мишеней в больных тканях будет отклоняться существенно по сравнению с нормальными тканями, как это в принципе существует в отношении neurokinin-1 (NK1) рецептора, для которого антагонисты, используемые у грызунов, не действуют на состояние болей у людей, как это было показано клинически (88).
Alan Verkman. Потенциальным неудобством исследований на трансгенных мышах является то, что они м. дать фальшивую фенотипическую информацию вслествие компенсаторных изменений в др. транспортёрах (таких как замещение делетированног/мутантного белка) или онтогенетических изменений. Др. минусом животных моделей являются различия между биологией человека и животных. Напр., cystic fibrosis (Cftr-null/mutant) мыши имеют незначительные легочные проявления болезни из-за различий с анатомии подслизистых желез воздушных путей и экспрессии альтернативных Cl- каналов в воздушных путях и лёгких87. Модели из крупных животных с физиологией, сходной с людской, из таких как морские свинки, овцы и приматы, необходимы и ведутся работы по созданию таких моделей с использование генетических и фармакологических подходов. В нашей лаб. показано успешность использования только что выделенных свежих тканей людей (аутопсия или хирургическое удаление) для изучения фенотипа воздушных путей и лёгких от людей с муковисцидозом для выявления потенции ингибиторов CFTR для фармакологического создания фенотипа cystic fibrosis89.
Michael Sanguinetti. Большой проблемой является вопрос, могут ли мыши служить подходящей моделью для людей. В некоторых случаях, таких как кардиальные аритмии, определенно нет. Молекулярные и клеточные основы кардиальной возбудимости у грызунов очень отличны от крупных млекопитающих. Грызуны имеют скорость сердцебиений, которая почти в 10 раз выше, чем у людей и это очень серьёзное различие как в отношении потенциала действия , так и реполяризации и того как осуществляется цикл внутриклеточного Ca2+, чтобы обеспечить наиболее эффективный способ excitation-contraction coupling. Поэтому неудивительно, что типы каналов и их плотность в мембранах отличается у мышей и людей. Напр., delayed-rectifier K+ каналы являются более важными для кардиальной реполяризации у людей, чем у мышей, тогада как противоложное верно для временных outward K+ токов90. Однако роль быстрых Na+ каналов относительно сходна у обоих видов. Т.о., трансгенные мышиные модели для изучения физиологических последствий мутаций в Na+ каналах м.б. более информативными, чем модели с мутациями delayed-rectifier K+-каналов.
Более того, избыточная экспрессия или нокаут субъединиц каналов д. приводить к аномальному партнёрству акцессорных субъединиц в некоторых тканях, это м. изменять и биофизические и фармакологические свойства гетеромультимерных или гомомультимерных (напр., если β-субъединица в нокауте) каналов.
Trevor Smart. Животные модели м. помочь в установлении связи между функцией каналов и изменённым поведением. Однако не все животные модели адекватно воспроизводят фенотипы болезней человека и мы д.б. уверены, что генетическая конституция животных моделей м. оказывать критическое влияние на характер болезни, а также на чувствительность к лечению лекарствами.
16. What methods are optimal for probing the correlation between genotype and phenotype in ion channel-linked diseases?
Michel Lazdunski. There is no optimal method that would work for all channels.
Chris Miller. The tedious and unglamorous work of old-fashioned cell/organ physiology, which is vanishing from our medical schools in a tidal wave of massive parallel-processing techniques.
Sarah Lummis. A range of methods are available at present, and useful — and different — information is gained from each of them. However, perhaps the optimal method is the use of transgenic animals.
David Clapham. Transgenic animals, with the animal being the closest possible in its genotype to humans.
Alan North. Transgenic and knock-in mice; mutations and heterologous expression; human and animal genetics; and genetics in simple organisms, particularly vertebrates such as zebrafish.
Trevor Smart. Optimal methods would include the ability to generate conditional knockout animals to mimic the disease state, and also to create knock-ins that may correct the deficiencies. Analyses of the connection between the genotype and phenotype would involve behavioural, molecular and electrophysiological methods, as indicated in my previous answers.
Alan Verkman. Transgenic knockout and mutant mice remain an important model for genotype–phenotype investigations of ion channels because of the ability to selectively alter the function of a target channel in a tissue- and time-specific manner. If compounds with appropriate selectivity are available, larger animal models are preferred that better recapitulate human physiology, comparing phenotype before and after drug administration.
Kenneth Chien. We need to understand the relationship between specific changes in channels and the in vivo phenotype. This will require more than just a knowledge of the structure/function relationship within a given channel, such as an understanding of how these changes relate to the cellular and, more importantly, organ system into which they are integrated.
Birgit Liss. Methods that allow the direct analysis of function and gene expression for the same cells are well suited to correlating genotype and phenotype at the cellular level. To correlate genotypes and phenotypes of whole animals, the combination of detailed standardized behavioural tests and high-throughput (SNP) analysis (for example, (MALDI-TOF)-based or real-time PCR-based) might be one approach.
Jamie Vandenberg. All of the commonly used methods (heterologous expression, integration into accurate kinetic models and gene knockouts in model organisms) contribute to our understanding of genotype–phenotype relationships. At present, the main area in which we lack information is in our understanding of the chronic changes induced by mutated or inhibited ion channels. This information can be obtained only from model organisms. Anything in mammals will always be expensive (and time consuming). Furthermore, the mouse might not be the optimal organism to use for cardiac arrhythmia studies. We therefore need to look into the possibility of developing other model systems; see, for example, the recent studies using zebrafish from Calum MacRae's group91.
David Clapham. Если выводится из строя только один канал, то это м.б. довольно лимитирующим. Однако многие ионные каналы существуют в уникальных белковых комплексах или являются гетеромерными ткане-специфическим образом, смягчая тем самым неспецифичность.
Michel Lazdunski. В большинстве тканей каналы не идентичны (разные гены, разные сплайс-варианты, разные партнёры) Напр., L-type Ca2+ каналы повсеместны, но если мы попытаемся блокировать их, хотя бы частично, то это будет опасно. Несмотря на это блокаторы Ca2+-каналов широко применяются при гипертензии.
Richard Lewis. Это оказывает ненормальное влияние на разработку лекарств, которые обычно адресуются только с помощью use-dependent лекарств (лигандов, которые предпочитают соединяться с состояниями каналов, обнаруживаемых скорее в болезненных тканях, чем в нормальных; напр., локальные анестетики). Др. подходом является разработка лекарств с ограниченным распрделением, таких как модуляторы ионных каналов, которые лишены центральных эффектов из-за избирательного распределения по периферии.
Michael Sanguinetti. Это будет иметь такое же самое влияние, которое всегда существует для молуляторов ионных каналов. Напр., локальный анестетик блокирует Na+ каналы в нервной системе и сердце, а блокада L-type Ca2+-каналов затрагивает почти все возбудимые и многие типы невозбудимых тканей. Несмотря на эту проблему некоторые агенты, такие как verapamil (Calan, Isoptin), являются эффективными благодаря присутствию барьеров между кровью и головным мозгом или благодаря тому, что акцессорные субъединицы меняют реакцию на лекарства клеточно-зависимым способом.
Sarah Lummis. Благодаря соотв. модуляции и/или разным агонистам и антагонистам, которые м. работать совершенно по-разному с одними и теми же каналами, экспрессируемыми в клеточных или органных местах (в результате, напр., различных внеклеточных и/или внутриклеточных стимулов, вызывающих разные пост-трансляционные модификации), я верю, что имеется хороший потенциал для ионных каналов, несмотря на их повсеместность, в качестве терапевтических мишеней.
Frances Ashcroft. Это скорее всего зависимт от функциональной роли каналов в разных тканях, от способности лекарств достигать разных типов ткани и от скорости, с которой они метаболизируются. Напр., sulphonylureas стимулирует секрецию инсулина у индивидов с type 2 диабетом, блокируя KATP каналы в панкреатических β-клетках92. Хотя KATP каналы находятся во многих др. типах клеток, побочные явления лекарства малы. Это возможно, частично, из-за того, что KATP каналы в кардиальных клетках в основном закрыты (за исключением ишемии), a лекарство, как полагают, не пересекает барьера кровь-головной мозг.
Irwin Levitan. Белок, который экспрессируется повсеместно вряд ли м. б. удобной терапевтической мишенью. однако имеются примеры ионных каналов и ассоциированных с каналами белков с такми тканевым и клеточнм распределением, что большинство из них оказывается более значительно ограниченным - напр., β4-субъединица больших conductance Ca2+-dependent K+ каналов, которая обнаруживается только в головном мозге - и она становится фокусом для фармакоцефтической индустрии. Даже более серьёзной проблемой, чем повсеместное распределение, является то, что даже каналы с ограниченным распределением м. б. трудными для специфического поиска (см. вопрос 11).
Trevor Smart. Повсеместная экспрессия ионных каналов не обязательно влияет на их потенциал в качестве терапевтических мишеней, если м.б. разработаны лиганды, которые селективно блокируют или модулируют определенные состояния ионных каналов (Рис. 8). Т.о., лиганды, которые нацелены на открытые или инактивированные состояния каналов, будут стремиться ограничить функцию каналов, только в области, где они интенсифицируют операции каналов или где каналы адаптируют определенные состояния на длительные периоды времени (phenytoin (Dilantin; Pfizer), будут эффективными при эпилепсии путём блокирования повсеместных Na+ каналов93). Это говорит в пользу разработки лекарств, зависящих от состояния канала. однако такие подходы не всегда гарантируют успех, как в случае с клинической разработкой MK801 для защиты от нейродегенерации, вызываемой NMDA рецепторами (94). Если каналы сверх активны, напр., при эпилепсии, то м. попытаться нацелить лекарства на инактивированные состояния (для voltage-gated каналов) или на десенсибилизированные состояния (дляligand-gated ионных каналов), скорее, чем просто на открытые состояния каналов.
John Peters. Избирательность скорее в функциональном, чем прямом фармакологическом смысле м. испытывать влияние со стороны факторов, отличных от молекулярной структуры мишеней per se, и это м. создать достаточное терапевтическое окно в некоторых случаях. Примером м. служить I antidysrrhythmic лекарства, которые обладают, по крайней мере, средней избирательностью действия в физиологическом скорее, чем в фармакологическом смысле (95). Эти агенты блокируют напряжением активируемые Na+ каналы use-dependent способом (чем больше Na+-каналов в популяции активировано, тем более эффективно они блокируются). В основном это обусловлено тем, что лекарство имеет высокое сродство к открытой и инактивированной конформациям Na+ каналов. Как следствие, высокая частота возбудимости кардиальных мышц, которая наблюдается при tachyarrhythmias, м.б. блокирована без серьёзных нарушений нормального кардиального ритма. Сходная use-dependent блокада voltage-activated Na+ каналов лежит в основе эффективности carbamazepine при некоторых формах эпилепсии и невралгии тройничного нерва96. Избирательное распределение лакарства (напр., активная секреция определенных диуретиков в канальцах нефронов) также м. помочь достижению избирательности действия.
18. What would you describe as the major concerns surrounding the development of ion channel-targeting therapies?
Richard Lewis. Safety and side effects.
David Clapham. The risk of nonspecific interactions with channels in the heart or brain that can potentially cause LQT-type arrhythmias, which might not be detected in animals.
Jamie Vandenberg. With respect to the heart, we need more information about the long-term side effects of ion channel-blocking drugs. The complement of ion channels expressed in different regions of the heart varies with disease states. Furthermore, ischaemia and/or development of cardiac hypertrophy/failure is likely to modify the response to drugs. Thus, a drug that is useful in a given patient at a given time might not be useful (or indeed, could be harmful) a short period of time later.
Michel Lazdunski. There are no more concerns to have with ion channels than with the seven-transmembrane-domain G-protein-coupled receptors, which are favourite targets for drug development in drug companies.
Alan Verkman. Specificity, because ion channels generally have a wide tissue distribution and substantial structural similarity to related family members.
Trevor Smart. The development of subtype-selective agents and the effective delivery of these agents to targeted tissues. The latter is often overlooked, although it really is important for all drug-based therapeutics.
Walter Stuhmer. The presence of many subtypes with varying functions in many different tissues, and the consequent need to develop very subtype-specific interaction partners. However, the great advantage is that cell-membrane channels are accessible from outside the cell, which is of great importance for any drug.
Dale Benos. Clearly, the ubiquitous expression of certain ion channels will limit the development of therapeutic strategies that target these channels in a specific tissue or organ. However, if targeting molecules can be coupled to another agent that does show tissue specificity, such as an antibody directed against an ion channel-associated protein that in turn is tissue specific, then perhaps overall specificity could be achieved.
Irwin Levitan. Other than the issues of specificity and redundancy of function referred to above (см. вопрос 11), a serious issue is the failure rate of ion channel-targeting therapies in clinical trials. A recent K+-channel opener tested for the treatment of stroke by Bristol-Myers Squibb97 was based on a rational choice of target and elegant drug design, and was very effective in a rodent model of acute ischaemia, but failed in clinical trials because of lack of efficacy in humans. The reasons for this and other failures remain to be understood.
Birgit Liss. We still do not know enough about the complex functional roles of distinct ion channel subunits. For example, the A-type Kv4 K+ channel β-subunit has additional functions as a transcription repressor and a presenilin-interacting enzyme (calsenilin). As a K+-channel β-subunit, KChIP3 increases the surface expression of Kv4 channels and modulates their biophysical properties98. But KChIP3 is also identical to DREAM, a transcription repressor that regulates the expression of dynorphin and is involved in modulating pain sensation99. Finally, the sequence of KChIP3 is also identical to calsenilin, which regulates the levels of a proteolytic product of . Mutations of presenilin cause a form of early-onset familial Alzheimer's disease100. Thus, if KChIP3 is used as a target to modulate the electrical activity of neurons, one might unintentionally affect, for example, pain reception or even neurodegeneration.
19. What outstanding questions in ion channel research are likely to be sorted out in the next few years?
Jamie Vandenberg. It is always dangerous to predict the future.
