НГ | TBP

Черепнолицевые органы у позвоночных формируются из множественных эмбриональных тканей, включая клетки, происходящие из краниального нейрального гребня, прехордальную мезодерму и эмбриональную черепнолицевую эктодерму. Обычно морфология лица и черепа формируется как следствие сложных взаимодействий между этими эмбриональными тканями и нуждается в точной регуляции клеточных движений, роста и формирования паттерна и дифференцировки черепнолицевых тканей. Генетические исследования показали участие многочисленных генов в этих процессах. включая гены. кодирующие разнообразные транскрипционные факторы, факторы роста и рецепторы [1]. Мутации в генах, которые влияют на любой из этих процессов, м. вызывать черепнолицевые аномалии. такие как расщепление лица и краниосиностозы, которые являются наиболее частыми среди врожденный пороков развития у людей [2]. Среди критических факторов, участвующих в черепнолицевом развитии. находятся и семейство Msx гомеобоксных генов. Гены Msx позвоночных были первоначально клонированы у мышей и идентифицированы как гомологи генов Drosophila muscle segment homeobox (msh)[3, 4]. Затем гены Msx были выделены от разных организмов, включая асцидии [5, 6], морских ежей[7], рыбок данио [5, 8], лягушек [9], птиц [10-12] и людей [13]. Семейство генов Msx у млекопитающих состоит из 3 физически не сцепленных членов, названных Msx1, Msx2 и Msx3 [14, 15]. Msx3 единственный экспрессирующийся в дорсальной части нервной трубки, паттерн экспрессии которого напоминает таково прототипического гена дрозофилы msh [16, 17]. Однако, у развивающихся эмбрионов позвоночных Msx1 и Msx2 широко экспрессируются во многих органах; особенно в местах, где происходят эпиталиально-мезенхимные взаимодействия [15]. Msx1 и Msx2 особенно строго экспрессируются в развивающихся черепнолицевых регионах перекрывающимся образом в определенной степени [18-21].

Craniofacial morphogenesis

Во время эмбрионального развития лицо и шея происходят из утолщений или почек эмбриональной ткани, бранхиальных дуг, который возникают с двух строн на голове. Клетки нейрального гребня (НГ) генерируют большую часть скелетных и соединительно-тканных структур черепнолицевой области, тогда как мезодерма формирует мускулатуру и эндотелиальную выстилку артерий будущих лица и шеи. Предопределение паттерна в черепнолицевой области частично детерминируется с помощью аксиального происхождения клеток нейрального гребня внутри каждой дуги и частично с помощью региональных эпителиально-мезенхимных взаимодействий [22, 23]. У мышиных эмбрионов клетки краниального нейрального гребня происходят из задней части областей среднего и заднего мозга и мигрируют вентро-латерально в бранхиальные дуги [24-28]. В бранхиальных дугах разные популяции клеток нейрального гребня не перемешиваются и сохраняют позиционные сигналы, приобретенные ими ещё при ростро-каудальном расположении в головном мозге. Эта сегрегация популяций клеток нейрального гребня осуществляется рано во время органогенеза с помощью апоптической элиминации клеток НГ из специфических уровней заднего мозга, давая три отдельных потока мигрирующих клеток НГ. Хотя подобное формирование паттерна клеток НГ зависит от их ростро-каудального происхождения, этот паттерн обнаруживает определенную степень пластичности [29-31]. Напр., нокаут гена Hoxa-2 у мышей приводит к тому, что вторая дуга продуцирует скелетные элементы, обычно обнаруживаемые в первой дуге. Это указывает на то, что гены Hox м. специфицировать паттерн дуг, расположенных каудальнее первой дуги, которая не экспрессирует гены подобного класса [32]. Дальнейшее формирование паттерна клеток НГ внутри дуг связано с участием реципрокной серии эпителиально-мезенхимных взаимодействий, обеспечиваемых несколькими путями, передающими сигналы ростовых факторов [33-38].

Развитие лица у млекопитающих результат скоординированного роста и дифференцировки пяти лицевых примордиев, одного медиального форонтоназального возвышения, пары верхнечелючстных выпячиваний и пары ниженечелюстных выпячиваний, расположенных вокруг первичного рта или стомодеума, как показано на Рис. 1a и 1b. По ходу развития в фронтоназальном возвышении, развиваются локализованные утолщения поверхности эктодермы, называемые носовыми плакодами. Эти плакоды инвагинируют, тогда как их края утолщаются, чтобы сформировать носовые ямки и латеральное, а также медиальное возвышения. Верхнечелюстные выпячивания первой бранхиальной дуги растут в направлении будущей срединной линии лица. Они сливаются с латеральными носовыми возвышениями на каждой из сторон, затем сливаются с медиальными носовыми возвышениями и, наконец, с intermaxillary сегментом фронтоназального отростка, чтобы сформировать верхнюю челюсть и губу. Сходным образом парные мандибулярные отростки сливаются своими медиальными краями, образуя нижнюю челюсть и губу. Фронтоназальное возвышение формирует лоб и нос. Слияние этих сближающихся зачатков ведет к образованию билатеральных эпителиальных швов, которые позднее замещаются соединительной тканью [39-41], вызывая слияние губ. Расщепление верхней губы происходит в результате неспособности максиллярных выростов сливаться с медиальным носовым выпячиванием с одной или с обеих сторон. Отсутствие слияния парных мандибулярных отростков встречается очень редко, оно приводит к расщелине нижней губы и челюсти [42].

Черепнолицевой морфогенез продолжается, сопровождаемый выростом и слияниями тканей, образующих нёбо или крышу ротовой полости. Нёбо образуется из двух зачатков, первичное и вторичное нёбо. Одиночная срединная клинообразная масса мезенхимы, растущая изнутри от фронтоназального выпячивания образует первичное нёбо. Вторичное нёбо образуется билатерально из двух вертикальных проекций, небных створок, от внутренних поверхностей максиллярных отростков (Рис. 2). По ходу морфогенеза створки начинают принимать горизонтальное положение и затем сближаются др. с др. и сливаются по срединной линии. Неспособность нёбных половинок сливаться ведет к расщеплению нёба. Ряд врождённых синдромов человека, такие как Treacher Collins Syndrome и Pierre Robin Syndrome сопровождаются черепнолицевыми аномалиями, которые включают расщепление нёба [43]. Неправильная регуляция времени. скорости или степени роста нёбных створок ведет к расщелине нёба [44, 45]. Неспособность сливаться нёбных половинок часто, но не всегда. происходит вместе с расщеплением губы [46].

Др. важным морфогенетическим событием в тканях лица является одонтогенез. Формирование зубов регулируется с помощью индуктивных тканевых взаимодействий между ротовым эпителием и соседней мезенхимой первой дуги. 4 физиологически самостоятельных стадии развития зубов: стадии 1) зубной lamina, 2) почки, 3) шапочки и 4) колокола (Рис. 3)[47]. У мышей инициация зубов становится морфологически различимой на ст. E11.5 в виде утолщения зубного эпителия, образующего зубной тонкий слой (lamina) в месте образования будущих зубов. Клетки этого зубного листка пролиферируют и к E12.5 начинают инвагинировать в подлежащую мезенхиму. На ст. почки мезенхима пролиферирует и конденсируется вокруг инвагинирующейся эпителиальной почки. В результате дифференциальной пролиферации зубной эпителий охватывает конденсированную мезенхиму (зубной сосочек (papilla)) на ст. шапочки (E14.5) и колокола (E16.5). E14.5 соответствует началу дефинитивной стадии зубного морфогенеза. На ст. шапочки и колокола в эпителии развиваются временные сигнальные центры, т. наз первичные и вторичные эмалевые узелки. Они служат в качестве организующих центров зубного морфогенеза и образования бугорков (cusp). На финальной ст. одотогенеза секретирующие эмаль амелобласты и секретирующие дентин одонтобласты дифференцируются из зубного эпителия и мезенхимы, соотв.

Др. черепнолицевой структурой является череп (Рис. 4), который состоит из нескольких костей, организованных прежде всего в нейрокраниум, который включает свод черепа и висцерокраниум, представленный лицевыми костями, а также нёбными, глоточными, височными и слуховыми костями. Нейрокраниум, чьей функцией является защита головного мозга и органов чувств, происходит из мезенхимы как нейрального гребня, так и мезодермального происхождения. Висцерокраниум напротив формируется исключительно мезенхимой нейрального гребня. Сalvaria или свод черепа формируется в результате внутримембранозной оссификации радиально растущих, дискретных, мезенхимных конденсатов поверх увеличивающегося головного мозга. Фиброзные, не-остеогенные мембраны, называемые швами или родничками (более широкие швы, появляющиеся на стыке нескольких костей) отделяют возникающие в результате прироста кости свода. Дальнейший рост черепа осуществляется за счёт наращивания латеральных краёв швов, которые заняты высоко пролиферирующими преостеобластами. Такой механизм приспособлен к постоянно увеличивающемуся головному мозгу. В отличие от свода черепа основание черепа развивается за счёт эндоходральной оссификации хрящевого хондрокраниума. endochondral ossification of the cartilaginous chondrocranium. Неспособность к начинанию, не синхронизированный рост или несвоевременная оссификация м. служить механизмами, вносящими вклад в дисморфии черепа. Вклад генов Msx в поддержание деликатного баланса между пролиферацией и дифференцировкой во время пре- и постнатального морфогенеза черепа и будет предметом дальнейшего рассмотрения.

Msx genes encode transcription repressors

Белки Msx являются важными модуляторами развития черепнолицевого, конечностей и нервной системы [16, 48, 49]. Они являются регуляторными белками, которые функционируют как репрессоры транскрипции in vitro и in vivo [48, 50-55]. Межбелковые взаимодействия, которые используют аминокислотные остатки внутри их гомеодоменов целенаправленно осуществляют выбор генов и регуляцию транскрипции [53, 54]. Гомеодомены Msx взаимодействуют непосредственно с TATA binding protein (TBP), стержневым компонентом генерального транскрипционного комплекса, чтобы обеспечить репрессию транскрипции. Важно, что эта способность взаимодействовать с членами базовой транскрипционной кухни (machinery) и влиять на транскрипцию не пропорциональна их ДНК-связывающей функции [51]. Белки Msx взаимодействуют также с др. гомедоменовыми белками, чтобы регулировать транскрипцию. Гетеродимеры, образующиеся между Msx1 и др. гомеодоменовыми белками, такими как Dlx2, Dlx5, Lhx2 и Pax3, обусловливают взаимный функциональный антагонизм in vitro[55-57]. Считается, что ткани, в которых экспрессия Msx1 перекрывается этими др. белками, м. иметь такой регуляторный механизм. Хотя и Msx1 и Msx2 обнаруживают сходное предпочтение к ДНК-связывающим сайтам, а также способность репрессировать транскрипцию, они обладают всё же разными биохимическими свойствами за счёт действительно уникальных N-терминальных доменов, которые наделяют Msx2 более высоким сродством к ДНК, тогда как Msx1 действует как более мощный репрессор. Изучение трехмерной структуры гомеодомен/ДНК комплекса Msx1 выявило два главных отличия от др. гомодомен/ДНК комплексов [58]. Во-первых, присутствие двух неканонических пролиновых остатков, обеспечивающих более высокую стабильность, и расположение N-терминального плеча гомеодомена, которое нацелено на минорную борозду ДНК. Во-вторых, ДНК, связываемая с помощью гомеодомена Msx1, обнаруживает 28° изгиб по сравнению с обычным в 21°, наблюдаемым при связывании др. гомеодоменовых белков.

Expression of Msx genes during craniofacial development

Перекрывающаяся экспрессия Msx1 и Msx2 выявляется во многих местах межтканевых взаимодействий, включая и черепнолицевые области [20, 48, 59]. По ходу черепнолицевого развития у мышей и Msx1 и Msx2 выявляются в формирующемся черепе и менингеальных оболочках, дистальных аспектах лицевых зачатков, ассоциированных органах чувств и в зубах [18-20]. В развивающемся черепе Msx1 и Msx2 экспрессируются в мезенхиме швов и твёрдой мозговой оболочке. В то время как экспрессия Msx1 распространяется на постнатальные стадии морфогенеза черепа, экспрессия Msx2 резко снижается после рождения.

Самое раннее ограничение распределения Msx1 во время развития зубов приходится на E11.0 и касается зубной мезенхимы на стадии lamina, и экспрессия увеличивается в конденсирующейся зубной мезенхиме на стадии почки (Рис. 5). На морфогенетической стадии шапочки и зубной сосочек и фолликул экспрессируют Msx1 максимально. Экспрессия начинает снижаться перед дифференцировкой одонтобластов и амелобластов. На поздних стадиях морфогенеза зубов экспрессия Msx1 определенно отсутствует в эпителии оболочки корней и довольно слабая в зубной пульпе [60]. Предполагается, что Msx1 не поддерживает морфогенеза корней в развивающихся зубах. Помимо зубов экспрессия Msx1 была изучена в развивающемся нёбе. Выявлена слабая диффузная экспрессия Msx1 в нёбной мезенхиме, это первое указание на то, что Msx1 м. играть непосредственную роль в развитии нёба [18, 61]. Далее [62] было установлено, что экспрессия Msx1 в нёбной мезенхиме связана с передней частью развивающихся нёбных пластинок.

Экспрессия MSX2 выявляется на 7.5 неделе эмбрионального развития человека [63]. У людей предшественники ротового и лицевого скелета, такие как кости верхней и нижней челюсти, Меккелев хрящ и зачатки зубов, экспрессируют MSX2 [63]. На ст. почки развивающихся зародышей зубов MSX2 обнаруживается в вестибулярной lamina, а также в зубном эпителии и мезенхиме. Позднее экспрессия MSX2 исчезает из зубной мезенхимы, но сохраняется в эмалевых узелках и вестибулярном эпителии зубов стадии шапочки. У мышей экспрессия Msx2 постоянна в зачатках коренных зубов и резцов [20, 61]. В отличие от развивающихся резцов зачатки коренных зубов обнаруживают асимметричное распределение Msx2 на всех ст. развития. В противоположность Msx1, чья экспрессия связана с мезенхимой в течение всего развития зубов, экспрессия Msx2 м.б. выявлена и в эпителиальном и мезенхимном компартментах зачатков развивающихся зубов. Самым ранним указанием асимметричной экспрессии является его щёчное распределение, обнаруживаемое в зубной lamina зачатков коренных зубов. На ст. шапочки экспрессия Msx2 преимущественно обнаруживается в компонентах эмалевого органа (эмалевые центры, перегородки и узелки), а также в во внутреннем эмалевом эпителии. С началом ст. колокола экспрессия Msx2 теряется из внутреннего эмалевого эпителия по мере того, как он дифференцируется в амелобласты. Вместо этого сильная экспрессия Msx2 обнаруживается в одонтобластах и субодонтобластных областях зубного сосочка. Т.о., пространственная и временная экспрессия Msx1 и Msx2 генов, по-видимому. коррелирует с критическими аспектами черепнолицевого морфогенеза.

Regulation of Msx1 and Msx2 expression and facial patterning

Регуляция экспрессии генов Msx связана с разными механизмами, включающими ретиноиды, антисмысловое `quenching', регуляцию ростовыми факторами и комплементарно/антогонистическим взаимодействием с др. транскрипционными факторами. Регуляция ретиноидами генов Msx привлекла внимание после идентификации энхансерного элемента, чувствительного к ретиноевой кислоте, в 5' фланкирующей области MSX1 человека [64]. Далее [65] было установлено, что эндогенные ретиноиды контролируют пространственную экспрессию Msx1 путём снижения его экспрессии в задних регионах эмбрионов перепела на стадии гаструляции и нейруляции. Т.о., ретиноиды являются важными регуляторами нормальной экспрессии Msx1 у птиц. Напротив, в мезенхимных клетках эмбрионального нёба у мышей ретиноевая кислота, по-видимому, ингибирует экспрессию Msx1 [66]. Кроме того, 5' вышестоящая область мышиного Msx1 характеризуется присутствием множественных энхансерных элементов, включая три потенциальных NFkB-связывающих сайта и Msx1 консенсусный сайт связывания [67-71]. Это указывает на существование множественных регуляций экспрессии Msx1.

Blin-Wakkach et al[72] сообщили о присутствии эндогенной Msx1 антисмысловой РНК у мышей, крыс и людей. Предполагается, что пропорция смысловых и антисмысловых транскриптов предопределяет количества доступного функционального белка. Увеличение антисмысловой РНК, по-видимому, является переносимым для дифференцировки черепнолицевых структур, особенно тех, которые связаны с минерализованным матриксом, т.к. смысловая форма транскриптов поддерживает клетки в пролиферативном состоянии [72].

Развитие мембранозных костей и краниальных швов связано с сигналами от факторов роста, передаваемых с помощью генов Msx [11, 73, 74]. Установлено, что раскрытое (patency) состояние швов контролируется с помощью дифференциальной регуляции генов Msx ростовыми факторами [74]. Показано, что добавление экзогенного FGF4 к мезенхиме швов или остеогенному фронту стимулирует мезенхимную экспрессию Msx1 и клеточную пролиферацию, это способствует закрытию швов. Добавление BMP4 м. индуцировать и Msx1 и Msx2 в мезенхиме швов, вызывая последующее увеличение толщины ткани. Предполагается, что путь передачи сигналов BMP4-Msx регулирует баланс между детерминированными и недетерминированными остеогенными клетками в швах. В дополнение к регуляции с помощью BMPs выявляется непосредственное влияние Smad4 на промотор Msx2, т.е. экспрессия Msx2 также активируется с помощью бифункционального белка с цинковыми пальчиками YY1 независимо от пути передачи сигналов BMP [75, 76].

Бранхиальные дуги в основном занимаются клетками из краниального нейрального гребня (НГ), которые мигрируют их областей среднего и заднего мозга. Потоки клеток НГ, покидаюobt дорсальные аспекты заднего мозга, формируются благодаря апоптической элиминацими клеток НГ, происходящих из ромбомеров 3 и 5 [22, 78-80]. Это апоптическое удаление клеток НГ обеспечивается с помощью BMP4-индуцированной экспрессии Msx2 только в нечетных ромбомерах [81].

В развивающемся лице комплементарная экспрессия Msx1 и Barx1 в мезенхиме нижней челюсти специфицирует события формирования паттерна, включая образование зубов [82, 83]. Перекрывающаяся экспрессия генов Msx и Dlx вместе с доказательствами того, что члены двух семейств образуют гетеродимеры in vitro выявляет предполагаемый механизм контроля событий формирования паттерна лица in vivo [55, 84]. В мандибулярных дугах эмбрионов кур экспрессия Msx1 коррелирует с областями клеточной пролиферации, тогда как Msx2 локализуется в областях или помеченных к запрограммированной гибели или специфицированных в направлении образования не хондрогенных тканей [21]. Срединное расположение Msx1 в мандибулярной дуге эмбрионов кур согласуется с ролью по обеспечению выпячиваний мандибулярных дуг, на что указывает укорочение мандибуляррных дуг у Msx1 мутантных мышей. Далее было установлено, что расширенная индукция генов Msx с помощью эктопического воздействия BMP4 или BMP2 вызывает раздвоение лицевого скелета и усиленную пролиферацию в зачатках нижней челюсти [85].

У мышей Msx1 экспрессируется иерархически ниже dHAND, мезенхимного транскрипционного фактора пути передачи сигналов Endothelin-1 [86]. Msx1, Msx2 и bHLH транскрипционный фактор dHAND экспрессируются перекрывающимся образом в дистальной мезенхиме бранхиальных дуг. У dHAND-нулевых эмбрионов экспрессия Msx1 теряется и бранхиальные дуги становятся гипопластичными. Экспрессия Msx2 сохраняется неизменной у таких мутантов. Предполагается, что Msx1 является существенным для развития мезенхимы бранхиальных дуг, происходящей из клеток НГ [86].

Msx1 широко распространён в путях передачи сигналов многих факторов роста и участвует в оркестровке индуктивных событий, существенных для органогенеза. Он повторно используется в путях передачи сигналов BMP, FGF, Endothelin и SHH. BMP2, BMP4, FGF2, FGF4, FGF8, и FGF9 представляют собой факторы роста из ротового и/или зубного эпителия, которые способны индуцировать экспрессию Msx1 в соседней мезенхиме верхней и нижней челюсти [87, 88]. Экспрессия в мезенхиме некоторых ростовых и транскрипционных факторов, а именно, Bmp4, Fgf3, Dlx2, syndecan-1 и Ptc в свою очередь обнаруживает зависимость от экспрессии Msx1 [87, 89-91].

Между E9.5 и E13.5 Msx1 обнаруживает широкое распределение вдистальном направлении, перекрывая области презумптивных резцов в обеих челюстях. Постепенно экспрессия Msx1 оказывается локализованной в конденсирующейся мезенхиме зачатков как коренных зубов, так и резцов. Этому сдвигу в экспрессии Msx1 предшествует сдвиг в паттерне экспрессии Bmp4 [92]. Установлено, что Msx1 и Bmp4 индуцируются в зубной мезенхиме с помощью эпителиального Bmp4 [87, 89]. Будучи однажды индуцированной позитивная петля обратной связи вступает в действие между Msx1 и Bmp4 в зубной мезенхиме, поддерживая уровни обоих генов в течение всего морфогенеза зубов [47, 89, 92]. Тот же самый механизм объясняет пространственное ограничение экспрессии Msx1 на поздней стадии почки в одонтогенной мезенхиме [92]. Т.о., Msx1 действует эпистатически в отношении мезенхимного Bmp4, фактора-кандидата, который передает сигнал назад в зубной эпителий, позволяя зубному морфогенезу достигнуть стадии шапочки [89, 93]. Msx1 необходим также в пути передачи сигналов Fgf8 для индукции Fgf3 в зубной мезенхиме [90]. Два пути, по-видимому, независимы один от др. и осуществляются параллельно во время раннего одонтогенеза. Если BMPs м. индуцировать и Msx1 и Msx2 в зубной мезенхиме, то FGFs м. индуцировать только Msx1 [87, 88, 90]. In vitro эксперименты указывают на то, что Msx1 и Msx2 обеспечивают индуктивные эффекты BMP7 на морфогенез челюстей, а так же на фазу инициации одонтогенеза [94]. Индукция Ptc, нижестоящей мишени передачи сигналов Shh, в зубной мезенхиме является зависимой от Msx1, который ко-экспрессируется с Ptc [91]. Условное удаление Shh специфически в зубном эпителии не влияет на экспрессию Msx1 или Msx2. Это говорит о том, что Msx1 и Msx2 не являются мишенями для передаваемых сигналов Shh.

Mutations in Msx1 cause tooth agenesis and cleft palate

У людей мутации в гене MSX1 вызывают орофациальное расщепление и агенез зубов [95-101]. Гомеодомен MSX1 является кардинальным в обеспечении его множественных функций, таких как связывание ДНК, межбелковые взаимодействия, стабильность белков и репрессия транскрипции. Миссенс мутации, вызывающие замену аргинина на пролин в гомеодомене MSX1, ведут к избирательному агенезе зубов у людей, аутосомно доминантному фенотипу, затрагивающему вторые премоляры и третьи моляры вторичных зубов [95]. Биохимический и функциональный анализ мутантного белка выявляет гаплонедостаточность по MSX1, как молекулярную основу этого фенотипа [102]. Мутантный белок обнаруживает снижение стабильности в результате структурных пертурбаций и неспособен взаимодействовать с ДНК или со своими родственными белковыми факторами. В соответствии его способность функционировать в качества транскрипционного репрессора сильно нарушена. Повышенная чувствительность к дозе гена MSX1, по-видимому, специфична для людей. У мышей хотя нулевая мутаци в гене Msx1 и вызывает полную неспособность развития зубов, мыши, гетерозиготные по Msx1 не имеют каких-либо нарушений зубов [103, 104]. Несмотря на разные фенотипы, вызываемые разными дозами Msx1 у людей и мышей, его важность для морфогенеза зубов вне сомнений.

Wolf-Hirschhorn syndrome (WHS) является врожденным синдромом у людей, обусловленным делецией локуса MSX1 в хромосоме 4 [105]. Фенотипические проявления этого синдрома характеризуются дефектами слияния по срединной линии, дефектами ушей и микроцефалией, это связано с вовлечением регионов. которые экспрессируют MSX1 у эмбрионов мыши [18, 19, 106, 107]. Более того, нонсенс мутация в MSX1 объясняет генетическую этиологию синдрома Witkop, характеризующегося агенезом зубов и дизгенезом ногтей [100].

В противоположность гаплонедостаточности MSX1 у людей [102], генетически сконструированные Msx1 гетерозиготные мутации у мышей не дают каких-либо видимых проявлений [103, 104]. Однако, мыши, несущие Msx1 нулевую мутацию погибают вскоре после рождения и обнаруживают тяжелые черепнолицевые аномалии [103, 104]. Эти фенотипы включают расщепление нёба, отсутствие альвеолярных отростков и арест развития зубов на стадии почки, воссоздавая тем самым фенотип, обнаруживаемый у людей носителей мутации MSX1.

У мутантны Msx1 мышей зубная мезенхима неспособна конденсироваться вокруг зубной эпителиальной почки, что и ведет к аресту развития на стадии почки зародышей молярных зубов [103]. Msx1-недостаточность ведет к существенно сниженной экспрессии Bmp4 в зубной мезенхиме зародышей арестованных зубов [89]. Установлено, что Msx1-/- эмбрионы обнаруживают также исчезновение экспрессии Fgf3 и снижение экспрессии Lef1, Ptc, Dlx2 и syndecan-1 в зубной мезенхиме [89, 90, 91]. С др. стороны, экспрессия tenascin остаётся неизменной у этих мутантов. Отсутствие клеточной автономности для вторичного эффекта недостаточности Msx1 связано с потерей экспрессии Shh и Bmp2 в зубном эпителии [93]. Арест на стадии почки усиливается после добавления экзогенного BMP4 или с помощью трансгенной экспрессии Bmp4, тем самым обходится стороной потребность в функции Msx1 [89, 93, 108]. В результате развитие зубов преодолевает стадию шапочки in vitro благодаря практически полному восстановлению в культурах и восстановлению образования альвеолярных костей у трансгенных мышей [89, 108, 109]. Анализ генной экспрессии показал, что экспрессия Lef1, Dlx2, Shh и Bmp2 восстанавливается вследствие эктопической или экзогенной экспрессии Bmp4, это является критическим для морфогенеза зубов и образования альвеолярных костей. Сопутствующий дефект в пролиферации, наблюдаемый у Msx1-дефицитных эмбрионов, связан с отдельным путём, использующим FGFs, где Msx1 обеспечивает индукцию Fgf3 и syndecan-1, рецепторов FGF низкого сродства [89, 90]. Bei et al [109] установили, что Msx1 обеспечивает ранние и поздние функции развития зубов. В ранней фазе он действует эпистатически на Bmp4 в зубной мезенхиме на стадии шапочки. Msx1-индуцированный Bmp4 из зубной мезенхимы инструктирует лежащий поверх зубной эпителий формировать эмалевые узелки, которые являются ведущими в морфогенезе зубов [93, 110]. После стадии шапочки, развитие зубов становится независимым от функции Msx1. Во время поздней стадии цитодифференцировки Msx1 поддерживает жизнеспособность одонтобластов и зубной пульпы [109].

У людей и мышей потеря функции Msx1 вызывает не синдромальные расщепления вторичного нёба и агенезис зубов [95, 97, 103, 104]. До сих пор много спекуляций относительно роли Msx1 в развитии нёба. Считалось, что расщепление вторичного нёба у Msx1-дефицитных мышей происходит как следствие первичного дефекта в развитии зубов [18, 19, 103]. Однако, на трансгенных мышиных моделях, где промотор Msx1 управляет экспрессией человеческого гена Bmp4 в развивающихся зубах и нёбе на Msx1-/- фоне, выявлено устранение неонатальной летальности у некоторых мышей [62, 93, 108]. Все выжившие Msx1-/-/Tg мыши имели закрытоё нёбо, хотя у нх всё ещё отсутствовали зубы. Т.о., трансген м. специфически устранять расщепление нёба независимо от фенотипа зубов.

Msx1 экспрессируется в передней части мезенхимы развивающегося нёба с E11.5 до E13.5. Задние регионы развивающегося нёба не экспрессируют Msx1. Экспрессия Msx1 в нёбной мезенхиме слабая по сравнению с его экспрессией в зубной мезенхиме [62]. У нулевых Msx1 мутантных эмбрионов парные нёбные половинки поднимаются нормально, но не способны контактировать и сливаться [103]. Это результат значительно более низких уровней клеточной пролиферации в их передних частях, что ведет к нарушению роста [62]. Проверка уровней экспрессии генов показала существенное снижение уровней Bmp4 в нёбной мезенхиме, Shh в медиальном краевом эпителии и Bmp2 и в эпителии и в мезенхиме на ст. E13.5 у Msx1 мутантных эмбрионов. В результате трансгенного устранения расщепления нёба уровни экспрессии генов и пролиферации в передних частях нёба восстанавливались до нормы. Имплантационные эксперименты показали, что Msx1 непосредственно регулирует экспрессию Bmp4, тогда как его эффекты на Shh, Bmp2 и митогенез непрямые. Итак, Msx1 поддерживает рост передних чатей нёба во время его морфогенеза у млекопитающих.

Middle ear defects in Msx1-deficient mice

Msx1-дефицитные мыши обнаруживают аномалии развития malleus, одной из косточек среднего уха [103]. Молоточек оказывается короче, а его составная часть, отросток brevis, отсутствует у этих нулевых мутантов. Морфология остальных косточек среднего уха наковальни и стремени выглядит нормальной. Как и в случае зародышей зубов зачаток молоточка у мутантных эмбрионов обнаруживает снижение экспрессии Bmp4 [111]. Трансгенная экспрессия Bmp4 на мутантном Msx1 фоне не способна восстанавливать до нормы и выжившие мыши по-прежнему лишены отростка brevis, это позволяет измерять аудиторно вызываемые потенциалы для оценки функционального значения отростка brevis молоточка. Оказалось, что отросток brevis молоточка безразличен для передачи звука и баланса у мышей [111].

Craniofacial defects associated with Msx2 mutations

Роль Msx2 в черепнолицевом развитии первоначально была установлена с помощью мутаций в гена MSX2, вызывающих у людей Boston-типа краниосиностоз [112]. Бостонского типа краниосиностоз характеризуется преждевременным слиянием черепных костей и некоторыми аномалиями орофациальных костей. Эта мутация в гомеодомене MSX2 белка увеличивает своё связывающее сродство с ДНК и, как полагают, является мутацией с избыточной функцией [6, 112]. Напротив, гаплонедостаточность по MSX2 обусловливает дефекты краниальной срединной линии, проявляющиеся в появлении широко раскрытых родничков свода черепа [113]. Т.о., функция MSX2 необходима для нормального морфогенеза черепа и швов.

Выявлена видо-специфическая зависимость MSX2 от дозы. В то время как гаплонедостаточность MSX2 у людей вызывает теменное отверстие, гетерозиготные Msx2 мыши не обнаруживают аномального фенотипа [113, 114]. Напротив, гомозиготы по Msx2 обнаруживают отверстие в своюе черепа, сходное с таковыми у людей с гаплоднедостаточностью MSX2 [114]. Liu et al [115] показали, что мыши, имеющие миссенс мутацию в гомеодомене Msx2 обнаруживают краниосиностоз, сходный с таковым у мышей, с избыточной экспрессией аллеля дикого типа. И снова трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий MSX2 обнаруживают множественные черепнолицевые дефекты, включая экзэнецефалию [116].

Замена пролина на гистидин в положении 7 гомеодомена Msx2 усиливает сродство связывания Msx2 с его ДНК-мишенью, не нарушая специфичность места связывания, но увеличивая стабильность комплекса Msx2-ДНК [6, 117]. Результатом является усиление нормальной функции Msx2. Избыточная экспрессия и неправильная экспрессия Msx2 трансгена у мышей даёт сходный фенотип, характеризующийся выраженным ростом костей свода черепа и увеличением количества пролиферирующих остеобластов на остеогенном фронте [115, 118].

В нормально развивающемся черепе Msx2 необходим для поддержания пролиферирующей популяции предшественников остеобластов на остеогенном фронте [118]. Избыточная экспрессия Msx2 тормозит дифференцировку остеобластов, тогда как антисмысловое ингибирование способствует дифференцировке [119]. Уменьшение длины аксиального и appendicular скелета у Msx2 нулевых мышей указывает на его роль в регуляции пролиферации кость-формирующих клеток [120].

Временная и пространственная экспрессия Msx2 в мезенхиме швов и твердой мозговой оболочке до рождения, по-видимому, коррелирует с его ролью в регуляции patency швов во время пренатального развития. Продемонстрировано широко распространённое появление BMP4 в развивающихся швах, а также с его способность индуцировать Msx1 и Msx2 в швах in vitro [74]. более того, гены обычно экспрессируемые в окончательно дифференцированных остеобластах, такие как collagen-I и osteocalcin, ка было показано, регулируются с помощью Msx2 [54, 121, 122, 123]. Эти данные указывают на то, что модуляция генов Msx с помощью BMPs и др. факторов в развивающихся швах регулирует скорость дифференцировки остеобластов на продвигающихся остеогенных фронтах и тем самым остеогенез свода черепа. Итак, мутации вызывающие избыток и дефицит функции Msx2 вызывают черепнолицевые дефекты, это указывает на то, что точная регуляция экспрессии Msx2 на оптимальном уровне белка Msx2 является критической для развития черепнолицевых органов.

Msx1 and Msx2 function redundantly in craniofacial development

Подтверждается, что Msx1 и Msx2 функционально перекрываются. Исследования на биохимическом уровне показывают, что MSX1 и MSX2 имеют общие ДНК-связывающие и транскрипционные свойства [48]. Оба они распознают один и тот же консенсусный сайт ДНК и функционируют как репрессоры транскрипции. Далее, структурное сравнение показало, что Msx1 и Msx2 отличаются только одной аминокислотой в своих гомеодоменах. Пространственная и временная экспресссия Msx1 и Msx2 у мышей обнаруживает определенную степень ко-локализации. В соответствии с этим паттерном Msx1/Msx2 двойные мутантные мыши обладают синергичными дефектами развития в своде черепа, зубах, ушах, конечностях, волосяных фолликулах и молочных железах [90, 111, 114]. Если Msx2 одиночные мутанты обнаруживают или неполную или задержанную оссификацию костей свода черепа, но двойные мутантны мышей дефицитны по оссификации свода черепа. Относительно зубов, волосяных фолликулов и молочных желез Msx1 и Msx2 также обнаруживают функциональное перекрывание в течение всех стадий раннего органогенеза. Однако, участие Msx2 на ранних стадиях развития зубов, по-видимому, несущественно, т.к. гетерозиготные мыши по Msx1, но с отсутствием функционального Msx2 не обнаруживают дефектов развития зубов [90]. Потребность в Msx2 в развитии зубов выявляется на поздних стадиях органогенеза и сопровождается снижением экспрессии Msx1. Аномалии развития зубов у Msx2-дефицитных мышей выявляются на ст. E16.5, когда звёздчатый ретикулём и stratum intermedium оказываются неспособными развиваться нормально, приводя к дегенерации амелобластов и эмалевого органа. Предполагается, что Msx2 участвует в регуляции пространственно-временной экспрессии гена amelogenin во время развития зубов [124]. В отсутствие Msx1 фенотип мутантов Msx2 существенно тяжелее. Развитие молярных зубов останавливается на стадии зубной ламины у Msx1/Msx2 компаундных мутантов в отличие от Msx1-/- мышей, у которых остановка наблюдается на стадии почки [90, 103]. Т.о., на ст. инициации зубов Msx1 и временно экспрессируемый Msx2 функционируют, перекрываясь. Сходный аддитивные гипоморфизм обнаруживается в развивающемся среднем ухе компаундных Msx мутантов. Если у Msx1-/- мышей отсутствует отросток brevis, то двойные нулевые мыши по Msx1 и Msx2 генам лишены также и manubrium наряду с отростком brevis. У Msx1/Msx2 двойных мутантных мышей отмечается неспособность индукции волосяных фолликулов, в отличие от Msx2-/- мышей, у которых образуются pelage волоски, но теряются преждевременно благодаря дефектам поддержания волос [114, 125]. Сходным образом в отсутствие Msx1 и Msx2 эпителий молочных желез не инвагинирует, тогда как потеря только Msx2 вызывает на ст. sprout остановку развития молочных желез. Следовательно, потеря Msx1 и Msx2 вызывает более тяжелые фенотипы, чем потеря одного, любого из них. Функциональное перекрывание Msx1 и Msx2 обнаруживается и на примере деформаций конечностей, появляющихся у двойных нокаутных мышей [126]. В развивающихся конечностях таких мышей отсутствует передене-задня полярность, отсутствуют радиусы, существенно ингибирован апоптоз в межпальцевых промежутках и полидактилия [127]. Всё это подтверждает гипотезу функционального перекрывания генов Msx.

Conclusion

Members of the Msx homeobox gene family are among the critical factors involved in craniofacial development. These regulatory proteins function as tran-scriptional repressors and are involved in the modulation of craniofacial, limb and nervous system development. Of the three members, Msx1 and Msx2 have been given special consideration in this discussion because of their incontrovertible relevance to craniofacial morphogenesis. Loss-of-function and gain-of-function studies show that in mice as in humans Msx1 and Msx2 are required for normal craniofacial morphogenesis. Although there is a species-specific difference in the dosage requirements of Msx genes in humans and mice, both show similar phenotypes. Lastly we have considered the functional redundancy between Msx1 and Msx2 by comparisons of single, double, and compound mutant phenotypes which gives greater hypormorphism in organs where there is overlapping expression of the Msx genes. In summary, recent advances have revealed important roles for Msx genes in embryogenesis as well as the functional pro-perties of Msx proteins. It would be of great interest to identify the direct downstream target genes of Msx proteins in vivo and their associated cellular processes including proliferation, apoptosis, cell adhesion and migration during organogenesis

Msx homeobox gene family and craniofacial developmentSylvia ALAPPAT, Zun Yi ZHANG, Yi Ping CHENCell Research (2003); 13(6):429-442

Msx homeobox gene family and craniofacial development
Sylvia ALAPPAT, Zun Yi ZHANG, Yi Ping CHEN
Cell Research (2003); 13(6):429-442