Ремоделирование временных симметричных эмбриональных артерий аортальных дуг в дефинитивный взрослый левосторонний сосудистый паттерн аортальной дуги использует асимметрично запрограммированную регрессию и персистенцию специфических артерий дуги (Рис. 1). Финальное расположение и морфология этих крупных сосудов нуждается в реципрокной передаче сигналов между эндотелиальными клетками, выстилающими артерии фарингеальных дуг (Yanagisawa et al., 1998), окружающими гладкими мышцами, происходящими из НГ, и мезенхимой (Le Lievre, Le Douarin, 1975; Fishman, Kirby, 1998) и энтодермой (Wendling et al., 2000; Vitelli et al., 2002). Кроме того, хотя недавно идентифицированное переднее сердце-образующее поле даёт миокард и тракта оттока (Kelly, Bickingham, 2002) и правого желудочка (Cai et al., 2003), но на сегодня неясно, могут ли аномалии внутри этой внекардиальной популяции клеток также влиять на морфогенез НГ. Независимо от эффектов на НГ эта популяция клеток, скорее всего, играет роль в патогенезе дефектов тракта оттока. Аномальное ремоделирование лежит в основе широкого круга врожденных пороков сердца, включая: РТА, coarctation и разрыв дуги аорты, двойную дугу аорты, правую дугу аорты и аномальное происхождение правой подключичной артерии. РТА возникает, когда артериальный ствол не способен разделиться, чтобы сформировать отдельную пульмональную артерию и аорту. Пациенты с DoGeorge (1/4000 живорожденных) - которые имеют hypocalcemia; дефективный тимус-зависимый клеточный иммунитет; аномалии лица, ушей, нёба; прерванную (interrupted) дугу аорты; дефекты тракта оттока; или до некоторой степени аннулированная (overriding) артерия - часто имеет аномалии производных НГ третьей, четвертой и шестой аортальных дуг (Epstein, Buck, 2000). Большинство пациентов являются гемизиготами по делеции chr.22q11. Гены внутри "минимальной критической области" интенсивно изучаются; более того, некоторые из них играют роль в развитии тракта оттока (Momma et al., 1999; Lindsay, Baldini, 2001). Напротив, сходные делеции у мышей не воспроизводят полностью синдрома, указывая на то, что синдром DiGeorge является мультифакториальным и что вклад НГ в разные аберрантные ткани сложен и что м. существовать др. нижестоящие гены, которые являются важными эффекторами (Epstein, Buck, 2000). Несмотря на присутствие множества различных мутантных модельных мышей, с аномалиями развития артерий аортальных дуг (некоторые внутри DiGeorge области), точная роль кардиального НГ в сердечно-сосудистом развитии ещё до конца неясна (Olson, Srivastava, 1996; Maschhoff, Baldwin, 2000). Кроме того, точная роль, которую играет кардиальный НГ внутри сердца, ещё недостаточно ясна.
Кардиальный НГ формируется внутри нейральных складок задней части ромбэнцефалона в месте соединения нейроэктодермы и эктодермы (LaBonne, Bronner-Fraser, 1999) и между отической плакодой (слуховой плакодой) и 4-м сомитом (Creazzo et al., 1998). На 8.0-8.5 days postcoitus (
dpc) у мышей кардиальный НГ подвергается эпителиально-мезенхимномой трансформации и мигрирует вентрально вдоль специфических путей в третью, четвёртую и шестую дуги. Дуги первоначально состоят из мезенхимы (мезодермального происхождения), окружены с внешней стороны эктодермой, а с внутренней энтодермой. После колонизации клетками НГ, большая часть мезенхимы оказывается происходящей из НГ отдельно от оригинального мезодермального стержня, который лежит рядом с артериями аортальных дуг (Jiang et al., 2000) Мезенхима, производная НГ, постепенно конденсируется и дифференцируется в фиброзную соединительную ткань, которая вносит вклад в сосудистую стабилизацию крупных артерий (Maschhoff, Baldwin, 2000), тогда как др. клетки НГ занимают кардиальные ганглии (Waldo et al., 1999b). Имеются доказательства, что разные ступени морфогенеза НГ зависят от межклеточной и клетка-матрикс адгезии (Erickson, Perris, 1993; Henderson ( Copp, 1997). Однако, роль и влияние клеток НГ по достижении ими дуг остаются неясными. Изучение клеточной судьбы с использованием трансгенной cre/loxP клеточной маркирующей техники продемонстрировало, что присутствие или отсутствие клеток НГ не существенно влияет на ремоделирование, т.к. отсутствуют видимые отличия в распределении артерий, которые персистируют или регрессируют (Jiang et al., 2000) Следовательно, необходимы разные лево-правосторонние сигналы для ремоделирования, которые д. вноситься при колонизации клетками НГ или д. присутствовать внутри стержневой мезенхимы, эндотелиальных клетках, выстилающих артерии дуг или внутри энтодермы глоточных карманов/щелей. Происхождение и идентификация этих сигналов сегодня неизвестны, но они м.б. связаны с уровнями и передачей сигналов ретиноевой кислоты (Iulianella, Lohnes, 2002) или дифференциальной активностью ионных каналов (
polycystin-2)(Pennekamp et al., 2002), которые обеспечивают однонаправленный перенос через щелевые соединения, давая в результате асимметричную экспрессию генов (Mercola, Levin, 2001) На сегодня известен только
pitx2 (Liu et al., 2001) с асимметричной экспрессией в мезодерме бранхиальных дуг, известно также, что изоформ-специфичная делеция
pitx2 вызывает аномальное формирование паттерна сосудов аортальной дуги (Liu et al., 2002). Некоторые клетки НГ продолжают мигрировать в тракт оттока, где они занимают конотрункальные подушки (Conway et al., 1997a, 1997b; Crezzo et al., 1998). Достигнув подушек тракта оттока клетки кардиального НГ предположительно вовлекаются в слияние и последующую миокардиализацию проксимальной части тракта оттока, становясь мышечной перегородкой тракта оттока сердца (van den Hoff et al., 1999). Клетки НГ из той же самой области мышиной нервной трубки также дают клетки тимуса, щитовидной и паращитовидных желёз (Jiang et al., 2000; Epstein et al., 2000). Некоторая информация о клеточных процессах получена в экспериментах с манипуляциями эмбрионами кур (Creazzo et al., 1998) и из генетических процессов на мутантах мышей, рыбок данио и Xenopus (Srivastava, 2001). У эмбрионов кур удаление нейральной складки/НГ (Creazzo et al., 1998),
Hox антисмысловые эксперименты (Kirby et al., 1997), тератогенные воздействия ретиноевой кислоты (Broekhuizen et al., 1998) и гемодинамические пертурбации (Hogers et al., 1999) все они вызывают аномалии четвёртой и шестой дуг. Сходным образом у мышей тератогенные воздействия haloacetic кислоты (Ргтеук уе al., 1996), этанола (Sulik et al., 1986) и ретиноевой кислоты вызывают аномалии дуг.
Coordinated NC-derived Mesenchyme Differentiation is Required for Remodeling of the Outfliw Tract Septation
Мутационный анализ идентифицировал большое количество генов, необходимых для морфогенетических и индуктивных процессов, связанных с кардиальным НГ мышей (Creazzo et al., 1998; Epstein, Buck, 2000); Srivastava, 2001). Эти гены, по-видимому, участвуют в разных путях, действующих или параллельно или последовательно, но нет на сегодня простого пути, унифицирующего все имеющиеся данные. Некоторые гены, включая
pax2, экспрессируются в мигрирующих клетках кардиального НГ, т.к. они перемещаются в позиции крупных сосудов и тракте оттока, где они дифференцируются в гладкие мышцы и соединительную ткань (Conway et al., 1997a, 2000). Известно, что эти взаимодействия и программирование кардиального НГ обеспечивается транскрипционными факторами, включая
Mf1/Mf1, HAND1/HAND2, Tbx/др. гены на хромосоме 22q11 человека (Winnier et al., 1999; Srivastava, 2001; Merscher et al., 2001). Др. набор генов экспрессируется внутри собственно развивающейся васкулатуры и м. играть роль в формировании, стабилизации и ремоделировании сосудов (напр., VEGF-A,(Carmeliet, 1996);
neuropilin-1) или внутри взаимодействующих мезенхимных клеток (напр., MEF2C, (Lin et al., 1998);
tissue factor (Carmeliet et al., 1996)), это ведет к идее, что контроль сборки васкулатуры располагается внутри мезенхимы, происходящей из НГ и формирующей соединительную ткань. В подтверждение этих реципрокных взаимодействий Noden (1989)получил сходные результаты, используя трансплантации перепел-курица. Важно, что мутанты VEGF
120/120 и VEGF
188/188 (Stalmans et al., 2003) имеют разнообразные сложные дефекты аортальных дуг и примерно 50% VEGF
188/188 эмбрионов погибает in utero из-за полного отсутствия васкулатуры ещё до миграции НГ, но примерно 50% VEGF
120/120 мутантов или лишены ductus arteriosus (неспособность персистировать левой 6-й дуги), а нисходящая аорта аномально расположена справа или у них имеется двойная дуга (неспособность ремоделирования правой 4-й дуги). Установлено, что формирование и миграция НГ не являются ответственными за генерацию мутантного фенотипа; вместо этого экспрессия VEGF
120/164-188 внутри энтодермы аортальных дуг нуждается в привлечении
neurophilin-1-позитивных клеток (как эндотелиальных, так и происходящих из НГ), как для стимуляции врастания артерий дуг, так и для их поддержания (Stalmans et al., 2003). Наконец, имеется ещё один набор генов, которые экспрессируются в самих глоточных дугах и м. играть роль в обеспечении взаимодействий между эпителием дуг (эктодерма и энтодерма), мезенхимой и эндотелиальными сосудами (
endothelin-1, (Kurihara et al., 1995);
Ece-1 (Clouthier et al., 1998);
EtA (Yanagisawa et al., 1998);
semaphorin3c, (Feiner et al., 2001)). Итак, клетки кардиального НГ м. обеспечивать структурную интеграцию и м. нести инструктивные сигналы, необходимые для ремоделирования аортальных дуг. Нарушение передачи этих сигналов ведет к дефектам во взаимодействиях между постмиграторными клетками кардиального НГ и эндотелием магистральных сосудов и тракта оттока. Всё это подтверждает модель, согласно которой эпителий/эндотелий дуг передаёт сигналы мезенхиме, производной НГ (возможно посредством процессинга
ЕТ-1, semaphorin и/или
VEGF), м.б. посредством щелевых соединений. Однако, в точности неясно, какова функция клеток НГ внутри дуг и тракта оттока, как они дифференцируются в соединительную ткань и сколь широк набор функций транскрипционных факторов, действующих в унисон, и какие гены ответственны за разнообразные обусловленные НГ сигналы дифференцировки.
Understanding the Role of Transcriptional Regulation within the Cardiac Neural Crest
Хотя известен ряд транскрипционных факторов, экспрессирующихся в клетках кардиального НГ, которые проникают в сердце, а мутации и устранение экспрессии таких генов вызывает фенотипические дефекты, но молекулярные механизмы, которые приводят к тками фенотипическим исходам в основном неизвестны.
Известно, что многие из этих транскрипционных факторов, которые экспрессируются, а в некоторых случаях и играют роль в собственно спецификации, экспансии, миграции и дифференцировке, экспрессируются также и в клетках, не происходящих из НГ. Кстати, только спецификация и дифференцировка глаз и скелетных мышечных клеток ассоциирована с экспрессией "master regulatory" транскрипционных факторов. Эти гены, когда экспрессируются в эктопических условиях, м. в изоляции давать полностью сформированные глаза (Halder et al., 1995; Wawersik, Maas, 2000) или в тканевой культуре м. инициировать программу скелетных мышц (Olson, 1993; Olson, Klein, 1994). Спецификация и дифференцировка клеток остальных эмбриональных тканей наиболее вероятно покоится на комбинаторых взаимодействиях между множественными ограниченными тканью и генеральными транскрипционными факторами, которые коллективно через точные взаимодействия формируют уникальные транскрипционные комплексы, которые предопределяют и управляют генетическими программами таких типов клеток, как кардиальный НГ (Firulli, Olson, 1997). Во многих случаях, таких как транскрипционные факторы семейства белков basic helix-loop-helix (bHLH), природа взаимодействий (димеризация) очевидна. В др. примерах, таких как Рах транскрипционные факторы, зависимость от межбелковых взаимодействий не столь очевидна; однако, т.к. Рах белки содержат и paired домен и helix-turn-helix мотив, то связывание ДНК с разными последовательностями цис-мишеней является скорее всего ключевым регулятором переключения для активации специфических транскрипционных программ. Если комбинаторная модель экспрессии ткане-специфических генов верна, то тогда центральным становится вопрос, являются ли конечные фенотипы, наблюдаемые при "нулевых" аллелях действительно отражением потери одного белка? Возникают также вопросы: какие транскрипционные факторы коэкспрессируются внутри НГ и взаимодействуют? Каковы посттрасляционные модификации, которые изменяют транскрипционную активность/локализацию/димеризацию и заставляют факторы вступать или не вступать в игру? И, наконец, как альтерации стоихометрии определеного транскрипционного фактора изменяют мультибелковые транскрипционные комплексы, управляющие тканевой специфичностью?
The Paired-Box Transcriorion Factors
9 Рах белков найдено у всех высших эукариот, они принадлежат семейству транскрипционных регуляторов, участвующих во многих онтогенетических процессах. Подсемейства
рах3 и рах7 необычны, т.к. они кодируют белки с двумя ДНК-связывающими доменами, paired доменом и гомеодоменом. Домен paired состоит из двух частей, из двух helix-turn-helix мотивов, тогда как гомеодомен сам по себе способен формировать и гомо- и гетеродимеры на ДНК. Т.о., Рах3 и Рах7 белки используют множественные комбинации из трёх отдельных мотивов, распознающих ДНК и эффективно осуществлять контроль транскрипции (Jun, Desplan, 1996; Miskiewicz et al., 1996). Гомеодомен важен для связывания ДНК и для осуществления транскрипционного контроля. Т.о., отсутствие Рах белков скорее всего будет приводить к широкомасштабным аномалиям, а мутации внутри любого ДНК-связывающего мотива будут вызывать структурные изменения внутри гомеодомена, что будет или нарушать специфичность связывания ДНК этим гомеодоменом или будет редуцировать сродство Рах3 белка к ДНК. Более того, Рах3 и Рах7 дифференциально метилируются; область гена, которая кодирует домен paired, гипометилирована, тогда как область, которая кодирует гомеодомен гиперметилирована (Ziman, Kay, 1998).
Фенотипические последствия неправильной регуляции Рах3 хорошо известны; однако, действительные молекулярные пути, которые нарушаются при мутациях
рах3, изучены недостаточно. Имеется ряд
рах3 мутаций у мышей, которые наз.
splotch мутациями. Известно 5 аллелей
splotch транскрипционного фактора рах3, два из этих аллелей (
sp и sp2H) являются хорошо охарактеризованной моделью дефектов аортальных дуг и тракта оттока (Рис. 1) (Conway et al., 1997a, b; Epstein, Buck, 2000; Conway et al., 2000). Однако, молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза этих дефектов остаются в основном неизвестными в основном из-за отсутствия известных ниже стоящих эффекторных генов и неясности, какую роль играет Рах3 внутри самих клеток НГ.
Рах3 необычные среди семейства, т.к. является преимущественно негативным регулятором генов-мишеней (Chalepakis et al., 1994a). Это указывает на то, что нижестоящие мишени
pax3 скорее всего репрессируются в нормальных условиях, а
sp2H мутантных Рах3 белок обусловливает аномальную избыточную экспрессию. Разные
splotch аллели нарушают ген
рах3 разными путями (Chalepakis et al., 1994фби) и скорее всего каждая мутация обусловливает потерю некоторой части или всей функции гена
рах3 по контролю экспрессии нижестоящих генов.
Гомозиготы
sp2H погибают
in utero из-за присутствия РТА с обязательным околомембранозным VSD (Conway et al., 1997фбибсж Franz 1989). Патогенез дефекта обусловлен неспособностью персистировать левой 6-й артерии дуги, которая обычно даёт пульмональный ствол. Т.о., аномальная регрессия на 11.0
dpc левой шестой аортальной артерии является первым анатомическим дефектом, присутствующим у мутантов
sp2H в сердечно-сосудистой системе и является тем местом, в котором последствия аномального развития кардиального НГ были впервые выявлены. Кроме того, эмбрионы
sp2H имеют дефекты закрытия нервной трубки (spina bifida, exencephaly), меланоцитов и отсутствие мускулатуры конечностей (Dickmam et al., 1999; Schubert et al., 2001). мРНК
рах3 экспрессируется внутри нервной трубки, миграторных клетках НГ и в их производных (таких как тимус, щитовидная железа, ганглии дорсальных корешков, сомиты и меланоциты (Goulding et al., 1993) - все эти структуры аномальны у гомозигот
sp2H. У людей мутации
РАХ3 ведут к синдрому Waardenburg, аутосомно доминантному нарушению, с дефектами тканей, производных НГ, которые проявляются нарушениями пигментации, слуха и лице-скелетными аномалиями (Tassabehji et al., 1995)/ Rghlbfkmyst дефекты также описаны у детей с синд. Waardenburg (Bamerjee, 1986; Mathieu et al., 1990). Мутанты
sp2H содержат делецию в гомеодомене гена
рах3 (Epstein et al., 1991). Эта делеция ведет к образованию стоп кодона, так что С-терминальная часть гомеодомена отсутствует в зрелом белке. Изучение ДНК-связывания
in vitro показали, что белок
sp2H Рах3 со структурой, сходной с предсказанной укороченной, обладает редуцированной гомеобоксной активностью по связыванию ДНК, с изменённой специфичностью в отношении последовательностей мишени (Chalepakis et al., 1994a). N/r/ бокс paired неизменён у
sp2H, то белок преимущественно связывается с paired box консенсусными последовательностями (GTTCC). Более того, т.к. димеризация Рах3 м. происходить посредством гомеодомена, то потеря домена будет скорее всего изменять важные межбелковые взаимодействия, необходимые для Рах3-обусловленной экспрессии генов.
Др. spotch мутация
sp имеет АТ трансверсию в сплайс-акцепторном сайте, что приводит в результате к появлению 4-х аберрантных транскриптов (Epstein et al., 1993), которые вряд ли продуцируют функциональные Рах3 белки. Предполагается, что
sp мутации являются нулевым аллелем. Это подтверждено с помощью целенаправленного получения делеций
рах3, воспроизводящих фенотип
sp (Mansouri et al., 2001).
Хотя клетки НГ
sp2H и начинают миграцию, но они не достигают бранхиальных дуг или тракта оттока в достаточных количествах для ремоделирования аортальных дуг или разделения тракта оттока (Serbedzija, McMahon, 1997; Conway et al., 1997a; Epstein et al., 2000). Более того? это отсутствие колонизации клетками кардиального НГ обусловливает аномальное распространение стволовых клеток НГ (Conway et al., 2000). Помимо этого, имеется экспрессия на низком уровне
рах3 в сердце дикого типа на ст. 9.5
dpc и 100% гомозиготных мутантных эмбрионов погибает на 14.0
dpc исключительно из-за присутствия РТА/VSD аномалий (Conway et al., 1997a,b), а не обусловлено дефектами нервной трубки. Неожиданным явилось то, что недостаточность миокардиальной функции в дальнейшем ведет к компромиссу функции сердца, т.к. имеется аномальное возбуждение-контракция (exitation-contraction, EC) купирование у
sp2H мутантов (Conway et al., 1997b) и аномально истончённый миокард у
sp мутантов (Li et al., 1999), что приводит к летальности
in utero примерно на 14
dpc. Было предположено, что эти дефекты миокарда являются непрямым следствием снижения количества мигрирующих клеток НГ (Kwang et al., 2002),т.к. эти клетки, как полагают, не вносят вклада в миокард (Jiang et al., 2000). Однако, Kirby et al., (1997) показали, что устранение премиграторного кардиального НГ у эмбрионов кур вызывает дисфункцию миокарда ещё до достижения клеток кардиального НГ сердца, и было предположено, что эти ранние эффекты на сердце обусловлены продолжительным высвобождением факторов (FGFs и др.) фарингеальной энтодермой, которая обычно участвует в индукции кардиальной мезодермы (Waldo et al., 1999a). Кроме того, экспрессия
Lbx1 гомеобоксного гена, который экспрессируется в субпопуляции клеток кардиального НГ, усиливается в сердце
Lbx1 null/sp1H/sp1H мышей, указывая тем самым, что Рах3 и Lbx1 участвуют в негативной регуляторной петле обратной связи, которая м.б. необходима для нормальной дифференцировки и функции миокарда во время раннего развития сердца (Schafer et al., 2003). Т.о., интересно отметить, что
рах3 производные клетки (маркированные посредством трансген Cre/loxP и ROSA26R технологии) дают популяцию клеток, присутствующих внутри сердца мыши на ст. 13
dpc (Li et al., 2000). Наконец, Cre/loxP делеция
BMP receptor 1A в кардиальном НГ показывает, что передача сигналов
bmp2/4 в производных НГ существенна для развития тракта оттока и м. регулировать критический пролиферативный сигнал для вентрикулярного миокарда (Stottmann et al., 2004). Т.о., хотя и ясно, что дефицит кардиального НГ ведет к дефектному ремоделированию артерий аортальных дуг и к неспособности разделения тракта оттока, было бы интересно определить точную роль, которую клетки кардиального НГ играют в кардиомиоцитах самого сердца.
Существенно, что
рах3-FKHR knock-in гетерозиготные мыши не жизнеспособны и все погибают примерно при рождении из-за сердечной недостаточности (Lagutina et al., 2002). Alveolar rhabdomyosarcoma, ассоциированая с хромосомной транслокацией t(2;13), обусловлена слиянием
РАХ3 (и РАХ7) на хромосоме 2 с FKHR геном на хромосоме 13 (Anderson et al., 2001). Возникающие в результате слитые белки содержат N-терминальную область белка
рах, слитого с С-терминальным трансактивационным доменом FKHR. Исследования подтвердили, что ассоциированный с опухолями
pax3-FKHR белок м. интерферировать с нормальными
pax3 онтогенетическими функциями (Anderson et al., 2001), а анализ
pax3-FKHR knock-in гетерозигот показал, что они имеют VSD, в основном увеличенную перегородку, расширенный тракт оттока, и погибают при рождении, но не имеют опухолей (Lagutina et al., 2002). Также печень плода наливается кровью, а лёгкие неспособны расправляться , все классические признаки сердечной недостаточности (Conway et al., 1997c). Сегодня неясно, способно ли
pax3-FKHR knock-in действовать как "доминантно-негативная" мутация, затрагивающая сердце (т.к сам
рах3 не участвует в морфогенезе миокарда) или всё-таки мутация в
рах3 непосредственно затрагивает сердце (т.к.
рах3 мРНК обнаружима на 10.5
dpc в фарингеальных дугах, а белок Рах3 обнаружен в сердце на ст. 16.5
dpc). Следует отметить, что и
pax3-FKHR knock-in и
sp2H мутации лишены С-терминалной части гомеодомена, который моделирует ДНК-связывающую активность/димеризацию гомобокса и тем самым м. модулировать рах3 специфичность в отношении его отдельных последовательностей мишеней (Chalepakis et al., 1994b). Учитывая эти комбинированные данные было бы интересно определить, играет ли первичную и/или вторичную роль кардиальный НГ во время морфогенеза кардиомиоцитов.
Кардиальный фенотип
sp м.б. нормализован с помощью избыточной экспрессии трансгена
рах3 под контролем в 1.6 т.п.н. "neural tube/NC-specific" Pax3 промотора, который не экспрессируется внутри сомитов (Li et al., 1999). Transgenic/
sp гомозиготы доживают до рождения, когда они становятся жертвами респираторной недостаточности, вторичной к отсутствию мышечной диафрагмы; мышцы конечностей также отсутствуют.
Рах3-дефицитные сомиты способны поддерживать собственно миграцию и функцию клеток НГ, указывая тем самым на клеточно автономную роль
рах3 в морфогенезе НГ. Однако, Mansouri et al. (2001), использовали эмбиональные стволовые клетки (ES) для генерации lacZ knock-in в локусе
рах3. Было установлено, что
pах3 функция существенна для нейроэпителия (нейроэктодермы) и сомитов, но дикого типа среда нормализует
pax3 knock-in нулевые клетки НГ, указывая тем самым, что
рах3 не действует клеточно автономно во время миграции клеток НГ.
Хотя было рассмотрено несколько кандидатов на роль нижестоящих генов, регулируемых
рах3, только в отношении одного выявлено его участие в патогенезе пороков сердца у мутантов
splotch. Неожиданно оказалось, что потеря
msx2 нормализует кардиальные дефекты
sp, а также дефект ы в ганглиях дорсальных корешков, тимусе и щитовидной железе (Kwang et al., 2002). Оба эндогенных гена
msx2 и трансгены, представленные фрагментами промотора
msx2, слитого с lacZ репортерным геном, усиливают свою активность у
sp гомозигот, указывая тем самым, что
msx2 негативно регулируется с помощью
рах3. Мутации
рах3-связывающего сайта в промоторе
msx2, усиливают экспрессию трансгена
msx2 и подтверждают, что
рах3 непосредственно репрессирует транскрипцию
msx2. Интересно, что домены экспрессии
рах3, msx1, msx2 перекрываются только в нервной трубке, но не в аортальных дугах или самом сердце, т.к. только
msx2 экспрессируется внутри развивающегося сердца - особенно в проводящей системе (Chan-Thomas et al., 1993). Нулевые
msx1 мутанты демонстрируют, что msx1 необходим для развития молярных зубов и нёба (Chen et al., 1996), а отсутствие
msx2 даёт дефекты костей свода черепа, зубов, кожи и молочных желез, ни у одного из мутантов не не выявлено середечно-сосудистых дефектов Msx1/msx2 двойные гомозиготные мутанты погибают
in utero на 16
dpc от тяжелых дефектов развития краниального НГ при отсутствии дефектов сердца (Satokata et al., 2000). Т.о., механизм, с помощью которого потеря
msx2 устраняет пороки сердца мутантов
sp, неизвестен, но возможно рах2/msx2 необходимы в соединении для контроля экспансии/дифференцировки популяции НГ внутри нервной трубки, т.к. избыточная экспрессия
msx2 обусловливает гиперпролиферацию (Wang et al., 1999) и ингибирование дифференцировки (Dodig et al., 1999). Согласно альтернативной гипотезе
рах3 и
msx2 v/,/ rj-регуляторами общих транскрипционных мишеней, причём мутации в
рах3 будут вызывать аномальную регуляцию этих генов из-за несоотв. взаимодействий. Следовательно, потеря
msx2 просто устраняет способность сталкиваться с этими повреждающими взаимодействиями. Если предполагать, что
рах3 и msx2 не обязательны для активации генов мишеней, то эта модель хорошо согласуется с предположением, что мутантные Рах3 взаимодействия с др. белками дикого типа обусловливают многие из наблюдаемых аномальных фенотипических исходов.
HAND bHLH Transcription Factors
Факторы HAND относятся к В классу bHLH белков и больше всего схожи с
twist-подобными bHLH генами (Firulli, 2003). Подобно bHLH белкам факторы HAND функционируют как димеры, чтобы соединяться с канонической последовательностью CANNTG, которая заканчивается в Е-боксе (Hollenberg et al., 1995; Dai, Cserjesi, 2002). HAND1 и HAND2 факторы экспрессируются вряде тканей во время развития мыши, включая латеральную мезодерму, материнского происхождения decidua, сердце и кардиальный НГ, который заселяет бранхиальные дуги и тракт оттока (Рис. 2) (Firulli, 2003). Оба были нокаутированы у мышей (Srivastava et al., 1997; Firulli et al., 1998; Riley et al., 1998). Эффект потери
HAND1 на кардиальный НГ нельзя опредеить, т.к.
HAND1 мыши погибают между 8.0 и 9.0
dpc (Firulli et al., 1998; Riley et al., 1998).
HAND2 нулевые мыши погибают между 9.5-10.5
dpc имеют гипопластичные первую и вторую дуги из-за апоптоза и не способные к образованию третью и четвёртую дуги (Srivastyava et al., 1997; Thomas et al., 1998).
Молекулярный анализ HAND2-/- мышей выявил, что большинство производных НГ компонентов бранхиальных дуг присутствует, подтверждая нормальную миграцию клеток НГ. Экспрессия
HAND1 и HAND2 внутри клеток НГ, заселяющих бранхиальные дуги, частично регулируется сигналами
ЕТ-1 (Thomas et al., 1998; Clouthier et al., 2000).
ET-1 нулевые мыши фенотипически сходны с признаками CATCH-22 у людей (кардиальные дефекты, аномальное лицо, гипоплазия тимуса, расщепление нёба и гипокальцемия, ассоциированные с микроделецией хромосомы 22) и обнаруживают подавление и
HAND1 и HAND2 в бранхиальных дугах (Thomas eе al., 1998; Clouthier et al., 2000). Регуляция с помощью
ET-1 факторов HAND эволюционно законсервирована. Транскрипция
HAND2 у мышей обеспечивается за счёт действия
Distall-less класса гомеодоменового транскрипционного фактора
Dlx6 (Miller et al., 2000; Charite et al., 2001). Целенаправленное разрушение
HAND2 brachial arch enhancer вызывает потерю экспрессии
HAND2 в первой и второй бранхиальных дугах, что приводит к возникновению ряда черепно-лицевых аномалий (Yanagisawa et al., 2003). Необходимо отметить, что экспрессия
HAND2 в вентральном домене бранхиальных дуг поддерживается у этих модельных мышей , также как и экспрессия
HAND2 в клетках кардиального НГ, которые заполняют тракт оттока (Yanagisawa et al., 2003). Дальнейший анализ промотора
HAND2 или генерация
HAND2 и HAND1 условных аллелей необходимы для исследования кардиального НГ у HAND "нулевых" фенотипов, хотя базируясь на дефектах, наблюдаемых при делециях черепно-лицевой части НГ, дефекты кардиального НГ скорее всего уже встречались.
В дополнение к онтогенетическим исследованиям пролит свет и на молекулярные механизмы. Экспрессия
HAND1 и HAND2 в клетках НГ птиц м. направлять эти клетки на путь катехоламинергических нейронов (Howard et al., 1999). Контроль димеризации факторов HAND ассоциирует с изменениями программы транскрипции HAND, такой контроль димеризации, скорее всего, играет роль в собственно спецификации и дифференцировке кардиального НГ (Firulli et al., 2003). Исходная модель функции bHLH дедуцирована из исследований миогенных bHLH белков, согласно ей тканеспецифический класса В bHLH фактор действует совместно с повсеместно экспрессирующимся класса А- или Е-белком, чтобы соединяться с ДНК и модулировать транскрипцию (Massari, Murre, 2000). Хотя эта модель определенно верна, HAND1 и HAND2 обладают смешанной способностью димеризоваться с самими собой и др. факторами класса В bHLH (Firulli et al., 2000, 2003). Если рассматривать коэкспрессию HAND1 и HAND2 (Рис. 2) и перекрывающуюся экспрессию с др. bHLH белками, то м.б. выявлен широкий пул возможных димеров HAND. Это указывает на то, что пул bHLH димеров в кардиальном НГ м.б. тщательно сбалансирован, так что некоторые HAND димеры м. функционировать как активаторы в одной генетической программе, тогда как др. HAND димеры м. одновременно функционировать как репрессоры. Эта гипотеза рождает вопросы: каковы мол. механизмы (помимо экспрессии), которые облегчают выбор димеризации HAND в кардиальном НГ? Посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, м. драматически изменять функцию соединения bHLH с ДНК (Li et al., 1992a,b), а гомоцистеиновые дисульфидные связи м. стабилизировать Е-протеиновые гомодимеры в развивающихся клетках крови (Benezra, 1994; Markus, Benezra, 1999). Недавно мы показали, что димеризация HAND факторов частично регулируется с помощью фосфорилирования треонина и серина, расположенных в helix I домене bHLH (Firilli et al., 2003). Эти остатки фосфорилируются с помощью РКА и РКС. Дефосфорилирование этих остатков обеспечивается с помощью protein phosphatase 2A (PP2A), которая содержит специфическую регуляторную субъединицу В56δ. Экспериментальные данные показывают, что коэкспрессия HAND1 с постоянно активной РКА усиливает специфическое фосфорилирование ряда пептидов. Тогда как коэкспрессия не взаимодействующей с HAND РР2А регуляторной субъединицей В56δ, не оказывает влияния на фосфорилирование HAND1, а коэкспрессия В56δ с РКА и HAND1 вызывает специфической дефосфорилирование HAND1 (Firulli et al., 2003). Сходные находки сделаны в отношении фосфорилирования HAND2. Функциональными последствиями фосфорилирования этих остатков является изменение сродства димеризации с проспективными bHLH партнёрами (Firulli et al., 2003). Эксперименты, проведенные на развивающихся конечностях цыплят показали, что биологическая функция HAND1 затрагивается изменениями в этих ключевых регуляторных остатках, т.к. мутации и гипофосфорилирования и фосфорилирования в HAND1 дают разные фенотипические исходы по сравнению с экспрессией дикого типа HAND в конечностях.
Вполне возможно, что факторы HAND регулируются сходным образом во время спецификации и дифференцировки кардиального НГ.
If Transcription Factors Interact, What is a Null Phenotype?
В случае транскрипционного фактора очевидна причина нарушения транскрипционного контроля нижестоящих генов мишеней. Если же транскрипционный фактор не экспрессируется, то он не будут соединяться с ДНК, а , следовательно, не будет активировать/репрессировать гены, находящиеся под его регуляцией. В случае факторов bHLH сценарий более сложной. Рассматривая смешанные профили димеризации, осуществляемые HAND1 и HAND2, делеция гена фактора HAND не только элиминирует его прямое участие в транскрипционной регуляции его нижестоящих мишеней, но и его отсутствие обусловливает также сдвиг в стоихометрии bHLH факторов внутри клетки, это м. приводить в результате к формированию несоответствующих димеров между оставшимися bHLH белками внутри пула. Такие димеры м. неправильно регулировать HAND нижестоящие мишени или м. активировать альтернативные генетические программы, обусловливая фенотипическую неудачу более обширную, чем просто нулевой фенотип. Напр., рассмотрим нокаут HAND2 branchial arch enhancer, который редуцирует и первую и вторую бранхиальные дуги (Yanagisawa et al., 2003). В дополненеие к Е-белкам, bHLH фактор HAND1 и m-twist частично ко-экспрессируются с HAND2 в первой бранхиальной дуге. Потеря HAND2 в первой дуге меняет равновесие между HAND1, Twist1 и Е-факторами, приводя к образованию нового пула димеров, в результате HAND1, Twist1 и Е-белковые гомо- и гетеродимеры будут модулировать разные транскрипционные инструкции, которые м. вызывать клеточную гибель, респецификацию и/или усиление/снижение роста. Эта модель подтверждается сообщением, что Twist1 м. функционировать как гомодимер или Е-белковый гетеродимер и что Twist1, HAND1 и HAND2 м. формировать гетеродимеры при ко-экспрессии (Castanon et al., 2001; Firulli et al., submitted date).
Если рассматривать не-bHLH факторы, такие как Рах3, то м.б. приложим сходный механизм. Более того, Рах белки м. распознавать два отдельных
цис-элемента, paired и гомеобокс. Регуляция того, какой
цис-элемент будет преимущественно связываться, также является ключевым фактором в предопределнии специфического транскрипционного ответа. Делеция гомеодомена
рах3 предупреждает Рах3 от непосредственной связи с гомеодомен-зависимыми транскрипционными мишенями. Межбелковые взаимодействия также нарушаются, что делает предполагаемые партнёры Рах3 свободными от их взаимодействий и приводит к регуляции транскрипции несоотв. образом. Если же взаимодействия с Рах3 не нарушены, то эти факторы м.б. оттитрованы прочь от промотор-зависимого связывания Рах3 с ДНК. В случае
msx2 нулевых мышей, помещенных на
sp фон, наблюдаемые кардиальные дефекты устраняются. Т.к.
msx2 нули ( как и msx1/msx2 двойные нули) не обнаруживают кардиального фенотипа, то нормализацию фенотипа
sp трудно понять не учитывая биохимические взаимодействия. Если экспансия/дифференцировка популяции НГ внутри нервной трубки не зависит ни от Msx, ни от Рах белков, а от несовместимого взаимодействия между мутантами Рах3 и Msx, которое само по себе ингибирует нормальную экспансию/дифференцировку НГ, тогда это м.б. объяснить. как потеря
msx2 м. приводить к устранению этих сложных онтогенетических дефектов.
Итак, ясно, что Рах3 играет роль в собственно спецификации и дифференцировке кардиального НГ; однако, молекулярные механизмы, которые управляют дисрегуляцией кардиального НГ, не ясны. Напротив, роль HAND1 и HAND2 в кардиальном НГ менее понятна, необходимо еще выяснить молекулярную регуляцию, как эти факторы управляют ткане-специфической экспрессией генов. Неясно, как HAND и Рах факторы сотрудничают в спецификации и дифференцировке транскрипционных программ кардиального НГ и как осуществляются комбинаторные взаимодействия между транскрипционными факторами.
Сайт создан в системе
uCoz
, S.J Conway
