Посещений:
Черепнолицевое Развитие

Сравнение Мышей и Рыбок Данио

Understanding Endothelin-1 Function during Craniofacial Development in the Mouse and Zebrafish
D.E. Clouthier
Birth Defects Res. C. V.72, No 2, P. 190-199, 2004




Рис.1.  | Fluorescent antibody staining that shows muscle (in red) and skeleton (in blue) of zebrafish.

Из всех скелетных структур, формируемых во время эмбриогенеза лицевой скелет наиболее интригующий. Большинство клеток, которые формируют лицевые структуры, происходят из клеток краниального нейрального гребня (НГ), возникающего вдоль латеральных краёв ростральных частей нейральных складок (Le Lievre, Le Douarin, 1975; Le Douarin, 1982; Noden, 1983). Эти клетки мигрируют вентрально из нейральных складок сразу после смыкания нейральных складок после эпителиально-мезенхимного перехода (Le Douarin, 1982; Tosney, 1982). Клетки НГ, которые формируют скелетные ткани, обозначают как "эктомезенхимные" клетки, они проникают в глоточные дуги, временные структуры на вентральной стороне эмбриона, которые окружают глотку (Nichola, 1986; Fukiishim, Moriss-Kay, 1992). Оказавшись в дугах эктомезенхимные клетки пролиферируют и дифференцируются в хрящи и кости (Le Lievere, Le Douarin, 1975; Le Douarin, 1982; Noden, 1983; Langille, Hall, 1988; Noden, 1988; Couly et al., 1996). Хотя они обладают некоторой информацией о своём происхождении вдоль нейральных складок (Noden, 1988), но клетки НГ внутри глоточных дуг получают большую часть паттерн-формирующей информации от молекул, секретируемых окружающими клетками (Trainor, Krumlauf, 2000; Schilling et al., 2001), включая эпителиальную эктодерму, стержневую параксиальную мезодерму и энтодерму глоточных карманов (Seufert, Hall, 1991; Couly et al., 2002; David et al., 2002). В свою очередь клетки НГ отсылают сигналы обратно к окружающим клеткам, создавая множественные реципрокные сигнальные сети (Vobourne, Sharpe, 2003). Комбинация этих взаимодействий последовательно создаёт взрослый лицевой скелет, включая размер, расположение и сочленения индивидуальных костей. Нарушения этих сетей м. нарушать образование или ориентацию индивидуальных элементов и м. в некоторых случаях даже приводить к полному устранению качественных особенностей дуг . Одним из факторов развития дуг является endothelin-1 (ET-1, Edn1)/ он необходим для множественных аспектов лицевого развития и его функция, по-видимому, законсервирована у рыб и млекопитающих (Clouthier et al., 1998, 2000; Thomas et al., 1998; Yanagisawa et al., 1998a; Miller et al., 2000; Miller, Kimmel, 2001; Kimmel et al., 2003; Miller et al., 2003).

A Prequel: Understanding Arch Nomenclature Differences Between Mouse and Zebrafish




Figure 1. Pharyngeal arch morphology in mouse (A) and zebrafish (B). Lateral (left panels) and ventral (middle panels) views of arch primordia at ED 9.5 (mouse) and 36 hr postfertilization (fish). Lateral views of adult arch skeletons at ED 18.5 (mouse) and 18.0 mm (fish). Within the mandibular and hyoid arch primordia, Ednl (blue) is expressed in the ectoderm and endoderm surrounding the arch, and in the mesodermal core. Hand2 (red) is expressed in ventral arch neural crest cells. Ednl signaling is required for distal (ventral) arch cartilage and bone (red), al, alisphenoid; b, branchiostegal rays; c, ceratohyal; h, hyoid bone; hs, hyosymplectic; i, incus; m, malleus; ma, mandible; me, Meckel's; op, opercle; pq, palatoquadrate; so, suboperde; s, stapes; sq, squamosal; ty, tympanic ring.

Как видно на Рис. 1 у мышей фарингеальные дуги расположены в проксимо-дистальной ориентации, причём дистальными являются кончики дуг, которые или слиты (мандибулярные) или встречаются (дуги 2-6) по срединной линии. Далее мандибулярные дуги, если рассматривать с вентральной стороны, м.б. подразделены вдоль ростро-каудальной оси на ростральную (оральную; верхнюю) и каудальную (aboral; нижнюю) половины. Напротив дуги у рыбок данио не встречаются по срединной линии, это первоначально обусловлено присутствием больших нерасщепленных желточных клеток и расположены они больше в дорсо-вентральной ориентации (Kimmel et al., 1995; Schilling et al., 1996). Следовательно, проксимальный и дистальный домены внутри таких дуг называются дорсальными (верхними) и вентральными (нижними) соотв. с ростральной, оральной эктодермой, описываемой как "передняя" и каудальной, aboral эктодермой наз. как "задняя". Однако общий паттерн развития дуг сходен.

Endothelin-1: Expression and Receptor Binding


Одним из первичных факторов ответственных за формирование паттерна фарингеальных дуг является Edn1. Edn1 является одним из 3-х известных изопептидов endothelin (Edn1, Edn2 и Edn3). Каждый из них синтезируется с отдельного гена. Edn1 (Yanagisawa et al., 1988) является одним из наиболее мощных вазоконстрикторов. Эндотелины первоначально синтезируются в виде крупных неактивных пептидов, prepro-endothelins, которые последовательно подвергаются двум событиям процессинга. Первая модификация осуществляется с помощью furin-подобной протеазы, которая продуцирует неактивную форму эндотелина, наз. big endothelin. Вторая модификация осуществляется с помощью endothelin converting enzyme (ECE) (Xu et al., 1994), в результате образуется зрелая активная форма в 21 аминокислоту. Т.к. два гена кодируют ЕСЕ (ЕСЕ-1 и ЕСЕ-2), то несколько дополнительных изоформ ЕСЕ образуется благодаря дифференциальному сплайсингу (Emoto et al., 1999). Эндотелины соединяются с одним или обоими из двух известных G protein-coupled эндотелиновыми рецепторами, endothelin-A (ETA или Ednra) (Aral et al., 1990) и endothelin-B (ETB или Ednrb) (Sakurai et al., 1990). Ednra обладает наивысшим сродством к Edn1, тогда как Ednrb обнаруживает одинаково высокое сродство ко всем трём изопептидам. Ednra и Ednrb являются до некоторой степени функционально перекрывающимися во время эмбрионального развития, это продемонстрировано в отношении миокарда (Yanagisawa et al., 2000).
Мы ограничимся рассмотрением Edn1/Ednra в черепно-лицевом развитии, хотя эти молекулы экспрессируются и в др. тканях. Во время черепнолицевого развития мышей и рыб Edn1 экспрессируется дистально и каудально в эктодерме фарингеальных дуг, энтодерме глоточных карманов, параксиальной мезодерме сердцевины дуг и в эндотелии артерий дуг (Рис. 1) (Maemura et al., 1996; Clouthier et al., 1998; Yanagisawa et al., 1998b; Miller et al., 2000). Экспрессия Ednra ограничивается мигрирующими краниальными клетками НГ и эктомезенхимными клетками глоточных дуг (Clouthier et al., 1998; Yanagisawa et al., 1998b) (Nair, T.F.Schilling, неопубл. набл.) Хотя механизмы, регулирующи экспрессию Edn1 и Ednra неизвестны, но экспрессия Fgf8 у мышей, по-видимому, поддерживает экспрессию Edn1 в каудальной части эпителия дуг, хотя потеря эпителием экспрессии Fgf8 не нарушает целиком передачу сигналов Edn1 (Trummp et al., 1999). Будучи активированными с помощью Edn1 G-белки, Gαq и Gα11, действуют как внутриклеточные медиаторы передачи сигналов Ednra (Ivery et al., 2003).

Endothelin Signalling and Facial Morphogenesis


Мыши, гомозиготные по целенаправленной мутации Ednra (Clouthier et al., 1998) Edn1 (Kurihara et al., 1994) или Есе1 (Yanagisawa et al., 1998a)? доживают до рождения, но погибают вскоре после родов от механической асфиксии, обусловленной тяжелыми уродствами костей челюстей и горла. Структуры дистальных частей челюстей (дуга 1) редуцированы, включая нижнюю челюсть и Меккелев хрящ, а также tympanic и gonial кости и хрящевые зачатки молоточка в среднем ухе (см. Рис. 1А). Наблюдаются также дефекты в проксимальных структурах, включая кости palatine, pterygoid и alispenoid и зачатки хрящей наковальни. Во второй дуге дистальные структуры, такие как гиоидная кость, оссифицируется преждевременно, а малые рога гиоид распространяются рострально (скорее, чем проксимально) и сливаются с pterygoid. Это слияние сдавливает трахею и вызывает неонатальную гибель; трахеотомия Edn1-/- эмбрионов устраняет эту инициальную летальность (Kuwaki et al., 1996). Проксимальные структуры второй дуги, включая стремя и стилоидный отросток, часто уродливы или отсутствуют. Передача сигналов Edn1/Ednra, по-видимому, не участвует в развитии зубов, т.к. развитие моляров и резцов нормальное у Edn1-/- и Ednra-/- эмбрионов, а экспрессия Msx1, важная для развития зубов (Satokata, Maas, 1994; Bei, Maas, 1998; Tucker et al., 1998; Cobourne , Sharpe, 2003), неизменена у Edn1-/- эмбрионов (Thomas et al., 1998; Ivey et al., 2003). Отсутствие некоторых из этих структур м. б. результатом потери клеток предшественников, т.к. пролиферация мезенхимных клеток снижена, а апоптоз усилен в мандибулярной дуге Ednra-/- эмбрионов (Clouthier et al., 2000). Эти результаты подтверждают, что Edn1 действует посредством Ednra, специфицируя дистальную часть скелета дуг.
Передача сигналов Edn1/Ednra нуждается в Distalless, особенно в экспрессии Dlx6 у мышей, а фенотип Dlx5/Dlx6-/- эмбрионов проливает некоторый свет на то, как Edn1 формирует паттерн фарингеальных дуг. У Dlx5/Dlx6-/- эмбрионов мышей кости и хрящи присутствуют в нижней челюсти. Однако, большинство дистальных структур, включая mandible, tympanic и gonial кости, и Меккелев хрящ, по-видимому, подвергаются "гомеозисной" трансформации, принимая во внимание форму и размеры наиболее проксимальных структур, включая maxilla, palatine, pterygoid и alispenoid кости. Эти трансформации обычно являются зеркальными удвоениями проксимальных структур. Это указывает на то, что Dlx5/Dlx6 играют критическую роль в установлении качественных особенностей дистальных клеток глоточных дуг в ответ на сигналы Edn1/Ednra. Некоторые результаты подтверждают, что потеря передачи сигналов Edn1 также ведет к сходным трансформациям (Ozaki et al., 2004).
Выдающаяся роль Edn1 в черепнолицевом развитии, по-видимому, законсервирована у всех gnathostomes, т.к. блокирование функции Ednra у крыс (Spence et al., 1999) или кур (Kempf et al., 1998) фармакологическими антагонистами вызывает дефекты дистальных частей дуг. Это верно и для рыбок данио, у которых ген edn1 был первоначально идентифицирован как генетическая основа мутации sucker (suc) (позднее переименованной в suc/et1)/ одной из оригинальных черепнолицевых мутаций (Neuhaus et al., 1996; Piotrowski et al., 1996; Schilling et al., 1996). Мутанты suc/et1 являются результатом строгой потери функции гена edn1/ Мутанты suc/et1 имеют множественные дефекты в вентральных (дистальных) хрящах глоточных дуг, включая Меккелев хрящ (который редуцируется в размерах и инвертируется вдоль передне-задней оси) и ceratohyal, которая гипопластична. Помимо этого, соединения, отделяющие эти вентральные хрящи от более дорсальных (проксимальных), отсутствуют.
Потеря edn1 нарушает также развитие и интрамембранозных (дермальных) и эндохондральных (замещение хряща) костных структур у рыбок данио, как это происходит и у мышей. Интрамембранозная кость первой дуги у рыб включает dentary (вентрально) и maxilla (дорсально). Эндохорндральными производными являются retroarticular (вентрально) и quadrate (дорсально). У suc/et1 мутантных эмбрионов, дорсальные и вентральные мандибулярные кости сливаются и, по-видимому, меняют полярность, так что изгибаются назад скорее, чем вперед. Внутримембранозные кости второй дуги включают, по крайней мере, два branchiostegal луча (вентрально) и две эндохондральные косточки (hyosymplectic и ceratohyal), которые подвергаются слиянию и разнообразным трансформациям вдоль дорсо-вентральаной оси дуги. Т.о., комбинированный анализ дефектов хрящей и костей у мутантных suc/et1 рыбок данио подтверждает гипотезу, что потеря функции Edn1 ведет к трансформациям вентральных качественных особенностей скелетогенных клеток дуг.
Хотя очевидны изменения полярности и в хрящевых и костных структурах вентральной части первой дуги у мутантов suc/et1 рыбок данио, но гомеозисные трансформации вдоль дорсо-вентральной оси не столь очевидны. Вообще-то передача сигналов Edn1/Ednra необходима для выживания клеток НГ до образования скелета, а гибель клеток вентральной части первой дуги маскирует гемеозисный фенотип. Т.к. повышенная клеточная гибель не очевидна у suc/et1 эмбрионов (miller et al., 2000), она наблюдается в первой дуге на ст. Е11.5 у мутантных Ednra-/- эмбрионов мыши (Clouther et al., 2000). Напротив, трансформации м. б. видимы только в интрамембранозных оссификатах, это подтверждается opecle/branchiostegal трансформациями, обнаруживаемыми у рыб. У мышей Меккелев хрящ у мутантных Dlx5/Dlx6-/- эмбрионов, по-видимому, трансформируется в alisphenoid, но ни Меккелев хрящ, ни какая-либо сходная структура не развивается у Ednra-/- эмбрионов (Clouthier et al., 1998), это возможно отражает потребность в передаче сигналов Edn1/Ednra при формировании и поддержании хондрогенных структур способом, отличающимся от его нижестоящих эффекторов Dlx5 и Dlx6.

Timing of Edn1 Action in Mouse and Zebrafish


Активация Ednra его лигандом, Edn1, является критической для развития хрящей и костей глоточных дуг головы и шеи у разных видов, включая мышей (Clouthier et al., 1998) крыс (Spence et al., 1999), reh (Kempf et al., 1998) и рыбок данио (Miller et al., 2000), это указывает на то, что поступление сигналов Edn1/Ednra в дуги м.б. критической ступенью в эволюции челюстных позвоночных. Edn1, по-видимому, действует в то время, когда клетки НГ достигают глоточных дуг. У рыбок данио экспрессия премиграторных/миграторных маркеров клеток НГ, по-видимому, сходна у дикого типа и suc/et1 эмбрионов, включая fkd6, sna2, dlx2 (Miller et al., 2000). Более того, дефекты глоточных хрящей у мутантны suc/et1 эмбрионов м.б. частично устранены инъекциями мезенхимы глоточных дуг спустя 20 или 28 ч. после оплодотворения человеческим рекомбинантным очищенным белком Edn1 (Miller et al., 2000). Т.к. большинство клеток НГ миогрирует к 20 ч., то эти находки снова указывают на то, что действие Edn1 осуществляется в постмиграторных клетках НГ.
Сходным образом, маркёры премиграторных/миграторных клеток НГ у мышей не затрагиваются ни Edn1 (Thomas et al., 1998), ни Ednra (Clouthier et al., 2000) мутантных эмбрионов, включая нормальную экспрессию АР2 и Dlx2. Некоторые расхождения существуют с находками химерных мышиных эмбрионов, созданных инъекциями Ednra-/- эмбриональных стволовых клеток (ES) в бластоцисты дикого типа. У таких эмбрионов Ednra-/- мутантные клетки НГ мигрируют в глоточные дуги, но не смешиваются с клетками НГ дикого типа (Clouthier et al., 2003)/ Мутантные клетки вместо этого преимущественно исключаются из дистальных и каудальных областей этих дуг, причём степень исключения обратно пропорциональна проценту клеток дикого типа. Ednra-/- клетки м. достигать дистальных частей дуг, если не вступают в конкуренцию с клетками дикого типа, это указывает на то. что передача сигналов Edn1/Ednra м. выполнять некоторые функции на более поздних стадиях миграции клеток НГ в дуги помимо формирования паттерна постмиграторных клеток НГ.
Kimmel et al., 2003) предположили, что Edn1 м. действовать в виде градиента внтри дуг, с наивысшими уровнями Edn1 в вентральных частях и а элементы внутри дуг имеют дифференциальные уровни зависимости от Edn1 вдоль дорсо-вентральной оси. Указывает ли это на то, что Edn1 м. действовать как аттрактант или сигнал наведения для клеток НГ, неясно. Однако, экспрессия tyrosin kinase ephrin receptor, EphA3 нарушена у suc/et1 мутантных рыбок и м. иметь важные последствия для морфогенеза (Miller et al., 2000; Miller, Kimmel, 2001). Т.к. большинство членов семейства ephrin участвует непосредственно или косвенно в наведении клеток и формировании эмбриональных компартментов (Flanagan, Vanderhaeghen, 1998; Wilkinson, 2000), то регуляция EphA3 с помощью Edn1 м. активировать экспрессию генов, необходимых для миграции клеток НГ или их последующего перемещения внутри дуг (Cerny et al., 2004). Картирование судеб клеток НU у endothelin мутантов мышей и рыб и неправильная экспрессия Edn1 вдоль пути миграции клеток НГ д. помочь решить этот вопрос.

Effectors of Edn1/Ednra: Is HAND2 the Linchpin


Отсутствие edn1 ведет у рыбок данио к потере вентральных частей мандибулярной и гиоидной дуг и к трансформации структур дуг вдоль дорсо-вентральной оси. Такие изменения скорее всего отражают потерю экспрессии нормального гена в вентральной (дистальной) части дуг. Однако, Edn1 м. также ограничивать экспрессию более дорсальных (проксимальных) генов, а дефекты в результате такого ограничения м. вносить вклад в потерю mandibular качественных особенностей у Edn-/- или Ednra-/- мутантных эмбрионов. У мышей потеря Edn или Ednra ведет к драматическим изменениям в экспрессии генов со ст. Е9.5, включая членов семейства Distalless Dlx3 и Dlx6, членов семейства helix-loop-helix twist dHAND/HAND2 и eHAND/HAND1, Msx1, goosecoid (gsc), Barx1 (Clouthier et al., 1998; Thomas et al., 1998; Clouthier et al., 2000). Из этих факторов, регуляция экспрессии HAND2 с помощью Edn1 изучена лучше всего и является прекрасным примером Edn1-зависимого иерархического сигнального каскада (Рис. 2). Экспрессия HAND2 у мышей зависит от экспрессии и Dlx5 и Dlx6 (Charite et al., 2001; Beverdam et al., 2002; Depew et al., 2002). Один цис-действующий элемент, как было установлено, управляет специфичной для дуг экспрессией HAND2 (McFadden et al., 2000; Charite et al., 2001). Этот элемент содержит несколько Dlx6 консенсусных связывающих сайтов (Charite et al., 2001) и м. управлять экспрессией lacZ трансгена (McFadden et al., 2000; Charite et al., 2001; Ruest et al., 2003) или Cre (Ruest et al., 2003) по всему эндогенному домену HAND2 в дистальной части дуг. Однако, целенаправленная инактивация энхансера лишь нарушает экспрессию HAND2 в проксимальном домене HAND2 мандибулярной дуги (Yanagisawa et al., 2003), это указывает на то, что, по крайней мере, один дополнительный энхансер участвует в регуляции экспрессии HAND2 в дуге. Этот цис-действующий элемент, предположительно, регулируется с помощью Dlx5, т.к. экспрессия HAND2 подавляется у Dlx5/Dlx6-/- эмбрионов.
Т.к. механизм, с помощью которого Edn1 индуцирует экспрессию HAND2 выяснен недостаточно, точная функция HAND2 в развитии челюстей у млекопитающих неясна. Целенаправленная инактивация всего HAND2 гена приводит к эмбриональной гибели на ст. Е10.5 из-за сосудистых дефектов, это препятствует анализу его роли в черепнолицевом развитии (Srivastava et al., 1997; Yamagishi et al., 2000). Однако, анализ перед гибелью иллюстрирует, что клетки НГ внутри мандибулярной дуги способны воспринять дистальную судьбу и затем подвергаются апоптозу, это указывает на то, что HAND2 м. действовать как паттерн-формирующий и/или жизнеспособности фактор (Thomas et al., 1998). Целенаправленная инактивация Dlx6 энхансера инактивирует экспрессию HAND2 только в проксимальной части домена экспрессии HAND2, в результате возникают лишь незначительные изменения в структуре челюстей, включающие укорочение нижнечелюстной кости и потерю артикулярного отростка (Yanagisawa et al., 2003). Пониманию функции HAND2 в формировании паттерна клеток НГ возможно поможет условный нокаут HAND2 в краниальных клетках НГ, так фенотип, наблюдаемый у Dlx5/Dlx6-/- эмбрионов, у которых экспрессия HAND2 подавлена, даёт некоторые указания на важность Edn1/HAND2 пути. Дистальные структуры челюстей у Dlx5/Dlx6-/- мутантов подвергаются гомеозисной трансформации в более проксимальные структуры челюстей. Это указывает на то, что Edn1-индуцированная экспрессия HAND2 осуществляемая посредстом Dlx5 и Dlx6, м.б. одним из ключевых факторов, обеспечивающих качественные особенности дистальных клеток НГ в мандибулярной дуге (Рис. 2А).
Более строгие доказательства функции в формировании мандибулярного паттерна Edn1/HAND2 получены на рыбках данио (Рис. 2В). Анализ экспрессии генов внутри глоточных дуг уsuc/et1 мутантных рыб иллюстрирует сходные изменения в экспрессии генов с наблюдаемыми изменениями у Edn1-/- и Ednra-/- эмбрионов мышей. Сюда входят, снижение экспрессии dlx2, dlx3, gsc, msxE, hand2 в вентральной части дуги (Miller et al., 2000). Разрушение edn1, однако, не влияет на дорсальную экспрессию ни dlx2, ни gsc. Среди генов, экспрессируемых вентрально, hand2, по-видимому, играет критическую роль в формировании паттерна вентральной части дуг. Мутации в гене hand2, наз. hands off (han) выявлена при скрининга мутаций, затрагивающих развитие сердца (Yelon et al., 2000). Мутация hans6 вызывает потерю функции гена hand2 и последующие дефекты сердечнососудистого паттерна спустя 24 ч после оплодотворения, включая отсутствие и сердца и крови. Однако, рыбки данио м. жить, по крайней мере, 4 дня без кровообращения, что позволяет анализировать роль hand2 в развитии глоточных дуг. У hand2 мутантов вентральные хрящи, включая Меккелев хрящ (первая дуга) и ceratohyal (вторая дуга), отсутствуют, и вместо этого замещены небольшими хрящевыми узелками (miller et al., 2003). Дорсальные хрящи, включая palatoquarate, pterygoid отросток кости palatoquadrate и hyosymplectic, все они присутствуют, но слегка уменьшены в размере.
Ген hand2 м.б. точкой развилки для Edn1 регуляции развития дуг, т.к. многие из генов, чья экспрессия нарушается у мутантов suc/et1, всё ещё экспрессируются у мутантов han/hand2, включая dlx3 и EphA3 (Рис. 2В) (Miller et al., 2003). Другие, включая gsc, полагаются на экспрессию hand2, хотя эта потребность, по-видимому, заключается в поддержании экспрессии gsc скорее, чем в её инициации. Интересно, что экспрессия msx генов, включая msxB и msxE, в вентральных частях дуг усиливается в отсутствие hand2 (Miller et al., 2003). Т.к. трудно определить соотв. ортологи у млекопитающих, но Msx1 и Msx2, безусловно участвуют в развитии мандибулярных дуг у мышей (Satokata, Maas, 1994; Bei, Maas, 1998; Thomas et al., 1998; Tucker et al., 1998; Satokata et al., 2000; Zhang et al., 2003). Далее. т.к. маркёры клеток НГ дорсальных частей дуг ещё не идентифицированы у рыбок данио, поэтому Miller et al., (2003) нашли, что домен экспрессии маркёра дорсальной параксиальной мезодермы engrailed2 (eng2) расширяется у у мутантных эмбрионов hand2. Всё это согласуется с находками у мышей и указывает на то, что HAND2 м. действовать как паттерн-формирующий эффектор Edn1 в клетках НГ путём индукции экспрессии вентральных генов.

Edn1 and Joint Formation


У рыбок данио суставы формируются в первой дуге между вентральными и дорсальными производными мандибулярных дуг, разделяя Меккелев хрящ и palatoquadrate. У suc/et1 мутантных эмбрионов формирование суставов нарушено, вентральный и дорсальный хрящи сливаются (Miller et al., 2000, 2003), это указывает на то, что Edn1 каким-то образом специфицирует область сустава или регулирует его поддержание и развитие. Одним из маркёров суставной области у рыбок данио и Xenopus является ортолог гена Drosophila bagpipe (Azpiazu, Frasch, 1993), транскрипционный фактор, названный bapx1 (Nkx3.2) (Newman et al., 1997). Внутри мандибулярной дуги bapx1 локализуется в мезенхиме между дорсальной и вентральной половинами и, по-видимому. демаркирует клетки, которые будут формировать сустав, с экспрессией dlx2 дорсальнее и hand2 вентральнее этой области (Miller et al., 2003). Дефекты суставов, наблюдаемые у мутантов suc/et1, согласуются с этим, т.к. bapx1 подавляется в области суставов (Miller et al., 2000). Потеря bapx1, по-видимому, обусловливает этот дефект суставов, т.к. рыбки данио, которым инъецировали morpholino против bapx1 вызывают сходные слияния дорсальных и вентральных хрящей (Miller et al., 2003). Т.к. экспрессия edn1 необходима для экспрессии bapx1 в дугах, то этот эффект не является результатом только потери экспрессии hand2. Фактически, экспрессия bapx1 распространяется на вентральную часть дуги у hand2 мутантных эмбрионов, указывая тем самым, что edn1 и hand2 обладают несколько отличающимися функциями в установлении дорсо-вентральных доменов внутри глоточных дуг.
Целенаправленная инактивация Bapx1 у мышей не приводит к дефектам развития temporomandibular сустава (Tribioli, Lufkin, 1999; Akazawa et al., 2000). Это не является сюрпризом, т.к. сустав между Меккелевым хрящом м palatoquadrate у рыбок данио, как полагают, соответствует суставу между молоточком и наковальней в среднем ухе млекопитающих (Wilson, Tucker, 2003). Т.к. эмбрионы Bapx1-/- имеют дефекты в развитии и тимпанической и gonial костей в среднем ухе, но malleus-incus сустав остаётся интактным (Tucker et al., 2004). Эти находки указывают на то, что генетическая регуляция становления челюстных сочленений подвергается эволюционным изменениям или что места суставных артикуляций сдвигаются во время эволюции, так что гомологичные суставы увеличиваются или теряются (de Beer, 1937). Однако, ген или гены, отвечающие за формирование суставов челюстей, м. всё ещё зависеть от Edn1 сходным образом с bapx1 у рыбок данио, т.к. кости, происходящие из мандибулярной дуги у Edn1-/- и Ednra-/- эмбрионов, формируют аномальные суставы с jugal костью zygomatic дуги скорее, чем с temporal костью (Kurihara et al., 1994; Clouthier et al., 1998), подтверждая тем самым изменения в ориентации или локализации этих суставов во время развития.

Nature of Edn1 Function in the Pharyngeal Arches: Cell Autonomus Action, Gradient, or Both?


Т.к. функция Edn1 является критической для формирования паттерна клеток Нг внутри глоточных дуг, механизм, с помощью которого это достигается, до конца неясен. Edn1, как растворимый фактор, по-видимому, действует не-клеточно-автономным образом во время развития клеток НГ. Клетки НГ, трансплантированные из меченных suc/et1 эмбрионов в клетки НГ дикого типа у рыбок данио, нормально мигрируют и вносят вклад в развитие вентральных хрящей (Miller et al., 2000). Сходным образом, реципрокные трансплантаты дикого типа клеток НГ в эмбрионы suc/et1 м. восстанавливать формирование вентральных хрящей в мутантном окружении. Комплементарным образом мутации в Ednra у мышей, по-видимому, являются клеточно-автономными. У Ednra мутантных химерных эмбрионов мышей большинство структур, происходящих из первой и второй дуг, состоят исключительно из клеток дикого типа, указывая тем самым, что мутантные клетки внутренне не способны формировать эти структуры (Clouthier et al., 2003). Это не является неожиданным, т.к. большинство рецепторов функционирует клеточно-автономно. Однако, некоторые др. структуры, производные дуг, которые деформированы у эмбрионов Ednra-/-, по-видимому, не обладают той же самой клеточно-автономной потребностью. Элементы, происходящие из проксимальных частей первой (incus) и второй (Stapes и styloid отросток) дуг, содержат и дикого типа и Endra-/- клетки, перемешанные гомогенно. Т.к. эти структуры уродливы у мутантных химер с высокой пропорцией мутантных клеток, то перемешивание клеток указывает на то, что передача сигналов Ednra или действует не-клеточно-автономно при формировании эти х структур, или не нужна вообще. Интересна гипотеза, согласно которой передача сигналов Ednra действует только в субнаборах клеток НГ, происходящих из специфических средний мозг/задний мозг областей. Эт о наиболее очевидно в первой дуге Ednra мутантных химер, где все структуры за исключением incus, состоят из клеток НГ, происходящих из задней части среднего мозга и ромбомера 1 (r1) заднего мозга (Couly et al., 1996; Kontges, Lumsden, 1996). Наковальня имеет также вклад от r2, это указывает на то, что только НГ уровня среднего мозга и r1 нуждаются в передаче сигналов Ednra.
Эта модель "crest dependence" более трудна для интерпретации внутри второй глоточной дуги, которая занимается прежде всего клетками Нг из r4 и в меньшей степени клетками из r3 и r5. Однако, градиентная модель, предложенная Kimmel et al., (2003) для рыбок данио м. объяснить эту дифференциальную зависимость от передачи сигналов Ednra. У личинок рыбок данио вторая дуга содержит два больших хряща (hyosymplectic и ceratohyal) и два элемента из дермальной branchiostegal-opercle серии. Вентральные branchiostegal лучи, часто отсутствуют или редуцированны у мутантов suc/et1, тогда как изменения в дорсальном opercle являются наиболее изменчивыми. Чтобы лучше понять эти изменения, варьирующие концентрации edn1 morpholinos инъецировали рыбкам данио. Если эмбрионам вводили высокие дозы morpholono, то opercle были редуцированы в размерах, тогда как при низких концентрациях morpholino наблюдалась экспансия opercle. Эти изменения указывают на то, что формирование паттерна дуг осуществляется с помощью градиента Edn1. Наивысшие концентрации Edn1 (пик предполагаемого градиента) д. обнаруживаться в вентральных частях дуг, самых ближайших к клеткам, которые экспрессируют edn1 (Miller et al., 2000). Модель градиента предполагает, что вентральные элементы (т.е. branchiostegal лучи) должны зависеть от высоких концентраций Edn1 для собственно формирования паттерна клеток НГ. Как только градиент снижается в дорсальных частях дуг, то согласно градиентной модели, структуры в этой области (т.е. opercle) д. обладать пониженной потребностью в Edn1 для собственного формирования и поэтому менее тяжело повреждаются при потере edn1. Градиентная модель д. постулировать, что редукция Edn1 д. приводить к снижению склона концентрации градиента Edn1? , следовательно, более вентральная популяция клеток будет получать меньше Edn1 и будет редуцирована в размерах или будет воспринимать дорсальную судьбу, это м. объяснить увеличение opercle. Альтернативно, Edn1 м. просто специфицировать вентральный компартмент дуги без необходимости в градиенте, а дорсальный компартмент м. увеличиваться в его отсутствие.

Future Directions


Хотя существуют морфологические отличия черепа у мышей и рыбок данио, но многие одни и те же сигнальные факторы и генетические пути регулируют их развитие. Сравнительный анализ действия Edn1 во время развития глоточных дуг показал, что передача сигналов Edn1/Ednra индуцирует экспрессию дистальных (вентральных) генов, ингибируя при этом экспрессию более проксимальных (дорсальных) генов. Действуя таким образом, передача сигналов Edn1/Ednra формирует паттерны дистальных (вентральных) частей дуг, обеспечивая качественные особенности клеткам НГ и окружающей ткани. Однако, очевидные отличия в анатомии дуг у двух видов осложняют некоторые из интерпретаций.
Сила сравнительного анализа в том, что системы мышей и рыбок данио допускают уникальные для них манипуляции , позволяющие отвечать на общие вопросы, связанные с функцией Edn1 во время развития глоточных дуг. Одним из наиболее сильных аспектов биологии рыбок данио является способность претворять широко-масштабный скрининг мутаций. такой скрининг у мышей затруднителен и требует много времени. Очевидно, что у рыбок данио ещё будут выделены дополнительные эффекторы Edn1. Затем они м.б. тестированы на эпистатические взаимодействия с edn1 или др. мутациями вентральных частей дуг. Дополнительным преимуществом рыбок данио является способность инъецировать эмбрионам morpholino, которые knock down экспрессию генов (Miller, Kimmel, 2001; Heasman, 2002), которая довольно стабильно нарушает функцию генов на относительно поздних стадиях (2-3 дня после оплодотворения), когда формируется ранний черепнолицевой скелет. После секвенирования генома рыбок данио стали возможны исследования микромассивов кДНК для выяснения профилей экспрессии разных мутаций.
Мыши также имеют одно преимущество - способность инактивировать специфические гены с помощью гомологичной рекомбинации. Новый подход, который комбинирует поиск генных ловушек с микромассивами кДНК и технологией нокаута у мышей, м.б. использован для выявления нижестоящих эффекторов передачи сигналов Ednra (Chen et al., 2004). Этот комбинированный подход упрощает скрининг генных ловушек (Gossler et al., 1989; Friedrich, Sorano, 1991; Forrestor et al., 1996; Bonaldo et al., 1998). SDoriano и др. сравнивали экспрессию генов в эмбриональных фибробластах мышей, выделенных из дикого типа и PDGFα-/- и PDGFβ-/- эмбрионов с помощью такого подхода в такой системе, пригодной для широкого круга молекул. Дифференциально экспрессируемые гены м.б. затем быстро инактивированы с помощью инъекций в бластоцисты соотв. целенаправленно полученных клонов ES клеток.
Дополнительные молекулярные техники, включая условное инактивирование генов у мышей (Kwan, 2002) и чувствительные к температуре мутантные аллели у рыбок данио (Rawls, Johnson, 2001) м. понадобиться для полного выяснения функции генов-эффекторов Edn1/Ednra.
Сайт создан в системе uCoz