CLATHRIN- AND NON-CLATHRIN-MEDIATED ENDOCYTIC REGULATION OF CELL SIGNALLING
Christine Le Roy & Jeffrey L. Wrana Nature Reviews Molecular Cell Biology6, No 2, 112-126 (2005); doi:10.1038/nrm1571
The internalization of various cargo proteins and lipids from the mammalian cell surface occurs through the clathrin and lipid-raft endocytic pathways. Protein–lipid and protein–protein interactions control the targeting of signalling molecules and their partners to various specialized membrane compartments in these pathways. This functions to control the activity of signalling cascades and the termination of signalling events, and therefore has a key role in defining how a cell responds to its environment.
Box 2 | Outstanding questions in the lipid-raft field
Lipid rafts and their associated proteins have been revealed by fluorescence resonance energy transfer123,125, chemical crosslinking126, immunofluorescence127 and biochemical isolation in a low-buoyant-density, detergent-resistant membrane fraction4. Analysis of detergent-resistant membranes must be interpreted cautiously, as their lipid and protein composition might be dependent on the type of detergent that is used for the extraction128. Therefore, it would seem that the outstanding questions surrounding lipid rafts should not focus on whether they exist, but rather on understanding their biogenesis, size, stability, and lipid and protein composition8. Many models for lipid rafts have been put forward. One model proposes that lipid rafts arise owing to the spontaneous association of cholesterol and sphingolipids to form membrane platforms that isolate proteins4. A second model proposes that lipid rafts are constructed of shells of just a few lipids that assemble around proteins to form a molecular 'address', which targets the protein–lipid assembly to liquid-ordered lipid-raft domains129. Assembly into larger domains is proposed to be dependent on the propensity of such shells to assemble into higher-order structures, and could therefore account for both the clustered and non-clustered distributions of lipid-raft-bound proteins129. In a third model, lipid rafts are proposed to be small, unstable membrane complexes that contain at least three molecules. In this model, the lipid rafts can be merged into large-scale stabilized structures9. In a fourth model, lipid rafts are small, dynamic, pre-existing lipid assemblies in which protein monomers exist, and these rafts can give rise to large-scale stable lipid rafts5. The different datasets that have given rise to these models might reflect the fundamental dynamics of raft size, assembly, stability and composition that would accommodate all of these models, so the models might not be mutually exclusive.
Box 3 | The partitioning and targeting of proteins in lipid rafts An interesting area in the study of lipid-raft function in cell signalling is elucidating and defining how proteins are targeted to lipid rafts. Among these proteins are cell-surface glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins4, which are tethered to lipid rafts through interactions between the long, saturated on the GPI anchor and sphingolipids and cholesterol in the lipid rafts130. Intracellular lipidated proteins are also found in lipid rafts — for example, non-receptor tyrosine kinases, heterotrimeric G proteins and Ras105,123. However, lipid modifications alone might not be sufficient to direct all proteins to lipid rafts, and can work in conjunction with protein conformation8 and protein–protein interactions131. Binding to lipid-raft-resident proteins such as caveolin, and is another targeting mechanism. For example: caveolin, through its scaffolding domain105, targets proteins to lipid rafts; flotillin binds to the sorbin-homology () domain in Cbl-associated protein () and vinexin-α, and recruits proteins into flotillin-containing lipid rafts132; annexin-II has been implicated in the apical targeting of sucrase isomaltase6; and annexin-VIIIb mediates the lipid-raft apical-membrane localization of the C2 (protein-kinase-C conserved region-2)-domain-containing ubiquitin ligase NEDD4 (Ref. 133). Finally, raft targeting might also be intrinsically encoded in the protein, as is the case for the transmembrane domain of the influenza virus haemagglutinin protein and the extracellular juxtamembrane region of the epidermal growth factor receptor52. Combining all of these observations with emerging models of dynamic lipid-raft assembly (Box 2) indicates a possible model in which lipid-raft coalescence and stability is dependent not only on the inherent propensity of raft lipids to cluster, but also on specific protein–protein interactions between lipid-raft-associated proteins. This cooperativity between lipid and protein interactions could function to assemble cell-signalling networks into ordered structures with defined components that are poised to transmit extracellular signals.
Box 4 | The classic clathrin-dependent endocytic pathway The central defining feature of the classic clathrin-dependent endocytic pathway is the recruitment of soluble clathrin from the cytoplasm to the plasma membrane. The clathrin triskelia assemble into a polygonal lattice at the plasma membrane to form coated pits that bud and pinch off from the membrane in a dynamin-dependent manner and give rise to clathrin-coated vesicles134,135. Clathrin-binding adaptors, such as adaptor protein-2 (AP2), bind to clathrin directly to initiate this process, and they also bind to cargo proteins and thereby mediate their endocytosis. In addition, phospholipids, such as phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, are also found in coated pits and they facilitate vesicle formation and budding by binding to clathrin adaptors such as epsins. Clathrin-coated vesicles are uncoated after endocytosis and then fuse with the early endosome. The early endosome is highly enriched in phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) and has unique protein constituents, such as the PtdIns3P-binding 'Fab1, YOTB, Vac1, EEA1' (FYVE)-domain proteins, which can bind to and control the activity and destination of proteins in the compartment. The early endosome is therefore a key control point for sorting receptors, which can be directed to Rab11-positive recycling endosomes and back to the cell surface, or are directed to the intralumenal vesicle of multivesicular endosomes, and therefore to the multivesicular body, late endosome and lysosome for degradation.
Two theories have been proposed for how this pathway is organized. In the 'maturation model', vesicles that are derived from the plasma membrane give rise to a de novo, temporary early endosome that matures to become a transient late endosome and then a degradative lysosome136. In the 'pre-existing-compartment model', the early endosome and late endosome are stable compartments that are connected by vesicular traffic that moves cargo through the pathway137. Importantly, non-clathrin endocytic pathways can also deliver certain molecules to endosomes and lysosomes46,138, and clathrin pathways can target cargo molecules to other compartments, such as the Golgi, too31.
Box 5 | Non-classic endocytic pathways The recent development of new techniques, reagents and markers has provided new insights into non-clathrin-mediated internalization pathways. For example, the uptake of Simian virus 40 (Ref. 110), cholera-toxin B subunit, glycosylphosphatidylinositol–green-fluorescent-protein fusion proteins34,111,112, transforming-growth-factor-β receptors94, interleukin-2 receptor-β(Ref. 45) and autocrine-motility-factor receptor108 from the cell surface is not inhibited by interfering with clathrin-mediated endocytosis (Fig. 3). Clathrin-independent internalization routes are sensitive to cholesterol depletion, which has led to the idea that they are lipid-raft dependent — a concept that is further supported by the fact that many lipid-raft-bound components seem to be endocytosed through non-clathrin pathways. Non-clathrin pathways seem to be further subdivided between those that are dynamin-GTPase dependent and those that are dynamin-GTPase independent. In contrast with clathrin-mediated endocytosis, almost nothing is known about the machinery that regulates the biogenesis of vesicles in these non-classic routes. However, the lipid-raft-resident protein caveolin might have an important role in a subset of these pathways — as indicated by the identification of motile caveolin-1-positive vesicles (caveosomes) that do not accumulate transferrin or and do not contain markers of endosomes, lysosomes, the Golgi apparatus or the endoplasmic reticulum (ER)34,110-112. Non-clathrin endocytic pathways can deliver molecules to various intracellular compartments that include the Golgi apparatus and the ER34,110-112, as well as to classic endocytic compartments, such as the recycling endosome46.
Box 6 | Caveolae Caveolae, which are a morphologically identifiable type of lipid raft105, are flask-like invaginations of the plasma membrane that contain sphingolipids, cholesterol and the caveolin proteins139. Caveolin proteins bind fatty acids and are modified by palmitoylation, which is required for cholesterol binding and for the proper transport of caveolin proteins to the plasma membrane105. Moreover, caveolin-1 has been shown to be important for the formation of caveolae, as caveolin-1-null mice lack caveolar structures105,140. Furthermore, in cells that are deficient in caveolin-1, the re-introduction of caveolin-1 leads to the creation of caveolae141. The formation of caveolae is also dependent on cholesterol, which indicates that caveolin induces lipid rafts to assemble into these membrane invaginations105. It is also important to note that structures that are morphologically similar to caveolae have been observed in some cells that lack caveolin proteins53,142, which indicates that the formation of caveolae is not exclusively regulated by caveolin.
Белки организуются в дискретных областях внутри клетки и это играет важную роль в контроле потоков информации через сигнальные пути. Широко-форматные механизмы регулируют локализацию белков, напр., пептидные мотивы, домены и пост-трансляционные модификации, которые контролируют межбелковые и белок-липидные взаимодействия. Более того, клеточные мембраны организуются в мозаично отсортированные липидные молекулы, которые включают phosphoinositides и мембранные микродомены, которые известны как , rjnjhsz особенно важны для событий доставки. Основное внимание будет уделено тому, как клетки используют эндоцитоз и композицию мембран - в частности, липидных плотиков - для контроля клеточной передачи сигналов с упором на пути epidermal growth factor () рецепторов () и transforming growth factor-β(TGFβ) receptor (TGFβR). Затем будут суммированы некоторые сигнальные пути, которые компартментализуются в специфических мембранных микродоменах и будет обсуждена потенциальная роль путей эндоцитоза в двух др. (Hedgehog () and Wingless/Int-1 (Wnt)).
The mosaic of cellular membranes
Phosphoinositides. Inositol phospholipids или phosphoinositides составляют небольшую пропорцию фосфолипидов, которые выявлены в клеточных мембранах, но они участвуют в многочисленных внутриклеточных событиях, таких как пролиферация, метаболизм клеток, гибель, подвижность клеток, перестройка цитоскелета и мембранный трафик. Phosphoinositides м. специфически взаимодействовать с и контролировать локализацию белков, которые содержат липид-связывающие домены1,2 (Box 1; Табл. 1; полная версия Табл. 1 online (table)). Более того, генерация определенных phosphoinositides, осуществляемая посредством регуляции lipid-kinase и lipid-phosphatase активности - напр., (PI3K) и (phosphatase and tensin homologue) активности, соотв. - находится под динамическим контролем, так что phosphoinositides играют критическую роль в контроле путей передачи клеточных сигналов (Ref. 3).
Lipid-raft microdomains. Микродомены липидные плотики являются др. типом мембранных доменов, которые компартментализируют мембраны живых клеток. Липидные платформы состоят из динамически собираемого холестерола и , которые формируют жидкостно-упорядоченные (liquid-ordered) домены, которые плавают в менее-упорядоченных жидкостных доменах окружающих мембран4. Хотя липидные платформы одни формируются, а др. определенно существуют, их размеры, время жизни, биогенез, липидный и белковый состав остаются неустановленными (Box 2). Тем не менее считается, что липидные платформы, по-видимому, собираются в крупные платформы, которые м. разделять мембранные компоненты и благодаря своей способности рекрутировать, а также исключать специфические липиды и белки, они м. участвовать в регуляции разнообразных физиологических процессов5, таких как сортировка липидов, доставка белков, поляризация клеток6 и сигнальная трансдукция4,7,8.
Partitioning proteins and signalling in lipid rafts. Как мембранные белки распределяются между lipid-raft и non-lipid-raft доменами? Различные исследования показали, что распределение белков в липидные плотики зависит от непосредственных взаимодействий glycosylphosphatidylinositol (GPI)-закрепленных белков, lipidated белков и трансмембранных белков с липидами плотиков, а также от межбелковых взаимодействий с находящимися в липидных плотиках компонентами (Box 3). Распределение д. помогать возникновению (nucleation) специфических сигнальных сетей в липидных плотиках и имеются серьезные доказательства, указывающие на то, что липидные плотики м. функционировать как платформы, в которых встречаются рецепторы и их ниже стоящие мишени4,9. В самом деле, липидные плотики являются критическими для эффективной активации зависимых от Т-клеточных рецепторов сигнальных каскадов10, для передачи сигналов В-клеточных рецепторов11 и для insulin-обусловленной транслокации глюкозного транспортера GLUT4 (Ref. 12).
Др. примером является glial-cell-derived neurotrophic factor (GDNF), удаленный член семейства TGFβ, который передаёт сигналы посредством трансмембранной тирозин киназы RET и GPI-закрепленного ко-рецептора GFRα1 (GDNF-family receptor-α1), который присутствует в липидных плотиках. Связывание GDNF с GFRα1 индуцирует транслокацию RET в липидные плотики, это облегчает GDNF-индуцированную передачу внутриклеточных сигналов13. Интересно, что GFRα1 также взаимодействует с трансмембранной изоформой neuronal-cell-adhesion molecule (p140NCAM) и индуцирует её накопление в липидных плотиках. Т.к. GFRα1 необходим для GDNF-индуцированной передачи сигналов p140NCAMпосредством Fyn и FAK (focal adhesion kinase), которые также обнаруживаются в липидных плотиках, то эти данные указывают на то, что GFRα1 способствует передаче сигналов путем контроля распределения в плотики p140NCAM (Ref. 14). Выявлена также важная роль липидных плотиков в путях, таких как: -обусловленной активации7,8; tumour necrosis factor-α (-обусловленной активации nuclear factor (NF)-κB, которая индуцируется с помощью TNF receptor-1 () и др. ниже стоящих компонентов15; CD3/CD28-co-stimulation-индуцированная активация NF-κB, которая индуцируется с помощью CARMA1 и др. белков16; и interleukin-6 (IL-6)- и interferon-γ (IFN-γ)-индуцированная передача сигналов signal transducer and activator of transcription (STAT) 17. Всё это ясно показывает, что мембранные микродомены липидные плотики, в которых локализуются разные сигнальные молекулы, представляют собой важные места для организации и трансдукции реакции на внеклетоные сигналы.
Endocytosis
Эндоцитоз характеризуется интернализацией молекул клеточной поверхности во внутримембранные компартменты, а доставка пузырьков м.б. подразделена на два основные пути - классический, клатрин-опосредованный путь эндоцитоза (Box 4) и не классический, clathrin-независимый, но зависимый от липидных плотиков путь (Box 5).
The clathrin-dependent pathway. Clathrin-зависимый эндоцитоз (Box 4), который ответственен за интернализацию питательных веществ, патогенов, антигенов, ростовых факторов и рецепторов, наиболее охарактеризованный механизм поступления молекул в клетку. Комплексы адаптерных белков являются ключевыми компонентами этого пути, который связан непосредственно с клатрином, др. эндоцитотическими регуляторными белками и грузом, чтобы стимулировать образование клатриновой оболочки. Adaptor protein-2 (AP2) является одним из таких адаптеров, которые обеспечивают конституитивный эндоцитоз грузовых белков, которые содержат tyrosine- или di-leucine-based мотивы18, напр., 19. Напротив, интернализация EGFR больше зависит от взаимодействующего с клатрином адаптора, epsin, и его белков-партнеров EGFR-pathway substrate-15 () и EPS15-related protein ()18. Эти адаптеры собираются, чтобы сформировать комплекс, который регулируется с помощью EGFR-зависимого фосфорилирования EPS15, а также с помощью лиганд-зависимой индукции epsin и EPS1520,21. Monoubiquitylation является важным сигналом на пути эндоцитоза млекопитающих22. Моноубиквитилирование epsin и EPS15, которое м.б. обеспечено с помощью ubiquitin ligase, нуждается в ubiquitin-interacting motif в epsin и EPS15. UIM связывает также monoubiquitin, который возможно ограничивает удлинение ubiquitin-цепи20. Более того UIM облегчает также связывание с monoubiquitylated грузом и кооперирует с др. белок-взаимодействующими доменами эндоцитотической кухни (machinery), чтобы управлять сборкой мультибелковых эндоцитотических комплексов, которые способствуют образованию покрытых клатрином ямок. Эта последняя активность зависит также от взаимодействий с клатрином и AP2, а также от взаимодействий с фосфолипидным бислоем с помощью phosphatidylinositol (PtdIns)-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2)-связывающего (epsin-N-terminal-homology) домена эпсина23, который м. облегчать образование пузырьков путем действительно выгибания фосфолипидного бислоя.
После эндоцитоза рецепторы поступают в ранние эндосомы, где они сортируются, и затем они или возвращаются обратно в плазматическую мембрану или деградируют в поздних endosome/. Рециклинг с помощью -позитивных эндосом м.б. облегчен за счёт диссоциации комплекса лиганд-рецептор в ранних эндосомах24 или м. непосредственно регулироваться - как в случае protein kinase C (PKC)-зависимого фосфорилирования EGFR, которое способствует рециклингу25. В отношении дегративной сортировки устойчивое рецепторов в эндосомах является ключевым сигналом, который распознается с помощью UIM-содержащего белка (hepatocyte-growth-factor-regulated tyrosine-kinase substrate; известного также как HGS), который необходим для сортировки груза в (endosomal sorting complex required for transport-I). ESCRT-I, посредством ESCRT-II и -III, последовательно направляет груз во intralumenal пузырьки (MVBs)26, которые приводят в результате к signal termination и деградации рецепторов в лизосомах. HRS функционирует в четвертичном комплексе с EPS15 и STAM (signal transduction adapter molecule)27, имеет PtdIns-3-phosphate (PtdIns3P)-связывающий 'Fab1, YOTB, Vac1, ' () домен, который является важным для его локализации в ранних эндосомах и м. рекрутировать клатрин в ранне эндосомы28. HRS также фосфорилируется после активации receptor tyrosine kinase (RTK) и он стимулирует сборку ESCRT-I комплекса посредством взаимодействий с tumour-susceptibility gene-101 () субъединицей этого комплекса29,30. Хотя TSG101 преимущественно локализуется на ограниченных мембранами MVBs, избыточная экспрессия HRS м. приводить к накоплению TSG101 на ранних эндосомах30, это указывает на то, что ESCRT-I комплексы м. собираться рано в эндоцитотическом пути. Более того, формирование MVB зависит от ESCRT-I (Ref. 29), это подтверждает идею, что HRS и ESCRT-I обеспечивают биогенез, от ранних эндосом, из посреднических ранних мультивезикулярных эндосом, который созревают в MVB30,31. За счёт связывания биогенеза MVB с сортировкой рецепторов в intralumenal пузырьки, HRS , следовательно, создает быстрый путь прекращения передачи сигналов из эндосом. Ясно, что многочисленные компоненты эндоцитотической кухни непосредственно регулируются с помощью зависимого от рецепторов фосфорилирования и что фосфолипиды, такие как PtdIns(4,5)P2 м. генерироваться локально, чтобы способствовать образованию покрытых клатрином ямок. Итак, межбелковые и белок-липидные взаимодействия, которые связаны с самостоятельными липидными композициями разных эндоцитотических компартментов, являются важными для сортировки молекул груза на клатрин-зависимом эндоцитотическом пути и интимно связаны с передачей сигналов клетками в эндоцитотическую кухню.
Non-classic endocytosis pathways. Хотя его существование длительное время считалось спорным, усилия были сконцентрированы на выяснении молекулярной кухни, которая участвует в не-классическом пути эндоцитоза (Box 5). Эти пути интернализации были хорошо охарактеризованы, но они чрезвычайно чувствительны к деплеции холестерола32. Более того, истощение плотиков в ямках, покрытых клатрином33,34, вместе с общим наблюдением, что плотики и ассоциированные с плотиками белки интернализуются посредством не-клатриновых путей34,35, привело к идее, что эти альтернативные эндоцитотические пути являются зависимыми от плотиков, хотя это формально не подтверждено. Важным non-clathrin эндоцитотическим путём является эндоцитоз расположенного в плотиках белка , который индуцирует образование кавеол на клеточной поверхности (Box 6). Подвижные caveolin-позитивные пузырьки идентифицированы, а скорость caveolar эндоцитоза, как было показано, зависит от баланса и липидов плотиков (т.е., cholesterol и glycosphingolipids)36 - избыточная экспрессия caveolin-1 снижает скорости caveolar эндоцитоза37, тогда как увеличение уровня липидов плотиков ускоряет интернализацию36. Одновременное вмешательство актинововго цитоскелета также нарушает caveolae-зависимую интернализацию GPI-закрепленной alkaline phosphatase38 и (SV40)39, a изучение динамики caveolar системы показало, что относительно низкая подвижность кавеол на клеточной поверхности зависит от кортикальных актиновых филамент, тогда как быстрые движения caveolin-позитивных пузырьков (cavicles; известных также как caveosomes) в цитоплазму зависит от сети микротрубочек40. Большинство caveolin-позитивных пузырьков отделяется от классических эндосомных компартментов41, а поставка компонентов с помощью этого пути регулируется non-RTK активностью и зависит от активности PKCα36,42. Более того, недавние сообщения показывают, что EGF стимулирует caveolin-зависимую интернализацию E-cadherin, это согласуется с идеей, что активность этого пути регулируется43. Однако, важно подчеркнуть, что caveolin путь является одним из отделений non-clathrin эндоцитотических путей и что в отсутствие кавеолина происходит зависимая от липидных плотиков поставка44.Более того, эти caveolin-независимые пути, как было показано, обеспечивают интернализацию interleukin-2 receptor-β ()45 и м. управлять некоторыми GPI-закрепленными белками на -позитивных recycling эндосомах46. Следовательно, non-clathrin эндоцитотические пути м. общаться с компонентами классической эндосомной системы. В самом деле было установлено, что caveolin-позитивные пузырьки м. взаимодействовать с ранними эндосомами с помощью процесса, зависимого от Rab541.
Trafficking and the control of signalling
Уже давно предполагалось, что clathrin-зависимый эндоцитоз является главным путем, который участвует в подавлении рецепторов клеточной поверхности, таких как EGFR47. Однако, исследования некоторых рецепторов клеточной поверхности показало, что многие рецепторные системы подвергаются эндоцитозу посредством non-clathrin путей. Более того, оба типа путей используются для интернализации TGFβRs. Клетки, следовательно, используют различные пути интернализации, чтобы контролировать рецепторы клеточной поверхности и это является важным для регуляции клеточной передачи сигналов, оборота рецепторов, а также величины, продолжительности и природы сигнальных событий.
EGFR
Семейство RTK контролирует пролиферацию, дифференцировку, жизнеспособность, миграцию и адгезивность широкого круга типов клеток. Механизмы, которые лежат в основе и функции, которые исполняются с помощью трафика этого класса рецепторов, изучены достаточно хорошо для EGFR системы. В этой системе связывание EGF индуцирует димеризацию EGFR48 и trans-аутофосфорилирование тирозиновых остатков в цитоплазматических доменах EGFR, которое в результате формирует места пристыковки для Src-homology-2 ()- или phosphotyrosine-связывающий-домен-содержащих ниже стоящих эффекторных белков. Последние белки функционируют, чтобы собирать сигнальной сети, которые регулируют биологическую реакцию на лиганд18.
EGFR and lipid rafts. EGFRs, как было установлено, локализуется в caveolae и GM1-содержащих липидных плотиках49,50. Опубликован ряд сообщений о пропорции EGFR, которая обнаруживается в плотиках, на уровне от свыше 60% (Ref. 49) до нескольких процентов51. Учитывая динамику размеров липидных плотков и продолжительность жизни в купе с отсутствием понимания относительно того, как методы экстракции затрагивают ассоциации белков с липидными плотиками, эти расхождения не являются неожиданностью. Локализация EGFRs внутри или вне липидных плотиков является важным регулятором связывания лиганда - истощение холестерола увеличивает связывание EGF, тогда как нагрузка холестеролом снижает его и эти различия обусловливаются за счёт изменения количества EGFRs, которые доступны для связи с лигандом скорее, чем за счёт изменения их лиганд-связывающего сродства50. Локализация EGFR в плотиках обеспечивается с помощью специфических внеклеточных последовательностей в EGFR52 и будучи стимулированными лигандом уровень EGFR в плотиках снижается49. Интересно, что trafficking событие, как было показано, зависит от RTK активности, это указывает на то, что оно связано с инициацией сигнала и оно модулируется с помощью Src kinase и PKC активностей49, что важно для caveolar оборота (trafficking). Эти данные приводят к модели, согласно которой EGF иниационный сигнал индуцирует выход EGFR из плотиков49,53 и clathrin-зависимую интернализацию (Рис. 1). Однако, недавнее открытие non-clathrin-зависимого пути оборота EGFR указывает на то, что м. использоваться и др. эндоцитотические пути (S. Polo and P. P. Di Fiore, personal communication).
EGFR sorting and clathrin-mediated endocytosis. Интернализация EGFR обеспечивается с помощью , RING-finger E3 ubiquitin лигазы, которая постоянно соединяется с активированным EGFR, также как и со многими др. рецепторами, чтобы обеспечить устойчивое multiubiquitylation рецепторов22,54. Это multiubiquitylation EGFR-мишеней для эндоцитоза и последующей сортировки в MVB22. Cbl также м. способствовать эндоцитозу вместе с CIN85 (Cbl-interacting protein of 85 kDa) и endophilins, которые обладают ('Bin, amphiphysin, Rvs') доменами, которые индуцируют изгибание мембраны и помогают отделению покрытых клатрином почек от мембраны55,56 (Рис. 1). Cbl является , следовательно, важным компонентом оборота EGFR, хотя EGFR не является пассивным гру, а активно участвует в своем собственном обороте с помощью непосредственно регуляции эндоцитотической кухни. В самом деле, clathrin фосфорилируется с помощью EGFR и это индуцирует перераспределение клатрина на клеточной периферии57. Более того, фосфорилирование EPS15 с помощью рецепторов является существенным для интернализации58, a monoubiquitylation и EPS15 и epsin также регулируется с помощью EGFR20. Т.к. и EPS15 и epsin необходимы для интернализации EGFR, то они, по-видимому. функционируют в виде комплекса во время интернализации EGFR59. Однако, дальнейшим поворотом истории является то, что monoubiquitylated epsin-1 теряет свою способность соединяться с PtdIns(4,5)P2 и взаимодействовать с AP2 и clathrin, это указывает на то, что ubiquitylation также м. способствовать освобождению интернализованного EGFR от clathrin адаптеров18. Было бы интересно в точности определить, где и когда происходит monoubiquitylation специфических белков во время оборота EGFR.
После интернализации в ранние эндосомы рецепторы м. отсортировываться в recycling эндосомы, из которых они отправляются назад на клеточную поверхность (Рис. 1). Напротив, вместе с EPS15, они м. формировать четвертичный комплекс с STAM и HRS27, который направляет их в TSG101 и ESCRT комплексы и затем в intralumenal пузырьки мультивезикулярных эндосом, которые обусловливают прекращение передачи сигналов18,60 (Рис. 1). Ubiquitylated HRS также фосфорилируется в ответ на активацию EGFR и др. RTKs, хотя функция этого фосфорилирования недостаточно изучена61. Всё это указывает на то, что clathrin-обусловленный эндоцитоз вместе с фосфорилированием, multiubiquitylation и специализированной композицией эндоцитотических мембран, функционирует кооперативно, контролируя судьбу EGFR и многих др. рецепторных систем, которые совершают оборот с помощью клатриновго пути.
EGFR signalling during trafficking. Сложность сигнальных сетей и биологических реакций, которые связаны с RTKs, м. указывать на то, что оборот м. играть существенную роль в контроле природы пути активации, а , следовательно, биологической реакции, которая распространяется за пределы простого подавления рецепторов. Однако, хотя и четко показано, что эндоцитотические пути выполняют критическую функцию по подавлению EGFR, неожиданно оказалось довольно трудно дать объяснение, м. ли оборот per se контролировать природу молекулярной реакции на активацию RTK, и в частности на EGFR62,63. Более ранние исследования EGFR, дефектного по интернализации показали, что EGFR клеточной поверхности м. обеспечивать сигналы, которые индуцируют митотическую реакцию и индуцируют трансформацию клеток низкими дозами EGF64. Такие исследования показали также, что ингибирование эндоцитоза не приводит в результате к ослаблению биологических эффектов, таких как пролиферация клеток65,66. Несмотря на это анализ EGFR в присутствие активного эндоцитоза показывает, что эндосомально расположенные EGFR ассоциируют со многими, если не со всеми, своими ниже стоящими эффеектрами, такими как SHC (SH2-domain-containing transforming protein) и GRB218,67. Более того, эта идея привела к рекрутированию у млекопитающих son-of-sevenless (mSOS) и к эндосомно локализованной активации Ras, Raf, MEK1 и всего mitogen-activated protein kinase (MAPK) каскада67-69 (MEK1 стоит перед 'MAPK and extracellular signal-regulated kinase (ERK) kinase-1'). В дополнение, к блокированию активации на клеточной поверхности EGFR и рециклинга EGFR обратно на клеточную поверхность, интернализрованные активированные рецепторы, как было показано, передают сигналы из эндосом и способствуют выживанию клетки70. Отметим, что nerve growth factor (NGF) RTK receptor TRKA также м. активировать Ras-MAPK путь из эндосом нейрональных клеток71. Итак, RTKs м. передавать сигналы из эндосом.
Является ли передача сигналов из эндосом пассивным событием, инициируемым на плазматической мембране и поддерживаемым во время оборота (trafficking) или оно биологически значимо? Анализ передачи сигналов EGFR, когда блокирован эндоцитоз показал, что активация MAPK66,69 зависит от эндоцитоза, тогда как активация phospholipase Cγ (PLCγ) и SHC не зависит66. Более того, p14, белок, который локализуется в эндосомном компартменте, м.б. ключевым, т.к. он рекрутирует MP1 (партнера MEK1) MAPK поддерживающий белок в эндосомы и важен для сильной EGF-зависимой активации ERK, но не др. киназы, известной как p38 (Ref. 72). Согласуется с этой идеей и то, что уникальные сигнальные активности возникают из эндосомного компартмента, активная Rap1, Ras-related GTPase, как известно, преимущественно обогащает эндосомы, возможно посредством локализованного в эндосомах Ras guanine nucleotide-exchange фактора73. Всё это указывает на то, что оборот RTKs м. действовать, чтобы контролировать как природу, так и величину молекулярных сигнальных событий и биологические результаты клеточной стимуляции.
Однако, простой интернализации рецепторов м.б. недостаточно для передачи сигналов, ассоциированной с эндосомами. В самом деле, дикого типа Rab5, которая стимулирует и эндоцитоз и эндоцитотический рециклинг, усиливает активацию Raf1 с помощью H-Ras (последняя активируется с помощью активации EGFR), тогда как мутантная Rab5, которая делает возможным только эндоцитоз и блокирует рециклинг, ре-локализует H-Ras из плазматической мембраны в эндосомы, но ингибирует H-Ras-зависимую активацию Raf174. Это отличается от K-Ras, действие которой не зависит от оборота. Почему циклические изменения между клеточной поверхностью и эндоцитическими компартментами являются ключевой необходимостью для передачи сигналов через определенные ниже стоящие эффекторнные пути, но не через др.? Как отмечалось выше, микродомены липидные плотики плазматических мембран обогащены различными ниже стоящими эффекторами EGFR - в частности, H-Ras. Это контрастирует с локализацией K-Ras, которая не обнаруживается в липидных плотиках7,75. Интересно, что H-Ras-зависимая активация Raf является чувствительной к пертурбациям липидных плотиков66,67, тогда как активация Raf с помощью K-Ras нет8. Следовательно, м. предположить, что циклы интернализации и рециклинга м. способствовать H-Ras-зависимой передаче сигналов Raf путём позволения активированным EGFR повторно и временно достигать липидных плотиков плазматической мембраны. Это указывает на важной взаимодействие между эндоцитозом, рециклингом и разделением плазматических и эндосомных мембран на микродомены, которые обогащены специфическими сигнальными составляющими.
Точную роль, которая выполняется оборотом, в контроле природы путей передачи сигналов RTK, трудно установить с достоверностью, т.к. имеются небольшие сомнения, что др. исход эндоцитоза - подавление рецепторов - является чрезвычайно важным для биологических систем. В самом деле, обработка клеток EGF ведет к быстрому подавлению пула на клеточной поверхности EGFR и это является частью механизма, который лежит в основе интересной 'ON/OFF' реакции переключения активации MAPK. Анализ дифференцировки нейронов в линии нейроэндокринных клеток далее показал, что время активации MAPK является важным для контроля биологической реакции, краткая активация MAPK ведет к пролиферации и устойчивой активации, способствующей нейрональной дифференцировке78. Мало вероятно, что биологические системы используют одно-ударную стимуляцию, чтобы контролировать онтогенетические или гомеостатические пути, так что интересно, что пульсовая активация передачи сигналов EGF (два пульса, разделенных 8 ч) индуцируют пролиферативную реакцию в эпителиальных клетках, тогда как одиночное пульсовое воздействие нет79">. Следовательно, скорость оборота RTK м. играть важную роль в контроле биологических реакций. В самом деле, члены семейства ERBB - которые формирую гомодимеры и гетеродимеры др. с др. - замещаются с разной кинетикой и т.к. гомодимеры EGFR (который также известен как ERBB1) быстро деградируют, тогда как гетеродимеры EGFR или с ERBB2 (известным также как онкопротеин HER2) или с ERBB3 обнаруживают тенденцию к рециклингу18. Это обусловливается частично за счёт стабильности комплексов лиганд-рецептор в эндоцитотическом пути и за счёт способности рецепторов связывать Cbl18. Итак, помимо регуляции преимущественной активации отдельных сигнальных путей, устойчивая передача сигналов из эндосом с помощью рецепторных комплексов также является критической для устойчивой multiubiquitylation EGFR и для направления их по пути деградации.
Эти исследования начинают выявлять важные свойства оборота RTK - что сильная активация MAPK происходит в том же самом эндоцитотическом пути, который регулирует также деградацию рецепторов. Т.к. величина и кинетика сигнальной активации на путях RTK являются важными для заболеваний - в частности, при раке - то интеграция оборота рецепторов с передачей сигналов представляет собой элегантный механизм тонкого управления реакциями на сигналы. Напр., за счёт гарантии временной природы MAPK реакций. В самом деле, помехи этой интеграции за счёт нарушения RTK оборота (turnover)является ключем молекулярной патологии, которая лежит в основе многих раковых опухолей. Это подчеркивается и Cbl, которая впервые была идентифицирована в качестве v-Cbl. v-Cbl является белковым продуктом трансформирующего гена Cas NS-1 вируса мышиной лейкемии и является доминантно-негативным мутантом, который состоит только из EGFR-связывающего домена Cbl. Он, следовательно, блокирует подавление рецепторов, способствует рециклингу80 и обусловливает EGF-индуцированные трансформации80. Амплификация ERBB2 (HER2), который подавляется медленнее по сравнению с EGFR (ERBB1), также важна в субнаборе раков молочных желез. Критическая роль того, что оборот участвует в этой онкогенной активности подтверждается тем фактом, что L26 антитела м. функционировать, снижая уровни на клеточной поверхности ERBB2 путем индукции интернализации ERBB2 internalization, ubiquitylation и деградации Cbl-зависимым способом81. Гуманизированная версия L26 антител (Herceptin) используется для лечения метастатических карцином молочных желез из-за избыточной экспрессии ERBB2 при данном заболевании81,82. Оборот рецепторов , следовательно, является важной мишенью для разработки новых терапевтических средств. Эти исследования проливают свет на важность связи передачи сигналов с оборотом рецепторов в RTK системе и на то, что эта связь м.б. более интимной, чем это предполагалось. Растет количество сообщений, выявляющих прямые регуляторные взаимодействия между сигнальными модулями и компонентами эндоцитотической кухни83,84.
TGFβRs
Сверхсемейство TGFβ - которое включает activins и bone morphogenetic proteins (BMPs) - находится в резком контрасте по отношению к RTK путям и функционирует благодаря уникальному сигнальному пути, который вовлекает транскрипционные регуляторы, называемые SMADs. Путь SMAD передает сигналы непосредственно от TGFβ-семейства рецепторов в ядро, где эти сигналы регулируют экспрессию сотен генов в зависимости от клеточного типа и клеточного содержимого85. У всех животных члены семейства TGFβ функционируют в качестве ключевых морфогенов - т.е., диффундирующих факторов, которые контролируют судьбы клеток на базе своей концентрации. Они используются повторно во время развития и помимо контроля клеточной судьбы они регулируют пролиферацию клеток, пластичность эпителиальных клеток и подвижность клеток. Путь передачи сигналов TGFβ-SMAD играет критическую роль в этих биологических процессах, т.к. он аккуратно интерпретирует внеклеточные концентрации и транслирует их в виде соотв. экспрессии генов-мишеней в соотв. время и в соотв. месте. Роль мембранного оборота в передаче сигналов TGFβ-сверхсемейства тщательно изучалась на прототипической TGFβ системе, т.е. TGFβ. TGFβ, сходен с activins и BMPs, передает сигналы посредством гетеромерных комплексов type-I и type-II трансмембранных serine/threonine киназ. Активация передачи сигналов происходит, когда TGFβ соединяется с постоянно активными type-II рецепторными димерами (известными как ), это ведет к рекрутированию димеров type-I (), чтобы сформировать гетеротертрамерные рецепторы. TβRII затем trans-фосфорилируют и активируют TβRI (Ref. 86), которые в свою очередь, связывают и фосфорилируют (receptor-regulated SMADs; и SMAD3; Рис. 2). R-SMAD связывание с рецепторами облегчается белком, известным как (SMAD anchor for receptor activation)87, который имеет FYVE домен и преимущественно локализован в PtdIns3P-обогащенных ранних эндосомах. После фосфорилирования SMAD2 отсоединяется как от рецепторов, так и SARA. И затем взаимодействует с SMAD4 (объединенный SMAD) и транслоцируется в ядро, где SMAD комплекс регулирует транскрипцию генов-мишеней85. Ингибирующий SMAD, SMAD7, негативно регулирует передачу сигналов TGFβ за счёт рекрутирования HECT-domain-содержащих E3 ubiquitin лигаз или , которые управляют ubiquitylation и последующей деградацией TGFβR-SMAD7 комплекса88,89 (Рис. 2).
TGFβRs and clathrin-mediated endocytosis. Из плазматической мембраны TGFβRs интернализуются90,91 посредством clathrin-обеспечиваемого эндоцитоза92. TβRII, которые содержат di-leucine мотив93, присутствуют в покрытых клатрином ямках94 и соединяются с β2 субъединицами AP2 in vitro95. TβRII, как полагают, также интернализуются посредством покрытых клатрином ямок, частично благодаря своей ассоциации с (type-III TGFβR), которые м. непосредственно соединяться с (Ref. 96). После интернализации в покрытые клатрином пузырьки TGFβRs обнаруживаются в течение продолжительного периода в early-endosome antigen-1 (EEA1)-позитивных ранни х эндосомах94,97 и обнаруживаются в Rab11-позитивных recycling эндосомах94,98, но не в p62-позитивных поздних эндосомах94. Всё это говорит о том, что TGFβRs следуют clathrin-обеспечиваемы путем при интернализации. Вмешательство в clathrin-зависимый оборот - используя деплецию K+ или доминантно-негативные мутации 94,97 или EPS15 (Ref. 94), все они предупреждают clathrin-зависимый оборот TβRII - блокируют также TGFβ-индуцируемую активацию и передачу сигналов SMAD294,97. Т.к. PtdIns3P-содержащие EEA1-позитивные ранние эндосомы обогащены SMAD2-якорем SARA97,99,100, который содержит FYVE домен87, то это указывает на то, что EEA1-позитивные эндосомы являются ключевым компартментом для активации SMAD (Рис. 2). В самом деле, wortmannin, который ингибирует PI3K и истощает эндосомный пул PtdIns3P, или избыточная экспрессия SARA мутации, у которой отсутствует FYVE домен, оба ингибируют передачу сигналов TGFβ99,100. Следовательно, clathrin-обеспечиваемый эндоцитотический путь м. способствовать ко-локализации рецепторов с ниже стоящими компонентами, такими как SARA и SMAD2 в ранних эндосомах. Белок cPML, цитоплазматическая форма белка promyelocytic leukaemia, как было установлено, способствует связыванию SMAD с SARA и выполняет ключевую роль в передаче сигналов TGFβ путем стимулирования рекрутирования и TGFβR комплекса и SARA в ранние эндосомы101 (Рис. 2). Интересно, что HRS, который важен для обеспечения подавления EGFR (Рис. 1),м. способствовать передаче сигналов activin, который использует TGFβ-подобный путь в кооперации с SARA102 (Рис. 2). Более того, SARA взаимодействует с TGFβRs клеточной поверхности и м. защищать рецепторы от SMAD7-SMURF2-обусловленной деградации94.
TGFβRs and lipid rafts. Clathrin-зависимый оборот является не единственным путем интернализации TGFβRs90,94 а в MvLu1 клетках примерно половина из эндогенных TGFβRs находится в липидных плотиках и интернализуется посредством clathrin-независимых путей, которые ведут к его поступлению в caveolin-1-позитивные пузырьки. Эти пузырьки также являются позитивными по комплексу SMAD7-SMURF2-ubiquitin-ligase94, который, как известно, ассоциирует преимущественно с рецепторами, связанными с плотиками94. В самом деле, TGFβR оборот ингибируется с помощью разрушения липидных плотиков, а каталитически неактивные мутантный SMURF2 специфически защищает TGFβRs, которые располагаются в липидных плотиках94. Напротив, экспрессия caveolin-1 в caveolin-1-дефицитных клетках усиливает SMAD7-SMURF2-индуцируемый турновер TGFβR (Рис. 2). Итак, липидные плотики и caveolin-1 - последний из которых взаимодействует с TβRI (Ref. 103) - является важным для регуляции деградации рецепторов посредством не-классического эндоцитотического пути. Конечно присутствие в липидных плотиках - др. HECT-домен-содержащей E3 ubiquitin лигазы - указывает на тою что липидные плотики м. представлять собой общее мембранное местоположение HECT-домен-содержащих ubiquitin лигаз. Неясно, какие сигналы контролируют распределение TGFβ между этими двумя путями. Однако, химерные TGFβRs, которые содержат granulocyte/macrophage colony-stimulating фактора-1 внеклеточный домен, преимущественно локализуются в EEA1 компартменте, это указывает на то, что детерминанты м. располагаться во внеклеточном домене98.
TGFβR endocytosis, partitioning and regulation. TGFβRs , следовательно, интернализуются с помощью вдух отдельных эндоцитотических путей - clathrin-обеспечиваемым путем и caveolar/lipid-raft-обеспечиваемым путем - это полностью разделяет функции TGFβ сигнальной трансдукции. Первый важен для обеспечения передачи сигналов, тогда как последний обеспечивает деградацию рецепторов (Рис. 2). Интересно, что присутствие этих двух путей интернализации создает динамический баланс между TGFβR оборотом и его компартментализацией в мембранах. Вмешательство в любой из этих путей, следовательно, сдвигает рецепторы на альтернативный путь, а избыточная экспрессия SARA - подобно разрушению липидных плотиков - блокирует SMAD7-SMURF2-зависимый турновер TGFβR FYVE-domain-зависимым образом94. В самом деле, секвестрирование рецепторов из caveolar/lipid-raft пути м.б. ключевой функцией клатринового эндоцитоза. В согласии с этим предположением то, что сопутствующие помехи в липидных плотиках и клатрине достаточны для снятия блока передачи сигналов TGFβ , который был обусловлен вмешательством в клатриновый путь94. Кроме того, у некоторых типов клеток, которые дефицитны по кавеолину, clathrin-зависимый эндоцитоз оказывается недостаточным для передачи сигналов TGFβ104. Эти последние исследования подчеркивают важность того, что различия в типах клеток м. помочь понять, как трафик рецепторов регулирует передачу сигналов клетками и турновер рецепторов. В этом отношении подавление кавеолина ассоциирует с прогрессированием опухолей105, а его потеря м. способствовать конституитивной передаче сигналов TGFβ, которая ассоциирует с прогрессированием метастатического фенотипа в опухолях поздних стадий. Вместе с тем эти результаты подчеркивают ключевую роль динамического баланса между clathrin и caveolin-1/lipid-raft компартментами в регуляции передачи сигналов TGFβ.
TβRII трафик также существенно отличается от оборота EGFR тем, что связывание лиганда, по-видимому, не меняет скорости оброта или путей интернализации. В самом деле, в сегодняшней модели EGFR секвестрируется в липидных плотиках, а EGF лиганд индуцирует миграцию EGFR из этих липидных плотиков, и это сопровождается лиганд-зависимой интернализацией и деградацией49,53. Напротив, оборот TGFβR посредством двух путей эндоцитоза не затрагивается лигандами TGFβ93,94 и это сходно с наблюдением оборота IL2-receptor45. Это указывает на то, что лиганды м. и не регулировать оброт per se, но что они возможно стабилизируют TβRII-TβRI комплексы во время трафика, чтобы облегчить активацию SARA-связанных SMAD2 clathrin пути или SMAD7-SMURF2-зависимую деградацию в lipid-raft пути.
Интерсно сравнить лиганд-независимый оборот TGFβR с использованием разных путей эндоцитоза для передачи сигналов или деградации, так как EGFR, который использует лиганд-зависимые события, обнаруживает инримные связи между передачей сигналов и деградацией рецепторов с одном и том же пути (Рис. 1,2). Функция морфогена членов TGFβ-семейства, по-видимому, лежит в центре этих уникальных механизмов трафика. Клетки д.б. способны определять концентрации внеклеточных факторов аккуратно и постоянно, чтобы позволить им отвечать соответственно на морфоген внутри онтогенетического поля. Работы Gurdon и коллег проливают свет на биологию этого процесса и выявляют ключевые свойства activin пути - лиганда из TGFβ-семейства, который использует те же самые SMAD пути, что и TGFβ - что подтверждает это биологическое поведение106. Они показали, что клетки, реагирующие постоянно на активин обнаруживают храповик-подобное поведение (т.е., клетки отвечают на наивысшие дозы лиганда, воздействию которых они подвергаются) и что они реагируют на абсолютные количества оккупируемых рецепторов. Лиганд-независимый оборот и отсутствие связи сигнального компартмента с degradative компартментом оптимально приспособлены для этого поведения. Напр., это позволяет осуществлять постоянный мониторинг концентрации лиганда и делает возможным храповой механизм, т.к. перед воздействием лиганда рецепторы не подавляются, как это имеет место в системе EGF. Рецепторы в EEA1 компартменте , следовательно, секвестрируются от SMAD7-SMURF2-зависимого деградтивного пути, это предупреждает временное действие сигнала, которое имеет место, когда сигнальный и дегративный трафик тесно связаны. Глобальное отличие признаков оборота TGFβ-семейства от RTK-семейства, , следовательно, участвует в аккомодации очень разных биологических функций, который выполняют эти сигнальные системы.
Other receptors
Clathrin-назависимый эндоцитоз является маршрутом интернализации, который используется не только TGFβRs, но и др. рецепторами и GPI-закрепленными беками. IL2Rβ является примером др. трансмембранного рецептора, который интернализуется с помощью не-clathrin пути45. Он является одной из субъединиц рецептора высокого сродства для IL2, цитокина, который индуцирует реакцию на активацию T-лимфоцитов с помощью митогенов или специфических антигенов. На клеточной поверхности лимфоцитов IL2Rβ ассоциирует с GM1-позитивными/caveolin-1-негативными устойчивыми к детергенту мембранами45, и хотя интернализация IL2Rβ ингибируется доминантно-негативным мутантным dynamin, она не затрагивается доминантно-негативным мутантом EPS15, который блокирует clathrin-обеспечиваемый эндоцитоз. Это указывает на то, что IL2Rβ эндоцитозируются посредством non-clathrin, dynamin-зависимого, lipid-raft-зависимого пути эндоцитоза45 (Рис. 3). Т.к. IL2Rβ был обнаружен в transferrin-позитивных пузырьках и в late endosome/lysosome, то этот путь м. приводить рецепторы в классические эндосомные компартменты107. Однако, участвует ли clathrin-зависимый путь в эндоцитозе IL2Rβ107, остается неясным.
Autocrine motility factor (AMF; который известен также как glucose 6-phosphate isomerase) является фактором. стимулирующим подвижность клеток, которые своединяется на клеточной поверхности с рецептором glycoprotein gp78/AMF (). AMFR присутствует в caveolae клеточной поверхности и в тубулах гладкого эндоплазматического ретикулема, а вмешательство в clathrin-обуслоленный эндоцитоз не нарушает интернализации biotinylated AMF в AMFR-позитивные трубочки108. Более того, cholesterol-экстрагирующие реагенты и доминантно-негативные dynamin ингибируют интернализацию AMFR в эндоплазматический ретикулем109, это указывает на то, что AMFR - как и TGFβR, IL2Rβ, SV40 (Ref. 110), и GPI-anchored proteins34,111,112 - также использует lipid-raft-зависимый путь интернализации (Рис. 3).
Emerging areas
Наше ограниченное понимание того, как Hh и Wnt рецепторы передают сигналы является препятствием в выяснении роли эндоцитоза в регуляции передачи ими сигналов. Однако, начата идентификация ключевой связи между передачей сигналов и эндоцитозом и в этих двух системах морфогенов.
The Hh signalling pathway. Путь передачи сигналов Hh играет критическую роль во многих аспектах формирования эмбрионального паттерна и в раковых опухолях. Считается, что Hh соединяется со своим рецептором Patched (), это приводит кe Ptc-зависимому ингибированию seven-transmembrane-белка Smoothened (). Smo затем регулирует экспрессию генов посредством Gli транскрипционных факторов. Мало известно о путях интернализации Ptc и Smo, хотя известно, что изменения в их трафике существенно меняют реакцию на Hh. Hh индуцирует накопление Ptc113,114 в околоядерных областях115, с сопутствующим перераспределением Smo из внутриклеточных структур на клеточную поверхность113,115. Установлено, что добавление ортологов позвоночных Hh, Sonic Hedgehog (), индуцирует появление Ptc-Shh и Smo в общих пузырьках и предположительно в поздних эндосомах, Ptc-Shh комплекс отделяется от Smo, который возвращается обратно на клеточную поверхность. Ptc-Shh затем поступает в лизосомный компартмент116. Эта модель наделяет поздний эндосомный компартмент новой ролью, согласно которой он помогает высвобождению Smo из ингибирующего Ptc-Shh комплекса. Интересно , что избыточная экспрессия Ptc взаимодействует с caveolin и присутствует в caveolae, a caveolin-1-обогащенные пузырьки м. перераспределять Smo в липидные плотики117. Т.к. связанная с холестеролом форма Hh has также обнаруживается в липидных плотиках118, то вполне возможно, что Ptc-Hh комплекс формируется в липидных плотиках и м. регулировать передачу сигналов путем диссоциации Ptc-Smo комплекса в этом компартменте. Динамический оборот лигандов и рецепторов в этой системе, следовательно, по-видимому, критический для контроля активности пути.
The Wnt signalling pathway. Путь передачи сигналов Wnt также важен для развития и канцерогенеза. В каноническом Wnt пути, Wnt лиганды передают сигналы посредством low-density-lipoprotein-receptor-related proteins-5/6 (Lrp5/6; D. melanogaster ортолог известен как ) и Frizzled (). Это индуцирует стабилизацию внутриклеточного β-catenin, который, в свою очередь, инициирует транскрипцию Wnt-чувствительных генов. У Drosophila melanogaster, Wnt лиганд Wingless () эндоцитозируется посредством clathrin-обеспечиваемого эндоцитоза в MVBs и лизосомы, это ведет к подавлению уровней Wg и передачи сигналов119. Мало известно о интернализации Lrp5/6, ньо в ответ на , интернализуется посредством clathrin-зависимого эндоцитоза с помощью β-arrestin-2, который соединяется с PKC-фосфорилированным, Fz4-ассоциированным-белком 120. Однако, какую роль играет эндоцитоз Fz4 в передаче сигналов Wnt5 - который использует плохо изученный не-канонический Wnt путь - неясно. Интересно, что в клетках человека - который. как известно, соединяется с и ингибирует Wnt ко-рецептор LRP6 - формирует четвертичный комплекс с мембранным белком , блокируя передачу сигналов Wnt/β-catenin и индуцируя интернализацию и очистку клеточной поверхности от LRP6 (Ref. 121). Хотя анализ трафика Wnt-рецепторов только в начале, тем не менее интересно, что Wnt лиганды являются высоко нерастворимыми возможно благодаря модификации с помощью palmitoylation122, a присутствие этой модификации м. указывать на то, что они ассоциируют с липидными плотиками123.
Это только начало в установлении взаимосвязей между Hh и Wnt путями передачи сигналов и трафиком (trafficking). В ближайшем будущем анализ эндоцитотических путей, которые используются этими двумя факторами и их рецепторами прольет свет на то, как они функционируют в качестве морфогенов.
Conclusions
It is becoming increasingly evident that clathrin-mediated endocytosis is not the only internalization pathway. Lipid rafts are membrane microdomains that: are distinct from clathrin-coated pits; are rich in cholesterol, glycosphingolipids, GPI-anchored proteins and signalling proteins; and can function as signalling platforms. Cholesterol and lipid rafts have been shown to be crucial for the assembly and activity of various signalling networks. Moreover, lipid-raft trafficking is also required to turn off signal transduction and has been found to mediate TGFβR degradation by inducing the colocalization of these receptors with the SMAD7–SMURF2-ubiquitin-ligase complex.
One important area that remains poorly defined is the nature of the molecular composition of lipid rafts and how many varieties of them exist in the cell. Indeed, work at present indicates that caveolae are probably not the only specialized type of lipid raft. Furthermore, the molecular mechanism that underlies lipid-raft-mediated endocytosis has not been fully elucidated. Nevertheless, the existence of lipid-raft endocytic pathways gives cells other ways to regulate signalling, and the interest in this subject ensures that there are many exciting findings to come in the future.
