Посещений:
Мультвезикулярные Эндосомы

Биогенез

The biogenesis of multivesicular endosomes
Jean Gruenberg and Harald Stenmark
NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY. VOLUME 5 | APRIL 2004 | 1-7 doi:10.1038/nrm1360

Recent progress has been made in our understanding of the molecular mechanisms that regulate the biogenesis of multivesicular transport intermediates in the degradation pathway that leads to lysosomes. Here, we discuss recent work that uncovers some of the mechanisms that cause both membrane invagination within these newly forming intermediates and the detachment of these intermediates from early endosomal membranes.


Рис.1.  | The degradation (multivesicular) pathway that leads to lysosomes.


Рис.2.  | Ultrastructure of endosomes after HRS or annexin-II downregulation. a


Рис.3.  | The ECV/MVB-related functions of HRS and annexin-II.


Box 1.  | Endosomal sorting complexes required for transport

DATABASES The following terms in this article are linked online to: Interpro:
FYVE domain | PX domain

LocusLink:
ANXA2 | VPS34

Saccharomyces genome database:
Fab1 | Vps4 | Vps10 | Vps23 | Vps36 | Vps37

Swiss-Prot:
EGFR | HRS | LAMP1 | LAMP2 | PIKFYVE | TSG101

FURTHER INFORMATION

Jean Gruenberg’s laboratory:

Harald Stenmark’s laboratory:

См. также статью "Role of LBPA and Alix in Multivesicular Liposome Formation and Endosome Organization
Hirotami Matsuo, еt al. 2004 " в формате *.pdf Здесь
Что такое multivesicular endosomes (MVEs)? Ранние ЭМ исследования показали существование вакуолей, которые были каким-то образом связаны с лизосомами и которые содержали характерные скопления пузырьков в своём просвете. Эти структуры были названы мультивезикулярными телами (MVBs, см. ссылку 1). С открытием эндосом2, стало ясно, что эндоцитозированные трассеры, которые предназначены для деградации, достигают MVBs после того как сегрегируют от recycling рецепторов, но до того как они достигают лизосом3–5. Сегодня большинство людей полагает, что MVBs это форма поздних эндосом, но чтобы избежать всяческих недоразумений, мы обозначим MVB как транспортные промежуточные структуры между ранними и поздними эндосамами — эти промежуточные образования известны также как endosomal carrier vesicle (ECV)6. В самом деле, все эндосомы вдоль пути деградации содержат мультивезикулярные элементы, включая области ранних эндосом (которые соответствуют вновь образующимся ECV/MVBs) и поздних эндосом7 (Рис. 1). Фактически, мультивезикулярные элементы поздних эндосом содержат сложную систему внутренних мембран, которые участвуют как в деградации, так и рециклинге белков и липидов8. Итак, в данной работе мы используем термин ECV/MVB для обозначения только промежуточных образований, которые участвуют в транспорте от ранних эндосом к поздним, тогда как термин MVE используется как общий термин для любых (ранних или поздних) MVE на пути деградации (Рис. 1). Коротко опишем разные MVEs и представим нашу точку зрения на возможные судьбы и функции их внутренних мембран. Основное внимание будет уделено биогенезу ECV/MVBs, и удут обуждены доказательства, которые указывают на то, что подавленные, активированные рецепторы отсортировываются во внутренние мембраны вновь формируемых ECV/MVBs с помощью молекулярной кухни (machinery), которая управляет также самим процессом инвагинации мембран. Мы обсудим также механизм, м., по крайней мере частично, отвечать за отшнуровку вновь формируемых ECV/MVBs от мембран ранних эндосом.

The different multivesicular endosomes


Не являются ли ранние и поздние MVEs простым отражением разных видов или стадий одной и той же структуры или они действительно являются разными структурами? Мы не будем задерживаться на дебатах по этому вопросу. Эти две альтернативные модели подробно обсуждались в др. работах, всё ещё нет экспериментальных доказательств, подтверждающих любую из моделей. Как же отличать ECV/MVB, которые образуются как результат рециклинга трубочек (tubules), отсоединяющихся от ранних эндосом (модель созревания), и те, что формируются как результат непосредственного отсоединения от ранних эндосом (stable-compartment модель) (Рис. 1)? Любой путь, каждая модель будут использованы для объяснения механизмов, которые контролируют биогенез ECV/MVB. Накапливаются доказательства, что MVEs обнаруживают существенные различия по своему белок/липидному составу и функциям на разных стадиях пути деградации. Эндоцитозированные и recycling молекулы и отработанные (downregulated) молекулы высвобождаются ранними эндосомами и затем быстро и эффективно отделяются др. от др.9. В то время как восстановленные (recycling) рецепторы возвращаются на клеточную поверхность, по крайней мере частично, с помощью recycling эндосом10, отработанные молекулы epidermal growth- factor receptor (EGFR) собираются в ECV/MVBs, где они накапливаются во внутренних пузырьках11 (Рис. 1). Недавние исследования показали, что некоторые отработанные рецепторы убиквитилируются и что подобные модификации ответственны за отсортировку этих рецепторов во вновь формирующиеся ECV/MVBs благодаря действию HRS (hepatocyte-growth-factor-regulated tyrosine- kinase substrate) и ESCRT-I, -II и -III (endosomal sorting complex required for transport-I, -II and -III; см. BOX 1). ECV/MVBs, т.к. они образуются из мембран ранних эндосом, то они, следовательно, селективно включают — в инвагинации своих мембран — рецепторы, которыепредназначены для поздних эндосом или лизосом13,14.
Будучи отшнурованными от ранних эндосом, ECV/MVBs, которые обычно сферические с диаметром ~400–500 nm (Рис. 2a,c), транслоцируются водоль микротрубочек, ведущих в направлении поздних эндосом, с которыми они в конечном счете сливаются15–17. В противоположность ECV/MVBs, поздние эндосомы являются высоко плейоморфными с областями цистерн, тубул и мультивезикулярными образованиями и их белок/липидный состав отличен от такового в ECV/MVBs.Обычно они соедржат большие количества т.наз. лизосомных гликопротеинов (в частности, lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP1) и LAMP2), которые очень обильны и в поздних эндосомах и лизосомах7. Поразительно, но эти белки часто ограничены лимитирующими мембранами мультивезикулярных элементов поздних эндосом. Кроме того, поздние эндосомы содержат также большие количества lysobisphosphatidic acid (LBPA). LBPA обильна в поздних эндосомах, в частности в их внутренних мембранах и не обнаруживатся в др. органеллах18,19. Наконец, в противоположность ECV/MVBs, поздние эндосомы функционируют как важные узлы сортировки по эндоцитотическому пути. Напр., mannose-6-phosphate receptor (MPR) проъходит цикл, по крайней мере частично, от поздних эндосом обратно в trans-Golgi network20, тогда как молекулы class II major histocompatibility complex (MHC) эффективно транспортируются из поздних эндосом (или компартмента class II MHC) в плазматическую мембрану созревающих дендритных клеток21. Мультивезикулярные компартменты на пути деградации (Рис. 1), следовательно, обнаруживают занчительные функциональные и биохимические различия.

The fate of internal membranes


Открытие, что EGFR накапливаются во внутренних мембранах MVEs, привело к мнению, что все внутренние мембраны и их груз предназначены к деградции в лизовомах. Это действительно всегда так? У мутантов по деградации Saccharomyces cerevisiae внутренние пузырьки накапливаются в вакуолях (лизосомах S. cerevisiae), это указывает на то, что эти пузырьки д. деградировать. Однако, по-видимому, противоположная ситуация в клетках млекопитающих8. Хотя MVEs и наблюдаются у S. cerevisiae 22, но инвагинации мембран и внутренние пузрьки, по-видимому, значительно более многочисленные в эндосомах клеток млекопитающих и всегда видны в стабильном состоянии на всех стадиях пути деградации. Более того внутренние мембраны поздних эндосом млекопитающих содержат белки, которые экспортируются для др. клеточного предназначения, включая MPRs, которые являются временными7,18 и молекулы класса II MHC21. Кроме того, др. белки, которые, по-видимому, не предназначены для деградации, также аккумулируются во внутренних мембранах MVEs — в частности, tetraspanins23. Интересно, что LBPA трудно деградируют, а транспорт cholesterol и MPR ингибируется, когда функция LBPA нарушена. Более того, транспорт белка нарушается при накоплении холестерола в поздних эндосомах, которое происходит в клетках некоторых, но не всех24, пациентов с болезнью накопления холестерола Niemann–Pick type C8. Это указывает на то, что функции сортировки и транспорта поздних эндосом нуждаются в их сложной системе внутренних мембран. До сих пор груз MVE, который подвергается рециклингу в лимитирующих мембранах S. cerevisiae MVEs, не идентифицирован. Напр., MPR накапливается во внутриенних мембранах поздних эндосом клеток млекопитающих, в которых нарушена функция LBPA18, это согласуется с мнением, что MPR м. вступать в цикл, по крайней мере до опредленной степени между лимитирующими и внутренними мембранами. Vps10 (vacuolar protein sorting 10) является у the S. cerevisiae функциональным гомологом MPR и, подобно MPR, он осуществляет цикл между аппаратом Гольджи и эндосомами. Его возвращение из эндосом обеспечивается с помощью retromer — мультимерного ассоциированого с мембранами комплекса. Если возвращение ингибируется у retromer мутантов, то Vps10 остаётся на вакуольных (ограничивающих) мембранах, это указывет на то, что Vps10, в отличие от MPR, не достигает внутренних пузырьков25. Также клетки S. cerevisiae явно лишены регуляторного пути, который имеется в дендритных клетках и по которому следуют молекулы class II MHC из внутренних мембран поздних эндосом к клеточной поверхности. Даже если родственный путь рециклинга и существует у S. cerevisiae, он, по-видимому. менее важен, чем в клетках млекопитающих. Привлекательным является мнение, что отсортировка в ECV/MVBs является одним из механизмов, который регулирует деградацию составляющих мембран на эндоцитотическом пути — механизм, который законсервирован от S. cerevisiae до клеток высших эукариот. Однако, клетки высших эукариот, по-видимому, используют более сложные механизмы и вообще зависят от LBPA, чтобы гарантировать, что некоторые белки и липиды м.б. эффективно возвращены из внутренних мембран поздних эндосом и затем транспортированы в др. клеточные места предназначения.

Linking sorting and invagination


В противоположность поздним эндосомам мало известно о композиции мембран ECV/MVBs, помимо того, что они содержат отработанные рецепторы. Однако, липиды м. селективно отсортировываться в ECV/MVBs и м. играть роль в биогенезе ECV/MVB, поскольку бислой в шейке вновь формируемых инвагинаций м. преимущественно снабжаться определенными липидами благодаря высокому изгибу мембраны в этой области14. Некоторые инкорпорируются в ECV/MVBs26, a компоненты липидных платформ транспортируются из ранних эндосом в поздние — по крайней мере в некоторых типах клеток27. Кроме того, phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) накапливается в ECV/MVBs28 и получены доказательства, что передача сигналов PtdIns3P регулирует сортировку рецепторов в ECV/MVBs29.
PtdIns3P and its effector proteins. И ингибитор phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) wortmannin и микроинъецированные антитела против VPS34 (PI3K млекопитающих ответственен за формирование PtdIns3P на эндосомах) ингибируют образование пузырьков снутри просвета ECV/MVBs30,31. Сходным образом секвестрация эндосомного PtdIns3P с помощью тандема FYVE (Fab1,YOTB, Vac1, EEA1) доменовых ингибиторов ингибирует сортировку активированных EGFRs в ECV/MVBs, тогда как основной транспорт между ранними и поздними эндосомами остаётся неизменным29. Эти результаты указывают на то, что PtdIns3P необходим для отсортировывания рецепторов факторов роста, а также для формирования пузырьков внутри просвета эндосом, но что он не нужен для формирования эндосомных промежуточных образований, которые эквивалентны ECV/MVBs, но по преимуществу лишены пузырьков внутри просвета. Однако, каковы механизмы? Два самостоятельных белковых домена — FYVE домен и PX (Phox homology) домен — м. связывать PtdIns3P, и имеется 70 разных белков у млекопитающих, каждый из которых содержит один из этих доменов. В самом деле, было установлено, что некоторые из этих белков обеспечивают сортировку эндосомных рецепторов и образование пузырьков внутри просвета.
HRS and its associated proteins. Наилучшим кандидатом на роль эффектора PtdIns3P в упомянутых выше процессах является HRS. Рекрутирование HRS в эндосомные мембраны нуждается в активности PI3K32,33 и в интактном FYVE домене у HRS34. HRS рекрутирует клатрин посредством прямого взаимодействия35 и обнаруживается в плоской клатриновой решетке (lattices) лимитирующих мембран ранних эндосом и ECV/MVBs36,37. В отличие от типичных клатриновых оболочек, которые обнаруживаются на плазменной мембране, trans-Golgi network и эндосомных тубулах, содержащая HRS клатриновая оболочка, по-видимому, не играет роли в формировании пузырьков, покрытых клатрином. Вместо этого липидные аналоги, которые имеют предпочтение к доменам более упорядоченных мембран м. преимущественно функционировать в отсортировке ubiquitylated мембранных белков. Ковалентное присоединение monoubiquitin к активированным рецепторам факторов роста и др мембранным белкам служит хорошо известным сигналом для направления в лизосомы38. Интересно отметить, что HRS связывается с ubiquitin посредством своего взаимодействующего с ubiquitin мотива и что ubiquitylated белки локализуются в HRS- и clathrin-содержащих микродоменах эндосом36. Так, рецептор transferrin — nonubiquitylated recycling рецептолр — не накапливается в этих микродоменах, тогда как активированные EGFR (которые убиквитилируются) накапливаются37. Прямые доказательства роли HRS в отсортировке в лизосомы ubiquitylated мембранных белков получены в исследованиях мутантов S. cerevisiae12,39, Drosophila melanogaster40 и на клетках млекопитающих, обработанных small interfering RNA (siRNA)41,42.
Хотя имеются прекрасные доказательства того, что HRS является эффектором PtdIns3P в отсортировывании эндосомных рецепторов, но недавние исследования показали. что этот белок играет также роль в формировании пузырьков в просвете эндосом. Мутанты S. cerevisiae и D. melanogaster, у которых нарушена функция Hrs обнаруживают пониженные количества пузырьков в просветах эндосом и вакуолей12,40 и этот эффект м.б. воспроизведен на клетках млекопитающих, обработанных siRNA против HRS41 (Рис. 2a,b). Но как HRS контролирует образование пузырьков внутри просвета? Генетические исследования на S. cerevisiae показывают, что ESCRT-I, -II и -III необходимы для отсортировки в вакуоли ubiquitylated рецепторов, а также для формирования пузырьков внутри просвета12. ESCRTs закончервированы в клетках млекопитающих, в которых они, по-видимому, выполняют функцию, которая эквивалентна таковой у S. cerevisiae43,44. Связь между HRS и ESCRTs недавно установлена с помощью выявления того, что HRS соединяется с субъединицей ESCRT-I41,45–47 и что HRS необходим для рекрутирования ESCRT-I в мембраны эндосом. Более того, взаимодействие между HRS и ESCRT-I является существенным для отсортировки ubiquitylated груза на путь деградации46,47. Т.к. ESCRT-I, как полагают, необходим для поставки ESCRT-II и ESCRT-III46, то HRS м. косвенно отвечать за образование пцзырьков внутри просвета путём инициации рекрутировния ESCRT в мембраны эндосом.
HRS соединяется с TSG101/Vps23 (генный продукт чувствительности к опуходям 101/) субъединицей ESCRT-I. Интересно, что эта субъединица ESCRT-I используется также ретровирусами (Ebola и human immunodeficiency virus (HIV)) для отпочкования на плазматической мембране — в процессе топологически эквивалентном эндосомным инвагинациям48– 50. Так HIV Gag белок м. грабить (highjack) ESCRT-I комплекс воспроизводя TSG101-связывающую активность HRS45. В противоложность HIV отпочковывания от T-helper клеток большинство инфекционных HIV, которые продуцируются первичными макрофагами, собираются на поздних эндоцитотических мембранах51, это преимущественно указывает на то, что вирус также м. использовать ESCRT-I комплекс на эндосомах.
Fab1/PIKFYVE and protein sorting. Демонстрация роли HRS в сортировке рецепторов и образовании пузырьков внутри просветов не исключает возможности того, что др. PtdIns3P-связывающие белки м. участвовать в этих процессах. Интеречным кандидатом является Fab1, S. cerevisiae PtdIns3P 5-kinase, и её гомолог у млекопитающих PIKFYVE. Подобно HRS, Fab1/PIKFYVE содержит FYVE домен, который является критическим для его локализации на мембранах эндосом52. S. cerevisiae FAB1 мутанты имеют необычно увеличенные вакуоли и обнаруживют дефекты отсортировки определенных белков в пузырьки внутри просвета12,53. Сходным образом, доминантно-негативные мутанты PIKFYVE взывают увеличение эндосом в клетках млекопитающих54. Однако, путь ECV/MVB остаётся функциональным у мутантов FAB1, это указывает на то, что Fab1/PIKFYVE не обязателен для образования пузырьков внутри просвета, а нужен только для сортировки субнабора белков в пузырьки внутри просвета55. Недавняя находка, что Vps24 (субъединица ESCRT-III; BOX 1) взаимодействует с phosphatidylinositol- 3,5-bisphosphate (PtdIns(3,5)P2) — каталитическим продуктом Fab1/PIKFYVE — указывает на то, что PtdIns(3,5)P2 м. действовать как активатор ESCRT-обеспечиваемой сортировки белков56.

ECV/MVB biogenesis


Отсортировка белков в ECV/MVBs, по-видимому, связана механистически с процессом инвагинации мембраны посредством PtdIns3P сигнального пути и HRS, но белок-сортирующая кухня (machinery), по-видимому, не играет непосредственной роли в биогенезе самих ECV/MVB, т.к. предопределяется с помощью ECV/MVB лимитирующей мембраны29,40,41. Каковы же механизмы, которые регулируют биогенез транспортных промежуточных ECV/MVB? Установлено, что annexin-II является частью стержневой machinery, которая регулирует биогенез ECV/MVB в клетках млекопитающих57 и что он также контролирует распределение recycling эндосом58. Это согласуется с предыдущими наблюдениями, которые показали, что annexin-II играет роль в динамике эндосомных мембран 59,60. Annexins — которые не экспрессируются в клетках S. cerevisiae — образуют семейство из 13 белков у млекопитающих, некоторые из которых являются ткане-специфичными. Они обнаруживаются и в цитоплазме и в связи с мембраной и преимущественно участвуют в процессах, связанных с мембранами, включая мембранный трафик61. Все annexins содержат endonexin складку (Ca2+-связывающий мотив), которая повторяется 4 или 8 раз и обнаруживают in vitro свойства, общие с негативно заряженными фосфолипидами, Ca2+-зависимым образом. Однако, annexin-II ассоциирует с ранними эндосомами, но вообще-то не с плазматической мембраной62, используя нетрадиционный механизм, который является Ca2+-независимым. но холестерол-зависимым59,63. Фактически, annexin-II м. взаимодействовать физически с мембранным холестеролом. Он неправильно локализуется в поздних эндосомах, которые нагружены cholesterol в клетках Niemann–Pick type-C57. Подавление экспрессии ANXA2 (гена, кодирующего annexin-II) в обработанных siRNA клетках ингибирует транспорт от ранних эндосом к поздним и биогенез ECV/MVB, без нарушения самого процесса инвагинации мембран57. В самом деле, мультивезикулярные регионы формируются, но они неспособны отшнуроваться от ранних эндосом, чтобы стать свободными ECV/MVBs. Итак, annexin-II, по-видимому, регулирует отсоединение ECV/MVBs от ранних эндосом, но не образование внутренних мембран (Рис. 2c,d). Annexin-II, по-видмимоу, ассоциирует со специализированными доменами мембран ранних эндосом, которые видны в электронный микроскоп63, это согласуется с наблюдениями, что некоторые annexins стремятся само-организоваться в би-димерно упорядоченные массивы на поверхности мембраны64. Легко предположить, что annexin-II формируют богатые холестерином платформы, которые организуют мембраны ранних эндосом в самом начали пути деградации — функция, которая, по-видимому, использует взаимодействия с актиновым цитоскелетом63,65. Т.к. клетки S. cerevisiae не экспрессируют annexins, то разумно предположить, что клетки высших эукариот используют др. механизмы, которые зависят от annexin-II (и, по-видимому, др. факторов) и что это отраждает их потребность в тонком контроле динамики мембран эндосом и в биогенезе ECV/MVB. В самом деле, медленные и быстрые маршруты рециклинга белка из ранних эндосом обратно на клеточную поверхность, которые представляют собой главные маршруты переноса в клетках млекопитающих (Рис. 1), не обнаруживаются у S. cerevisiae. Если и присутсвуют, то эти маршруты, по-видимому, менее важны для S. cerevisiae и основным путём м.б., следовательно, образование ECV/MVBs. Напротив, компоненты мембран главным образом подвергаются рециклингу в клетках млекопитающих66, так что эти клетки м. использовать более сложные механизмы для регуляции начала пути деградации. Др. annexins, очень сходные с annexin-II, м. предопределять специфические платформы на др. клеточных мембранах, в частности, annexin-XIII67, который вообще даёт простейшее объяснение для многочисленных клеточных функций, которые приписываются членам семейства аннексинов61. Др. механизмы вероятно вносят вклад в комплекс — и преимущественно существенный— в процесс биогенеза ECV/MVB в клетках млекопитающих. Эндосомный coatomer protein (COP) комплекс и ARF1 (ADP ribosylation factor-1), как полагают, играют роль в транспорте в поздние эндосомы и в биогенезе ECV/MVB16,68–72 — вообще-то стоят выше annexin-II и HRS, т.к. инактивация COP нарушает организацию ранних эндосом69. Кроме того мутанты RAB7 обусловливают накопление cathepsin-D и MPR в ранних эндосомах73. Это м. указывать на то, что эти GTPase, которые обнаруживаются в поздних эндосомах, играют роль в экспорте белка из ранних эндосом, это согласуется с идеей частичного перекрывания RAB платформ74.

Summary and conclusions


In summary, two crucial, sequential steps in the biogenesis of ECV/MVBs can now be dissected mechanistically in mammalian cells (Рис. 3). The silencing of HRS or ANXA2 expression indicates that membrane invagination and the formation of a free ECV/MVB can be uncoupled, so these processes might occur sequentially during ECV/MVB biogenesis. Evidence also shows that the the sorting of activated, ubiquitylated receptors into ECV/MVBs is coupled functionally to the membrane-invagination process through a PtdIns3P signalling pathway.Although the precise mechanism that drives the invagination process is still unclear, progress has been made in our understanding of receptor sorting. A possible scenario is as follows: when ubiquitylated receptors arrive in early endosomes they can bind HRS, which is retained at the membrane through its association with PtdIns3P. Through its interactions with clathrin, HRS sorts theubiquitylated receptors into clathrin-coated domains of early endosomes. Presumably, the ubiquitylated receptors are then handed over to ESCRT-I and then sequentially to ESCRT-II and -III, which can drive both receptor incorporation into the membrane invaginations of newly forming ECV/MVBs and the membraneinvagination process itself. Next, the subsequent biogenesis of newly formed ECV/MVBs seems to require annexin-II, which is presumably associated with cholesterol-rich platforms. Clearly, other mechanisms probably have a role in the formation of endosomal membranes in the early degradation pathway. Evidence now indicates that endosomal membranes are organized as a mosaic of specialized membrane domains, which are defined by the distribution of lipids, protein–lipid complexes and protein–protein complexes that are assembled at the membrane surface8.A challenge for the future will be to unravel the mechanisms that integrate the functions of these different protein/lipid assemblies and the molecular machines that are involved in the processes of protein/lipid sorting and membrane biogenesis.


Correspondence to J.G. and H. S. e-mails: jean.gruenberg@biochem.unige.ch; h.a.stenmark@farmasi.uio.no
Сайт создан в системе uCoz