Несмотря на снижение по всему геному метилирования ДНК некоторые последовательности остаются устойчивыми к общему деметилированию во время постимплантационного развития. Особый интерес представляет наблюдение, что DMRs из импринтируемых генов и определенных классов повторов освобождены от этих событий деметилирования. Анализ метилирования обработанных бисульфитом ДНК, выделенной из ооцитов или спермиев подтвердил, что intracisternal A частицы сохраняют своё метилирование. Это наблюдение ставит вопрос о роли как активного, так и пассивного деметилирования во время преимплантационного развития. Значение активного деметилирования находится в центре дебатов. Выдвинуто две гипотезы для объяснения необходимости активного деметилирования. Специфичная для отцов потеря метилирования м.б. просто необходима, чтобы сделать возможной генерализованную де-репрессию отцовских аллелей, чтобы приспособиться к минорной транскрипционной вспышке в конце первого клеточного цикла. Вообще-то более вызывающим является участие активного деметилирования в разрешении родитель-потомок конфликта, который возникает благодаря экспрессии импринтированных генов. Это предположение воплощается в эволюционном принципе, имеющем целью борьбу каждого родителя за максимализацию своей собственной генетической приспособленности за счёт гарантии трансмиссии своего генетического наследства. Т.о., отцовский интерес заключается в осуществлении контроля над генами, которые делают максимальным рост и жизнеспособность индивидуальных потомков, тогда как материнский интерес д. заключаться в умеренном росте отдельного индивида за счёт преимуществ для всего выводка. Это посредничество м. оказаться возможным за счёт селективного метилирования и деметилирования ростовых регуляторных генов. В этой связи многие идентифицированные импринтируемые гены обладают рост регулирующими функциями или влияют на постнатальное поведение вскармливания.
Ряд предсказаний вытекает из этой гипотезы. В подтверждение мнения, что активное деметилирование возникает в контексте импринтинга у млекопитающих, м. служить наблюдение, что ни у Xenopus, ни у zebra fish не обнаруживается активного деметилирования. Более того, следует ожидать, что активное деметилирование д.б. законсервировано у млекопитающих и д. происходить в первом клеточном цикле скорее, чем непосредственно перед активацией зиготического генома. Активное специфичное для отцов деметилирование было подтверждено и у некоторых др. млекопитающих, включая крыс, свиней и телят и частично у овец. однако, остаётся иллюзорным идентифицирование этой активной деметилазы. Анализировали первый клеточный цикл у мышей в отношении специфичного для отцов деметилирования с использованием чрезвычайно чувствительных и специфичных антител к 5-methyl cytidin (5MeC). Чтобы достичь профиля высокого разрешения материал генерировался с помощью
in vitro fertilization (IVF). Благодаря этому становилось возможным контроль над очень ранними событиями после оплодотворения и определение скорости и более точно временной точки деметилирования. После оплодотворения мужские и женские гаметы находятся на разных стадиях мейотического созревания (Рис. 2А). Женские арестованы в MII метафазе в ожидании сигнала к завершению мейоза. Мужские из-за гаплоидности скомплексованы в почти инертную тороидную конфигурацию, уникальную присутствием протаминов. Т.о., чтобы восстановить диплоидный набор зиготы необходимо экстенсивное ремоделирование. Оно связано с деконденсацией и заменой нуклеопротаминов на нуклеогистоны. Замена на нуклеогистоны происходит уже в самое раннее время, доступное для антител, она м.б. продемонстрирована в деконденсированных спермиях мышей. Специфичное для отцов деметилирование наблюдается самое раннее в 3 ч. и заканчивается к 6 ч IVF, т.е. в течение нескольких часов во время инициации репликации ДНК.
Active demethylation: mechanisms and candidate activities
Т.к. выделение деметилазной активности непосредственно из ооцитов мышей не возможно, то использовали некоторые экспериментальные манипуляции. Мы попытались титровать деметилазную активность в ооцитах мышей, используя условия пригодные для полиспермии. При соотв. условиях до 5 спермиев м. созревать в MII ооцитах. Несмотря на чёткие доказательства титрации др. компонентов, необхдимых для образования пронуклеусов, деметилирование избыточных пронуклеусов самцов происходило беспрепятственно (Рис. 3А). Этот неожиданный результат указывает на то, что ооциты чрезвычайно хорошо снабжены деметилазой и что специфичность тонко регулируется, т.к. женский пронуклеус остаётся неизменным.
Были предположены три базовых механизма активного деметилирования. Первый - это прямое удаление метильных групп из большой борозды. Это вырезание ('snipping') боковых групп необходимо для разрыва углеродных связей и продукции метанола. Вторая группа реакций д. или специфически удалять метил цитозин, замещая его цитозином или удалять CpG динуклеотиды с помощью эксцизии нуклеотидов, зависимого от репликации процесса репарации ДНК. Третья возможность - это гидролитическое деаминирование, которое д. приводить к конверсии 5-метил-цитозина в тимин, который постепенно репарируется в следующем цикле репликации. Энергетически последний механизм наиболее предпочтителен, однако, м. только рассуждать о ферментативных путях деаминирования.
Несколько кандидатов рассматривалось на роль активной деметилазы. одна группа исследователей сообщала об активности для methyl binding domain protein 2 (MBD2), который удовлетворяет критериям активной деацетилазы. Скептики полагали, что MBD2 возможно является кандидатом у ранних эмбрионов. Гомозиготные ооциты, окрашенные антителами к 5MeC, как было установлено подвергаются активному деметилированию (Рис. 3D). MBD4, uridine deglycosylase, как полагают, обладает активностью деметилазы благодаря своей роли в репарации ДНК. Оплодотворённые ооциты, гомозиготные по делеции, имеют паттерн окрашивания, неотличимый от контроля (Рис. 3D)/ Этот чёткий результат указывает на то, что MBD4 не обладает активностью, отвечающей за активное деметилирование у ранних эмбрионов мышей.
Повторная гидрация ДНК спермиев во время созревания пронуклеусов представляет интригующие предпосылки по специфичному для отцов активному деметилированию. Упаковка гаплоидного набора ДНК в зрелом спермии является сама по себе инженерным триумфом. Чрезвычайное уменьшение в размере обусловлено исключением молекул воды , это создаёт интересный источник "свободной энергии" для деконденсации спермия. Этот процесс является продуцирующим энергию и в контексте купированных реакций м.б. способным к снабжению энергией, необходимой для деметилирования. Активности, ремоделирующие связанный с АТФ хроматин, такие как те, что обеспечиваются lymphoid-specific helicase (LSH), члена семейства SNF/helicase, существенны для нормального развития мышей и ассоциированы с установлением паттерна метилирования. М. предполагать. что внутри этого ремоделирующего комплекса находится активность, которая функционирует на этой ранней стадии своей уникальной способностью в качестве ДНК деметилазы.
Epigenetic reprogramming beyond the first cell cycle
Снижение метилирования ДНК в основном из материнского происхождения последовательностей осуществляется ступенчато-образно вплоть до стадии морулы, когда очень маленький сигнал м.б. выявлен с помощью 5МеС окрашивания антителами. Эта пассивная потеря метилирования происходит, т.к. ооцитарная форма первичной метил трансферазы (Dnmt1o), активно исключается из ядра несмотря на экстраординарное обилие белка, наследуемого цитоплазматически. В наиболее впечатляющей и специфической форме временной регуляции Dnmt1 исключен за исключением единственного клеточного цикла на 8-клеточной стадии. Интересно, что делеция Dnmt1o 5' экзона вызывает в результате аннулирование признаков импринтируемого метилирования, и это не м.б. после этого восстановлено. Что же представляет собой 8-клеточная стадия? Ответ заключается в изменении тотипотентности, которая происходит в это время, когда бластомеры эмбриона обнаруживают разные клеточные свойства и, как известно, приобретают 'inside-outside identity', самое первое событие клеточной детерминации. Эти изменения ведут к формированию презумптивного эмбрионального (inside; ICM) и презумптивного внеэмбрионального (outside; TE) клонов. В 5-м клеточном цикле инициируется финальная фаза репрограммирования метилирования. Метилирование
de novo обнаруживается в обоих клеточных клонах бластоциста. Однако, только ICM становится геперметилированным по сравнению с ТЕ. Это создаёт асимметричный уровень метилирования в соматических клетках, производных ICM, и в плаценте, производной ТЕ.
Epigenetic remodelling in the early embryo: implication for somatic nuclear transfer
Т.к. установление специфичного для отцов деметилирования в оплодотворённых ооцитах связано со структурой хроматина и организацией, пермиссивной для этого события, то этот вопрос в фокусе нашего внимания. В организмах, которые обладают метилированием ДНК, существует взаимосвязь между этими эпигенетическими маркирующими системами, чтобы специфицировать состояние транскрипции, и структурными свойствами хроматина.
5' N-терминальные хвосты стержневых гистонов нуклеосом расположены в большой борозде двойной спирали и м.б. ковалентно модифицированы с помощью пост-трансляционного добавления, включая метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование и FLA-рибозилировние по лизину, серину и аргинину. Это позволило предположить, что интерпретация лежащего в основе генетического кода была частично достигнута благодаря комбинационным модификациям ключевых аминокислотных остатков стержневых гистонов или "гистонового кода". Переключения между этими модификациями ассоциированы со специфическими сайтами хроматина и переходом от активной к неактивной конфигурации. В целом метилирование остатков ассоциирует с репрессией транскрипции, тогда как ацетилирование, как известно, сопровождает активно транскрибируемые регионы. Учитывая эту возможность исследования и были сконцентрированы на остатках стержневых гистонов, которые м. воспринимать любую модификацию. Большинство исследований посвящено значению хроматиновых модификаций по лизину 9 гистона Н3 (Н3-К9).
Учитывая асимметричную потерю метилирования ДНК с отцовского компартмента, исследования модификаций хроматина в одноклеточных оплодотворённых ооцитах представляют особый интерес. Используя специфичные к гетерохроматину антитела, чтобы деметилировать Н3-К9 (anti-α-4x-methH3-K9) оказалось возможным продемонстрировать, что деконденсированные спермии и созревшие мужские пронуклеусы являются негативными для подобной модификации. напротив женские пронуклеусы интенсивно окрашиваются для той же самой конфигурации, которая остаётся в течение всего первого клеточного цикла. Несмотря на эту асимметрию метилирования гистонов, ацетилирование Н3-К9 обнаруживается обильное в обоих пронуклеусах.
Ремоделирования ядра спермия является обязательным условием для оплодотворения (Рис. 2А). Замена нуклеопротаминов на нуклеогистоны происходит во время первых часов после оплодотворения. Ацетилирование гистонов происходит в цитоплазме с помощью histone acetyl transferases (HATs) тем самым гистоны приобретают ацетилированные лизины в N-терминальных хвостах. Метилирование происходит в ядрах, обеспеченных с помощью histone methyl transferases (HMTs). Переход сначала вызывает удаление групп ацетилирования, катализируемое с помощью histone deacethylases (HDACs). N/j// гладкий переход от активного (acetylated) к неактивной и потенциально молчащей (метилированой) конфигурации хроматина нуждается в серии специфических энзиматических активностей. В настоящее время не выявлено активности лизин-специфической гистоновой деметилазы и т.о., единственным механизмом реактивации молчащих локусов м.б. замещение гистонов.
Асимметричное распределение хроматина, организованного в оплодотворённых ооцитах ставит ряд интересных вопросов. Специфичные к гетерохроматину антитела, как известно, ассоциируют с около- и центромерными сателлитными последовательностями и др. важными участками гетерохроматина по всему геному. Присутствие methH3-K9 ассоциирует с транскрипционной репрессией. Конфликт возникает из наблюдения, что хотя оба мужской и женский пронуклеусы транскрипционно молчат, только женский имеет хроматин в форме, ассоциированной с репрессией генов. Минимальная вспышка транскрипционной реактивации происходит в конце первого клеточного цикла с аллелями отцовского происхождения, экспрессируемыми заранее (in advance). Эти расхождения указывают на то, что codified интерпретация гистоновых модификаций м.б. специфической и самостоятельной в гаметах и эмбрионах по сравнению с соматическими клетками, где тотипотентность прогрессивно ограничивается.
Интересно. что женские пронуклеусы сохраняют ДНК метилированной и обладают метил гистоновыми модификациями предположительно механистической связи между этими двумя эпигенетическими системами. Это говорит о том, что, по крайней мере, возможны две интерпретации. Или организация хроматина женских пронуклеусов резистентна к активности, обнаруживаемой в обоих компартментах иил самцовые специфически чувствительны и служат мишенями для деметилирования.
Epigenetic reprogramming on somatic nuclear transfer
Может ли высоко метилированные (ДНК) ядра дифференцированных соматических клеток подвергаться репрограммированию при клонировании, чтобы обеспечить развитие до рождения? Если да, то как обходится система клеточной памяти, призванная гарантировать точность дифференцированного клеточного типа? М. ли ооцит, призванный ремоделировать нуклеопротамины, распознаёт хроматиновую конфигурацию соматической клетки и создаёт эпигенетическое состояние, эквивалентное таковому оплодотворённого ооцита?
Мы начали изучать некоторые из этих вопросов в связи с переносом соматических ядер у млекопитающих, сконцентрировавшись на клонируемых эмбрионах преимплантационной стадии. Из-за имеющихся трудностей при попытках клонирования у мышей мы стали использовать тот факт, что перенос соматических ядер у крупного рогатого скота хорошо разработан. Характеристика 50methyl cytosine биологии преимплантационных эмбрионов телят выявила активное деметилирование отцовского пронуклеуса, пассивное деметилирование во время 2- и 4-клеточной стадии и
de novo метилирование на 10-16-клеточной стадии (Рис. 4А). На стадии бластоциста ICM гиперметилированы по сравнению с трофэктодермой, паттерн сходный с таковым у мышей. Изучение метилирования в околоцентромерном гетерохроматине с использованием антител к Н3-К9 выявило скоординированную модуляцию вместе с ДНК метилированием, указывающим на механистические взаимоотношения между этими двумя эпигенетическими системами.
Эпигенетические профили клонируемых эмбрионов, получаемых от двух разных донорских источников. показали, что количественная и качественная дерегуляция метилирования ДНК и гистонов происходит в реконструировнных эмбрионах. Вообще-то наиболее важным аспектом таких эмбрионов был похожий паттерн метилирования ДНК и организации гетерохроматина с таковым донорских клеток (Рис. 4В) и потеря клонов, базирующихся на ассиметричных паттернах эпигенетических маркёров (Рис. 4С). Более того, выявлена корреляция между нормальным эпигенотипом и скоростью развития до стадии бластоциста, предсказывающая нормальность развития.
Эти результаты подчёркивают тот факт, что одним из ключевых признаков переноса соматических ядре м.б. возникновение условий, которые делают возможным стирание системы наследственной памяти, которая является отличительным признаком дифференцированных типов клеток. Кроме того, отбор донорских популяций, которые врожденно более способны к репрограммированию цитоплазмой ооцита м.б. существенным. Эти критерии сегодня описаны только с помощью эпигенетического профилирования с использованием антител; однако, они являются мощными инструментами, которые позволят скринировать минимум тканей
...
Сайт создан в системе
uCoz
