Посещений:
Экзосомы

Функция

Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages
Benoit Feґ vrier and Gracёa Raposo
Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:1–7

Exosomes are membrane vesicles released into the extracellular environment upon exocytic fusion of multivesicular endosomes with the cell surface. They have a particular composition reflecting their origin in endosomes as intraluminal vesicles. In vitro and in vivo studies support the contribution of exosomes to an acellular mode of communication, leading to intercellular transfer of molecules. Exosomes may have regulatory functions in the immune system and their application in cancer immunotherapy is promising. The mechanisms involved in exosome secretion and interaction with target cells are as yet unclear. A better understanding of these mechanisms is also essential to determine the link between exosomes and retroviruses.
Концепция экзосом как происходящих не из плазматических мембран пузырьков возникла после описания процесса потери ('shedding') transferrin receptor (TfR) во время созревания ретикулоцитов. Процесс высвобождения, по-видимому, нуждается, во-первых, в сортировке в маленькие пузырьки, содержащиеся с эндосомах, во-вторых, в слиянии ограничивающей мембраны таких эндосом с клеточной поверхностью, в результате чего высвобождаются эти маленькие пузырьки во внеклеточное пространство [1-3]. Небольшие пузырьки, которые имеют размеры примерно 50-90 nm в диаметре, названы 'intraluminal vesicles' (ILVs), т.к. они содержатся внутри мультивезикулярных эндосом и 'exosomes' если они высвобождаются во внеклеточную среду.
Мултивезикулярные эндосомы, обычно наз. multivesicular bodies (MVBs) на основании их морфологии [4], обладают хорошо известными функциями как промежуточные образования на пути деградации белков, интернализованных с клеточной поверхности или отсортированных из trans Golgi сети (Рис.1). Белки предназначенные для деградации отсортировываются в ILVs из вновь сформированных MVB. MVB затем сливаются с предсуществующими лизосомами [5]. Исследования на ретикулоцитах продемонстрировали, чтоt MVBs и их ILVs м. также, в качестве альтернативы, сливаться с плазматической мембраной, чтобы удалить 'устарелые' белки, которые не следуют по пути внутриклеточной деградации [6].
Установлено, что antigen presenting cells (APCs), такие как B lymphocytes и dendritic cells (DCs) секретируют экзосомы во время экзоцитотического слияния мультивезикулярных MHC class II компартментов с клеточной поверхностью [7,8]. В противоположность экзосомам, высвобождаемым ретикулоцитами во время из дифференцировки, чтобы освободиться от TfR, экзосомs, секретируемые с помощью APCs, по-видимому, являются функциональными. Они обладают способностью стимулировать пролиферацию Т клеток in vitro [7] и индуцировать противо-опухолевую иммунную реакцию in vivo [8]. Т.к. затем экзосомы были выделены из клеточной культуры супернатантов от многих др. гематопоэтических и не гематопоэтических клеток, таких как Т лимфоциты, mast клетки, тромбоциты, клетки кишечного эпителия и некоторых линий опухолевых клеток [9-13].

Morphological and biochemical definition of exosomes


Идентификация пузырьков в качестве экзосом базируется на морфологических и биохимических критериях. Учитывая их малые размеры, экзосомы м.б. видимы только в ЭМ. Клетки, секретирующие экзосомы, обнаруживают экзоцитотическое слияние MVBs, процесс, аналогичный секреции секреторных гранул. ILVs, поэтому называются exosomes, они обнаруживаются в межклеточных пространствах (Рис. 2). Иммуноцитохимический анализ показал, что белки, присутствующие в

Schematic representation of the endocytic pathway. Membrane proteins (shown in red) internalized through clathrin-coated vesicles are delivered to early endosomes. In early endosomes, molecules are either recycled to the plasma membrane or sequestered in internal vesicles. Early morphological observations revealed that the internal vesicles of MVBs are generated by budding from the limiting membrane into the lumen of endosomes [60]. In the degradation pathway, MVBs fuse with lysosomes. In several haematopoietic and non-haematopoietic cells, MVBs fuse with the plasma membrane, in which case the internal vesicles of the MVB are released into the extracellular medium as exosomes. Exosomes display the same orientation as the plasma membrane, with extracellular domains of proteins exposed at the surface, and enclosing a droplet of cytoplasm.

MVBs и, в частности, в ILVs, встречаются в больших количествах в экстернализованных пузырьках. Напр., изучение В лимфоцитов и DCs человека облегчается присутствием в мультивезикулярных компартментах MHC class II белков семейства tetraspanin (напр., CD63, CD81) [8,14] (Рис. 1 и 2). Для дальнейшей морфологической и биохимической характеристики экзосомы м.б. изолированы из среды клеточной культуры с помощью дифференциального ультрацентрифугирования [7]. Супернатанты жизнеспособных клеточных культур центрифугируются с низкой скоростью для удаления клеточного дебриса и и др. клеточных загрязнений в результате лизиса клеток. Экзосомы, подобно любым мелким мембранным пузырькам, отделяются (pelleted) при 100 000 g. Необходимо учитывать возможность присутствия экзосом в сыворотке плода теленка, но они удаляются предварительным ультрацентрифугированием культуральной среды при 100 000 g [15,16]. Для удаления растворимых белков, которые м. ассоциировать неспецифически с экзосомами, м.б. использована дополнительная очистка с помощью плавучести pelleted мембран в непрерывном градиенте сахарозы [7,14]. Экзосомы 'float' в плотности, близкой к 1.13 g/ml, но это м. варьировать от клетки в клетке в зависимости от белкового содержимого экзосом exosome [15]. Разработан и альтернативный метод ультрациентрифугирования и центрифугирования в sucrosedeuterium oxide (D2O) подушке, чтобы получать clinical-grade очищенные экзосомы [17]. После очистки экзосомы м.б. охарактеризованы морфологически и по присутсвию белковых маркеров. Электронная микроскопия негативно окрашенных экзосом выявляет 'cup shaped' мембранные пузырьки диаметром 50-90 nm. Часто наблюдаются и более мелкие пузырькир на тех же самых препаратах. Не исключено, что морфологическое проявление экзосом зависит от химической

Fusion of MVBs with the cell surface and exosome release. Left panel: Detail of an ultrathin cryosection showing evidence for exocytic fusion of a MVB with the plasma membrane (PM). MHC-class-II-positive exosomes are present in the extracellular space. Clathrin-coated pits are often observed at the plasma membrane in exocytic areas (arrow). Scale bars: 100 nm. Right panel: Purified exosomes were put on formvar-carboncoated electron microscopy grids, fixed, contrasted and embedded using a mixture of methyl cellulose and uranyl acetate. Inset: exosomes were double immunogold labeled for MHC class II and CD63. Primary antibodies were visualized with protein A coupled to gold (PAG10 and PAG5, respectively) before contrasting and embedding. Scale bars: 100 nm.

фиксации и/или от пропитки и контраста с uranyl-acetate и methylcellulose. Криоэлектронная микроскопия cryofixed не контрастированных экзосом выявляет округлые мембранные пузырьки. Сравнительный western блотинг клеточных лизатов и экзосом необходимы для выявления ILV белков. Такой анализ необходим, чтобы оценить отсутствие клеточного загрязнения из клеточных лизатов (напр., компонентов эндоплазматического ретикулема, таких как calnexin и grp94). Белки, присутствующие в плазматической мембране и в эндоцитотических компартментах, отличны от таковых в MVBs и обычно экспрессируются на низких уровнях в экзосомах (напр., TfR в не-reticulocytic клетках).

The protein and lipid composition of exosomes relates to their biogenesis


Получение высоко очищенных экзосом делает возможным их анализ с помощью proteomics. Белковый состав экзосом, проанализированный с помощью SDS-PAGE и окрашивания Coomassie blue, отличается от такового для целых клеточных лизатов. Сравненеие данных по экзосомам, секретируемым мышиными DCs, человеческими intestinal epithelial cells (IECs) в условиях воспаления и EBV-трансформированными В лимфоцитами человека выявили общие и специфические для типа клеток составляющие [12,16,18-20]. Экзосомы из этих клеток содержат молекулы MHC class II и class I, цитозольные хапероновые белки, субъединицы тримерных G белков, цитоскелетные белки, annexins, integrins, энзимы и факторы элонгации (Box 1). Некоторые из этих белков обладают известными функциями в слиянии, адгезии и биосинтетических процессах, но для большинства предполагаются специфические роли в формировании и функции экзосом.
Прорывом стала идентификация в экзосомах белков, которые являются частью кухни (machinery) участвующей в биогенезе MVB [21,22]. DC-производные экзосомы содержат Tsg101 и Alix [19], которые являются частью консервативной кухни, отбирающей ubiquitinated грузовые белки для отсортировки в ILVs [21,22]. Tsg101 является одним из компонентов т.наз. комплекса эндосомной сортировки, необходимого для транспорта (endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-I) [23]. Alix , как было установлено, соединяется с ESCRT-II и ESCRT-III [24]. Эти компоненты. как считается, делают возможным отпочкование и отшнуровывание внутрь ILV, но диссоциируют от эндосомных мембран благодаря действию AAA ATPase VPS4 [21,22]. Несмотря на это остаточные количества Tsg101 и Alix м.б. инкорпорированы в цитозоль ILVs во время процесса почкования [19]. Т.к. ubiquitination является одним из важных сортирующих сигналов для секвестрирования груза в ILVs, то становится очевидным, что др. сигналы также м. оперировать [25]. В ретикулоцитах, в которых TfR избегают рециклинга они отсортировываются в ILVs для высвобождения их посредством экзосом, продемонстрировано, что рецепторы непосредственно ассоциируют с Alix. Эта ассоциация возможно связывает TfR с ESCRT кухней [26]. Alix, вместе с липидными микроусловиями, по-видимому. играет также роль в

Box 1 Protein and glycolipid composition of exosomes
Antigen presentation
MHC class I, MHC class II
Costimulation: CD86
Adhesion molecules
MFG-E8a
Integrins: a3, a4, aM, aL, b1, b2
Tetraspanins: CD63, CD9, CD37, CD53, CD81, CD82
Membrane transport and fusion
RAP1B/RABGDI, Rab 7, Rab 2
Annexins: I, II, IV, V, VI, VII
Heat-shock proteins
HSC70, HSP84/90
Cytoskeletal proteins
Actin, cofilin, tubulin, moesin
Raft-associated proteins and glycolipids
Flotillin, CD55, CD59, GM1, GM3, Gi2a
Enzymes
Pyruvate kinase, alpha enolase
Others
Elongation factor 1a, 14-3-3, clathrin, ferritin
ESCRT proteins: Alix, Tsg 101

Analysis by proteomics, western blot and immuno electron microscopy of exosomes secreted by human B lymphocytes, mouse DCs, human and mouse IECs, reticulocytes, mast cells.
aMFGE-8 (lactadherin) has been found only on exosomes from murine cells


процессе везикуляции [27]. Метаболизм фосфолипидов важен для биогенеза MVBs [21]. Способность определенных белков, таких как tetraspanins, участвовать в липидных микродоменах [28] м. позволять им отсортировываться в ILV независимо от цитозольной ESCRT кухни. Описание липидного состава экзосом из immuno-изолированных B клеток с помощью тонкослойной хроматографии делает возможным обогащение sphingomyelin, cholesterol и glycolipid GM3 [16], липидами, которые являются критическими для поддержания плотиков [29]. Обогащение холестеролом экзосом также установлено с помощью ЭМ при использовании токсина persphingolysin [30]. Согласуются с этими raft-подобными свойствами липидов и 'raft proteins' (flottilin, stomatin и lyn), присутствующие в экзосомах ретикулоцитов и В лимфоцитов [31]. Glycosylphosphatyidylinositol (GPI)-закрепленные белки CD55 и CD59 также ассоциируют с экзосомами [32], защищая их от complement-обусловленного лизиса [33]. Интересно, что анализ липидов экзосом из mast-клеток и DC указывает на то, что одним из характерных признаков экзосом во сравнению с плазматической мембраной является увеличение перемещений фосфолипидов через бислой (процесс, наз. flip-flop), ведущее к потере асимметрии липидов в экзосомных мембранах. Высокий уровень flip-flop вместе с наблюдаемой их ригидностью при нейтральном pH [34] м. иметь последствия для способности экзосом сливаться с др. мембранами и их стабильностью в кровообращении.

Exosome functions


Первоначально было установлено, что экзосомы обладают функциональными MHC class II и class I , а также ко-стимулирующими и адгезивными молекулами, однако интерес к ним был разбужен их использованием в качестве устройств для стимуляции противоопухолевых иммунных реакций in vivo [35]. Эти исследования уже привели к клиническим испытаниям экзосом, происходящих из DC, несущих MHC class II и class I, нагруженные опухолевыми антигенами. Стратегии вакцинации были также предложены с использованием экзосом, происходящих из опухолевых клеток, которые несут опухолевые антигены [13,36].
Несмотря на это физиологическое значение экзосом все ещё понятно не до конца. Экзосомы присутствуют в сыворотке (MP Caby, D Lankar, G Raposo, C Bonnerot, unpublished), в злокачественных выделениях (effusions) [36,37], в bronchoalveolar выделениях [38] и на поверхности follicular DCs (FDCs) в зародышевых центрах [39]. Экзосомы м. т. о., выполнять важную иммуномодулирующую функцию как в нормальных, так и патологических ситуациях. Намеки на возможные механизмы недавно получены в некоторых исследования in vivo у мышей. В согласии со стимулирующей ролью в иммунном ответе, экзосомы, секретируемые DCs, м. извлекать Т клетки in vivo [40]. Экзосомы, секретируемые IECs, несмотря на отсутствие в них ко-стимулирующих молекул, как было установлено, индуцируют гуморальные иммунные реакции [20]. Эти стимулирующие эффекты DC и IEC экзосом, однако, по-видимому. не обусловлены непосредственным взаимодействием с Т клетками, как это было показано для В-клеточных экзосом [7]. В этих моделях экзосомы, по-видимому, находят соседние APC. In vitro исследования подтверждают такую модель: DC-производные экзосомы, нагруженные MHC-class-I-restricted пептидами, активируют соответствующие CD8+ T клеточные клоны, подтверждая присутствие DCs в культуре [41]. Экзосомами обеспечиваемы перенос MHC-пептидных комплексов происходит также и между DCs. Такой перенос приводи в результате к амплификации иммунной реакции как в результате увеличения количества клеток, несущих MHC-пептидные комплексы [40,42]. Перенос экзосом происходит также между разными типами клеток. DCs и B lymphocytes способны представлять антигенные пептиды, происходящие из экзогенных антигенов, высвобождаемых с помощью экзосом из mast клеток [43]. Это коррелирует с переносом экзосом B lymphocyte на поверхность FDCs в зародышевых центрах [39].
Экзосомы. однако, связаны не только со стимулирующими реакциями в иммунной системе. Установлено, что экзосомы, происходящие от доноров, вносимых перед трансплантацией, м. индуцировать толерантность скорее, чем иммунитет, индуцируя достоверное увеличение выживаемости аллотрансплантата [44]. Более того, присутствие HLA-G в экзосомах, секретируемых клетками меланомы, подтверждает, что они м.б. вовлечены в реакцию устойчивости против опухоли [45].

Intercellular transfer of exosomes and regulation of exosome secretion


Всё это привело к гипотезе, что экзосомы м. представлять новый способ межклеточного общения [15,46]. Пока неясно, как экзосомы взаимодействуют со своими клетками-мишенями. М. б. предположены разные способы взаимодействия для разных типов клеток и это м.б. прямо связано с их функциями. Экзосомы м. сливаться с плазматической мембраной или эндоцитозироваться с помощью неизвестного способа интернализации. Экзосомы часто высвобождаются в виде небольших агрегатов, которые воспринимаются соседними клетками посредством механизма фагоцитоза. Нельзя исключить, что экзосомы в основном прикрепляются к клеточной поверхности, придавая новые свойства клеткам-мишеням [39].
Неизвестны также механизмы, регулирующие слияние MVB с клеточной поверхностью и тем самым сами секреторные процессы. EBV-трансформированные B-клеточные линии, прежде всего DC культуры и опухолевые клетки, обнаруживают постоянную секрецию экзосом. Для mast клеток и ретикулоцитов, предположено, что MVBs сливаются с клеточной поверхностью Ca2+-зависимым способом [10,47]. Mast клетки действуют не только секретируя содержимое MVBs, но также содержимое гранул с плотной сердцевиной. Не ясно, оперирует ли та же самая кухня слияния в обоих случаях. Synaptotagmin VII участвует в слиянии лизосом с клеточной поверхностью [48], но не известно, секретируется ли содержимое MVBs и лизосом сходным образом. В дополнение к soluble NSF-attachment protein receptors (SNAREs), небольшие GTPases из Rab сверхсемейства также являются очевидными кандидатами на роль регуляции пришвартовки и слияния MVB. Изучение ретикулоцитов позволило предположить, что Rab 11, Rab пути раннего эндоцитоза, м. выступать в качестве регулятора экзосомной секреции [49]. но эти исследования не позволили различать, действуют ли этиRab 11 мутанты на уровне образования экзосом или секреторных событий per se. Др. кандидатами являются Rab белки, непосредственно участвующие в секреторных событиях, такие как Rab27 и Rab3 [50]. Хотя MVBs являются широко распространенными органеллами эндоцитотического пути, нельзя исключить, что клетки, секретирующие с экзосомами специальный набор белков, регулируют экзоцитотическое слияние.

Exosomes, an easy vehicle for transmissible pathogens?


Исследования ретровирусов и в частности HIV, выявили способность вирусов захватывать внутриклеточную кухню биогенеза MVB для своего собственного отпочкования на клеточной поверхности; они м. также эксплуатировать кухню эндосом, где они нормально действуют [51]. В макрофагах людей, MHC class II компартменты со всеми характерными при знаками поздних эндоцитотических MVBs являются основным местом отпочкования и накопления HIV [52,53]. Это вместе со сравнительным изучением экзосом и HIV частиц [54], привело к гипотезе 'Trojan exosome' [55], которая предполагает, что покрытые оболочкой вирусы вынуждены эксплуатировать MVB путь для генерации вирусных частиц. Высвобождающиеся вирусы д. затем признаваться хозяином своими ILVs и после высвобождаться в виде экзосом со всеми присущими им свойствами. Эта заманчивая гипотеза, т.к. она объясняет легкое распространение ретровирусов и из плохую способность стимулировать иммунную реакцию. В согласии с этим было установлено, что экзосомы м. индуцировать аллогенные реакции, задерживающие отторжение трансплантата in vivo, это м. иметь важные следствия для стратегии превентивной вакцинации [45]. Накопление в MVBs м.б. также благоприятным для зрелых вирусов, которые м. скрываться в хозяйском клеточном компартменте и эксплуатировать процесс экзоцитотического слияния для своего высвобождения. Тем не менее, несмотря на сходство между ретровирусами и экзосомами, имеются также некоторые признаки. которые нуждаются в дальнейшем изучении[56]. Композиция экзосом отличается от той, что в плазматической мембране. Следовательно, отпочкование вирусов от плазматической мембраны м. иметь др. композицию из intracellular/exosome-like вирусов. Более того, теперь ясно, сколь далеко вирусы модифицируют свойства MVB, внутрь которых они отпочковываются. ILVs/exosomes, возникающие в результате соединения hepatocyte growth factor tyrosine kinase substrate (Hrs) , чтобы убиквитинировать груз, который рекрутирует Tsg101. HIV-1 Gag воспроизводит Hrs и тем самым узурпирует Tsg101 и др. компоненты MVB кухни, чтобы облегчить отпочкование вирусов [57]. Обход обычного пути биогенеза MVB м. модифицировать свойства MVBs, ILVs и экзосом. Кроме того, ретровирусы нуждаются в своих покровных белках, чтобы инфицировать клетки-мишени. Следовательно, м. ожидать существенных различий в том, как вирусы, по сравнению с экзосомами, взаимодействуют с клетками-мишенями.

Conclusions and perspectives


Since the initial studies on reticulocyte exosomes, recent work has revealed that exosome secretion is a much more general phenomenon with a range of important regulatory functions. The discovery of prostasomes [58] and argosomes [59] has led to the suggestion that an ‘exosomal’ type of communication is not limited to the immune system, but may also function in conferring fertility (in the case of prostasomes) and participating in tissue-developmental processes (in the case of argosomes). This is still an open hypothesis, and the definite classification of these vesicles as exosomes requires further exploration.
The description of the protein and lipid composition of exosomes has greatly facilitated their characterization. It should be noted, however, that the given composition is global and does not reflect possible heterogeneity within the exosome population. Exosomal vesicles isolated from the cell culture supernatant, in particular from DCs, are in most cases heterogeneous in terms of size (their diameters range between 30–90 nm within the same population) and even protein composition. Such heterogeneity can be observed within a MVB and it still cannot be excluded that different populations of ‘secretory’ MVBs exist in a cell. Further investigation should also help to define the different regulatory activities of exosomes and the cellular and molecular basis for their specific targeting to acceptor cells.
The discovery of the molecular machinery involved in MVB biogenesis enables us to study the components involved in exosome formation, regulation and secretion using approaches such as overexpression, use of dominant negatives or small interfering RNA technology. Such approaches need to be validated and require a delicate balance between efficient levels of transfection and cell viability. Methods that could be applied to block or stimulate exosome secretion in different cells are also required to shed light on their functions. Such methods await a better comprehension of the cellular and molecular mechanisms regulating MVB fusion with the cell surface. Any advances in this field will also be of great value for the development of strategies to interfere with the release of pathogens that use MVBs as reservoirs.

Update


In addition to the proposed implication of exosomes in the regulation of the immune response, recent studies also highlight their role in pathological states. Proteomic analysis of exosomes secreted by mesothelioma cells revealed the presence of developmental endothelial locus-1 (DEL-1). DEL-1 is a strong angiogenic factor involved in the vascuolar development in the neighborhood of the tumor, suggesting a role for exosomes in the interaction between tumor cells and their environment [61]. An additional role for exosomes in disease is suggested by our studies showing that the cellular prion protein (PrPc) and the transconformed infectious PrPscrappie (PrPsc) are associated with exosomes in the culture medium of non-infected and infected cells, respectively. Furthermore, exosomes bearing PrPsc are infectious, suggesting that exosomes may contribute to intercellular membrane exchange and spread of prions throughout the organism [62].
Сайт создан в системе uCoz