ALDH | CNJ | Cx | LC | SP | SSC | TA | TSCK

Пространственное приближение и полное присоединение производного нейральной эктодермы оптического пузырька к небольшое полоске наружной поверхности головной эктодермы представляет центральное событие развития глаз. Самой ранней распознаваемой экспрессией эктодермального гена, ассоциированного с этим феноменом, является экспрессия гомеобоксного гена PAX6, которая на самой ранней стадии происходит в широкого шлепка головной эктодермы по противостоящей области. Тесные рамки взаимодействия ведут к драматической, очевидной элонгации затрагиваемых эктодермальных клеток, образующих хрусталиковую плакоду. Морфологически измененные клетки инвагинируют, а избыток наружной поверхности формирует хрусталиковый пузырек. Удаление клеток ведет к уменьшению количества клеток на поверхности, которые из-за отсутствия морфологических признаков клеток плакод, обнаруживаются по экспрессии PAX6. Клетки поверхностной головной эктодермы, которые лишены экспрессии PAX6, продолжают обычный путь дифференцировки, чтобы создавать эпидермис. Небольшая когорта PAX6⁺ клеток следует разными путями, чтобы стать limbo-corneal (LC) и conjunctival (CNJ) эпителием (Davis and Reed, 1996; Koroma et al., 1997; Nishina et al., 1999). Разные домены поверхности глаза становятся различимы примерно на 7-й неделе плодного развития человека (Рис. 1), что соответствует 12-13 эмбриогенеза у грызунов.

Изучение развития хрусталика было облегчено благодаря хорошо определенной морфологической хронологии и доступности маркерных генов. Полученные данные указывают на множество контролирующих генов, стоящих ниже инициального события экспрессии PAX6 (Grindley et al., 1995; Ashery-Padan et al., 2000; Chauhan et al., 2002). Напротив, события связанные с детерминацией клонов и сегрегацией доменов для эпителия поверхности глаз, установлены довольно плохо.

Ocular surface epithelial phenotypes

Эпителиальные клоны поверхности глаза обладают многими базовыми признаками эпидермальной системы, включая: a) стратифицированный фенотип, в котором только базальные клетки сохраняют пролиферативную способность и свойства недифференцированности; b) экспрессия универсальных и ткане-специфических пар цитокератинов; и c) система быстрого обновления, связанная с резервуаром полу-покоящихся стволовых клеток (Wei et al., 1996). Инициальная дифференцировка в эпидермисе ассоциирована с переключением экспрессии цитокератинов от универсальной для стратифицированного эпителия пары цитокератинов, K5и K14, к K1 и K10, tissue specific cytokeratins (TSCKs) кожи (Moll et al., 1983; Cooper et al., 1985; O'Guin et al., 1987). Сходным образом эпителиальная поверхность глаза обнаруживает эквивалентное переключение с K5/K14 цитокератинов на их TSCKs, K3 и K12 (Schermer et al., 1986) и K4 (Kurpakus et al., 1994) для роговицы и конъюнктивы. соотв. Основными фенотипическими отличиями от эпидермиса возникают на поздних стадиях дифференцировки. В то время как на поздних стадиях дифференцировки в коже происходит синтез специфичных для кожи белков, чтобы создать слущивающуюся оболочку (кератинизация), дифференцировка поверхностного эпителия глаза сопровождается приобретением фенотипических компонентов, апикальных ионов и транспортеров метаболитов, муциновых белков и плотных соединений, компонентов, обычно обнаруживаемых в простом секреторном и абсорбтивном эпителии (Wang et al., 1993; Watanabe et al., 1993; Chen et al., 1994; Hamann et al., 1998; Turner et al., 2001). Ни один из этих компонентов не был идентифицирован как специфичный для эпителия роговицы или конъюнктивы. Однако, необходимо подчеркнуть, что даже фенотипы наружной поверхности глаза выглядят совершенно отличными от такового эпидермиса, так что действительные механизмы, контролирующие различия м.б. предопределены с помощью ограниченного количества критических генов. Кератинизация стратифицированного эпителия является универсальной и негативно регулируется с помощью ретиноидов. Степень кератинизации в разных стратифицированных эпителиях прежде всего отражает их разную чувствительность к ретиноидам (Green and Watt, 1982). В иерархии чувствительности эпителий поверхности глаз и в особенности конъюнктива, занимает наивысшее положение. Роговичный и конъюнктивальный эпителий синтезируют или потенциально способны экспрессировать все белки, необходимые для синтеза слущивающегося покрова (Nakamura et al., 2001). Однако, в нормальных физиологических условиях уровни циркулирующих и слезных ретиноидов достаточны для предотвращения экспрессии перекрестно связывающихся активностей, необходимых для образования слущивающихся покровов. Cornification с вредными последствиями наблюдается при определенных заболеваниях или у новорожденных при диете, полностью лишенной источника витамина А (DeMaeyer, 1986).

Fig. 1. Schematic description of the ocular surface epithelial zone. (A)The ocular surface at fetal week seven. (B) The adult ocular surface.

Механизмы, контролирующие клеточную реакцию на ретиноиды ассоциированы с модулированием фенотипа стратифицированного эпителия, чрезвычайно сложны и недостаточно изучены.

В отношении сравнительного анализа роговицы и конъюнктивы выраженное отличие связано с существованием одного пути дифференцировки в роговице. Предшественники конъюнктивы м. дифференцироваться или в мозаичного типы клеток, сходные с клетками роговицы или с муцин секретирующие goblet клетки. Др. существенное различие связано с ангиогенными свойствами тканей. Лишенная сосудов прозрачная роговица указывает на то, что в целом её клеточные компоненты не секретируют каких-либо ангиогенных индукторов и/или секретируют ещё не установленные ингибиторы ангиогенеза. Этому нет места в эпителии конъюнктивы; инвазия на поверхность роговицы клеток конъюнктивы немедленно индуцирует нео-васкуляризацию. Сегодня молекулярные основы an-angiogenic или anti-angiogenic природы эпителия роговицы изучены плохо. Во время заживления эпителиальных ран, когда сильно стимулируется ангиогенный процесс, металпротеиназа matrilysin играет критическую анти-ангиогенную роль (Kure et al., 2003). Наконец, сравнительное изучение глобальной экспрессии генов limbo-corneal и конъюнктивального эпителия человека с использованием больших AffymetrixTM массивов олигонуклеотидов было идентифицировано более 11000 транскриптов в каждой ткани, содержащей более 8000 уникальных генов (Turner and Wolosin, manuscript in preparation). Из них 256 транскриптов присутствовало исключительно в CNJ и напротив 181 присутствовал только в LC системе. Т.о. фенотипические различия между двумя эпителиями поверхности глаз, по-видимому, поддерживаются большими субнаборами генов, которые присутствуют только в одной из двух тканей.

Dual domain phenotype in the limbo-corneal epithelium

В дополнение к фенотипическим признакам, описанным выше limbo-corneal эпителий обладает уникальным расположением базового клеточного двойного домена (Wolosin et al., 2000). Стволовые клетки располагаются исключительно в базальном слое наружного васкуляризированного лимбического (limbal) ободка (Cotsarelis et al., 1989). Используя животные химеры, у которых потомство стволовых клеток м.б. прослежено по активности β-galactosidase, Collinson et al. (2002) подсчитали, что limbo-corneal эпителий у этих небольших грызунов поддерживается с помощью всего лишь 100 лимбических стволовых клеток. Базальные клетки роговичного домена обладают более дифференцированным фенотипом, экспрессируют ткане-специфические цитокератины K3 и K12 (Schermer et al., 1986). Сдвиг экспрессии с универсальных (K5/K14) к TSCKs, который в эпидермисе и др. стратифицированных эпителиях происходит при стратификации и прекращении пролиферации, в limbo-corneal эпителии происходит вдоль плоскости базальных клеток резким способом в виде перехода клеток из лимбического в corneal домен (Schermer et al., 1986) и не сопровождается потерей пролиферативной способности. Вместо этого скорость пролиферации клеток увеличивается, указывая на то, что эта частично дифференцированная популяция представляет собой главные transient amplifying (TA) клетки для устойчивого и надежного тканевого обновления роговицы (Leblond et al., 1959; Cotsarelis et al., 1989; Lavker et al., 1991).

Fig. 2. Connexin43 expression in the human limbocorneal epithelium. Micrographs are negative images of immunofluorescent stainings. (A) Differential interference light micrograph of a frozen section depicting the area of study. In this micrograph the corneal periphery (Co) is located on the left side and the limbus is located to the right. The prominent incursions of the stroma into the plane of the epithelium are the Palisades of Vogt (PV). To include several Palisades in each single section, the frozen tissue was sectioned at an angle oblique to the main limbo-corneal axis. This is indicated by the black line (cutting plane) placed over in an en face light micrograph of the intact limbo-corneal tissue (insert). (B) Immunofluorescence micrograph of Cx43 distribution in the right framed zone of A. The basement membrane (BM) separating epithelial and subepithelial zones is easily identifiable. Connexin staining in the epithelium is extremely sparse and limited to some suprabasal cells. Sub-epithelial endothelial vessels (End.), including those within the Palisades are strongly Cx43- positive. (C) Immunofluorescence micrograph of Cx43 distribution in the left framed (i.e., peripheral corneal) zone of A. Basal and the proximal suprabasal cells are intensively stained. The strong subepithelial stain seen in the limbal zone is absent.

Этот переход ассоциирует с некоторыми др. фенотипическими переключениями, включая de novo экспрессию, по крайней мере, sialyltransferase (Wolosin and Wang, 1995), и значительное увеличение connexin43 щелевых соединений (Matic et al., 1997). Когда взрослые ткани находятся в устойчивом состоянии, то энзим α-enolase присутствует почти исключительно внутри лимбических базальных клеток (Zieske et al., 1992). Роговица и пограничная область (limbus) обладают также отличающимися паттернами экспрессии интегринов (Stepp et al., 1995). Зона роговицы обнаруживает драматическое накопление больших количеств глобулярных metabolic энзимов, в частности aldehyde dehydrogenases и transketolase (Abedinia et al., 1990; Sax et al., 1996; Jester et al., 1999). Экспрессия этих энзимов м.б. связана со свойствами прозрачности и преломления, хотя к удивлению ALDH нулевые мыши не обнаруживали фенотипических отклонений (Ness et al., 2002). У кроликов обильная экспрессия ALDH class 1 (Hough and Piatigorsky, 2003) ограничена доменом роговицы (Wolosin, unpublished). Величина изменений в фенотипе на limbo-corneal границе подтверждается также различиями в форме, размере и внутриклеточной сложности базальных клеток обоих доменов у грызунов и человека (Romano et al., 2003). Базальные клетки роговицы существенно больше, чем их лимбические аналоги. Накопление больших количеств глобулярных белков в них м.б. главной причиной подобного отличия.

Функционально пограничный (limbal) эпителий обладает более низкой скоростью пролиферации, чем домен роговицы (Cotsarelis et al., 1989). Это м. указывать на то, что фенотип медленных митозов м. распространяться за пределы bona fide стволовых клеток и включать некоторые или многие из ранних предшественников. Присутствие высокой плотности TGF-β рецепторов в этом домене согласуется и м. обеспечить такую медленную скорость пролиферации (Joyce and Zieske, 1997).

одним из наиболее важных свойств limbo-corneal фенотипической дихотомии является отличие в экспрессии щелевых соединений. Эти соединения являются крупными агрегатами или бляшками межклеточных каналов, формируемых белками семейства коннексинов (Cx). Каналы щелевых соединений делают возможной диффузию ионов, низко мол. веса метаболитов и вторичных мессенджеров между клетками и тем самым предопределяют степень клеточной метаболической синхронности или кооперации внутри популяции. Эпителий роговицы экспрессирует множественные белки щелевых соединений. Cx26, Cx30 и Cx43 щелевые соединения подтверждены на белковом уровне у людей, крыс и кроликов (Dong et al., 1994, Matic et al., 1997; Ratkay-Traub et al., 2000; Richard et al., 2002). Сообщалось и о присутствии Cx50 (Dong et al., 1994; Matic et al., 1997). Однако иммуноокрашивание у Cx50 'нокаутных' мышей показало, что моноклональные антитела, которые были использованы для изучения роговицы обладают очень сильной избирательностью в отношении Cx50 в хрусталике, создавая ложную положительную реакцию в др. глазных тканях, включая эпителий роговицы (White at al, 2001). Мы подтвердили отсутствие экспрессии Cx50 на генном уровне в роговице человека с помощью анализа микромассива и количественно PCR в реальном времени (Wolosin, unpublished).

Наиболее наглядными и изученными щелевыми соединениями роговицы являются те, что образуются connexin43. В то время как базовые клетки зоны роговицы содержат многочисленные крупные бляшки Cx43 щелевых соединений и обладают выдающейся межклеточной передачей метаболитов и ионов, Cx43 щелевые соединения или отсутствуют или плохо выражены в лимбических базальных клетках (Рис. 2). Кроме того, лимбические клетки не обнаруживают значительной передачи метаболических трассеров, указывая на отсутствие и др. функциональных Cxs в этом домене. Мы полагаем, что бедность щелевыми соединениями в лимбических базальных клетках является отражением негативного в отношении щелевых соединений фенотипа эпителиальных стволовых клеток, свойство, которое приложимо и к др. эпителиальным стволовым клеткам (Matic et al., 1997; Wolosin et al., 2000). Соответственно и у людей самый низкий уровень экспрессии наблюдается в инвагинациях (recedes) Palisades of Vogt (Рис. 2), местах предполагаемого действия наивысших концентраций лимбических стволовых клеток (Townsend, 1991; Dua and Azuara-Blanco, 2000). В зрелом телячьем эпителии распределение экспрессии K12 и Cx43 выявляется в двух отдельных лимбически х зонах. Дистальные от роговицы, базальные и suprabasal клетки являются негативными по K12 и Cx43. В проксимальной зоне K12 и Cx43 экспрессируются в супрабазальных клетках. Эта конкурентная экспрессия является одним из серии наблюдений, связанных с экспрессией Cx43/TSCK,

Fig. 3. Summary of some of the functional and expression features of the limbo-corneal epithelium. The upper frame describes the growth and differentiation plan. The basal cell layer of the limbal zone contains the stem cells and their early progenitors (EP). The return arrow and question mark have been introduced to indicate the possibility that some of these precursors could, given the proper environment, revert to a full stem cell phenotype. At he limbo-corneal demarcation, in unison with the transition to a distinct avascular environment there is a sharp differentiation change into the more differentiated but rapidly proliferating transient amplifying (TA) cells. The lower frames describe some known phenotypic transitions taking place at the limbo-corneal demarcation. (TSCK) The basal layer of the limbal epithelium does not express TSCKs, as indicated by the stain-free cytosol. TSCK expression begins at the limbo-corneal demarcation within the basal cell layer or, within the limbus, upon stratification. (Enolase) Under stationary conditions б-enolase is preferentially expressed in the cytosol of the limbal basal cells. (Pigment) In many pigmented species, the limbal basal cells acquire heavy pigmentation, most likely due to pigment granule transfer from melanocytes. (Glycosylation) In rabbit, cell membrane O-glycan linked б-2, 3 sialylation (indicated by the darkness of the membrane traces), is limited to the cornea. This change is due to the de novo expression of a б-2,3 sialylyltransferase within the basal cell compartment at the limbo-corneal demarcation. It coincides with the de novo expression of TSCKs. Unlike the case for the TSCK's this sialylation does not occur during intralimbal stratification. (Cx43) The limbal zone shows very little Cx43. In some cases the expression is present in the first layer of supra-basal cells. The density of Cx43 gap junctions and the size of individual plaques sharply increase at the limbo-corneal demarcation.

подчеркивающим причинную связь между экспрессией Cx43 и инициальной дифференцировкой (Wolosin, 2000). Некоторые из признаков. описанные в данном разделе графически представлены на Рис. 3.

Чтобы выявить дальнейшие отличия между лимбическими и роговичными клетками мы использовали RT-PCR для выяснения дифференциальной экспрессии генов в роговичных и лимбических базальных клетках кроликов. Выявлено свыше 50 генных последовательностей, обнаруживающих преимущественную повышенную экспрессию в лимбе. Избыточная экспрессия генов подтверждена и с помощью real time PCR. Blast анализ позволил идентифицировать 29 ортологов известных генов млекопитающих. Табл. 1 представляет наиболее интересные из идентифицированных генов вместе с limbal/corneal отношением экспрессии генов, каталогом количества и приписываемых функций. Их участие в анти-апоптической и ростовой активности открывает возможность, что они м.ж играть роль в лимбических стволовых клетках.

The limbal stem cell

Ограничение эпителиальных стволовых клеток роговицы васкуляризированным лимбическим ободом имеет серьёзные последствия для здоровья. Патологические, средовые или онтогенетические состояния, которые обусловливают полную или частичную потерю лимбической ткани, ассоциируют с рядом клинических синдромов, тяжесть которых связана с колонизацией конъюнктивальным эпителием, неоваскуляризацией и отеком роговицы, воспалением и помутнением. Эти состояния отражают истощение резервуара стволовых клеток, необходимых для долговременного замещения эпителиальной популяции (Tsai et al., 1990; Huang and Tseng, 1991). Разработка концепции сегрегации стволовых клеток в LC эпителии привела к быстрым успехам в клиническом применении трансплантаций лимба для лечения лимбических нехваток (Pellegrini etal, 1996; Tsubota et al,1996).

Естественно имеется значительный интерес к изучению этих стволовых клеток и вообще к гомеостатическим механизмам, которые способствуют их выживанию в лимбической зоне. Одним из критических факторов для прогресса в этой области является способность выделять жизнеспособные стволовые клетки. Стволовые клетки идентифицируются благодаря своему уникальному медленному cycling поведению. Это свойство демонстрируется с помощью клеточной способности сохранять радиомеченные молекулы тимидина, которые инкорпорируются в их ДНК до раунда пролиферации. Принадлежность к стволовым клеткам м. также выявляться рядом способов тестирования культивируемых клеток. М. ожидать, что стволовые клетки будут давать значительно большие количества клеточных удвоений (т.е., генерационная способность), чем TA клетки перед старением. Др. тест указывает на способность стволовых клеток и менее дифференцированного TA потомства пролиферировать из изолированного состояния (клоногенный рост; Barrandon and Green, 1987). Происходящие из стволовых клеток колонии м. продолжать пролиферировать в течение многих генераций, чтобы сформировать большие (> 1 cm в диаметре; ~ 20 клеточных удвоений), компактные колонии и даже дают новые колонии после диссоциации и повторного посева. TA клетки также дают колонии, но благодаря ограниченному их пролиферативному потенциалу рост в этих колониях останавливается после относительно небольшого числа делений. Эти тесты демонстрируют присутствие стволовых клеток, но они не предоставляют путей, чтобы охарактеризовать эти клетки. разработка поверхностных маркеров для стволовых клеток в гематопоэтической системе (Civin, 1992; Silvestri et al., 1992) способствовала экстраординарным успехам как в исследовании базовых стволовых клеток, так и в клинической гематологической практике. недавно идентифицированы маркеры для некоторых нейральных стволовых клеток (Uchida et al., 2000). Однако, поиск эквивалентных маркеров в эпителиальных системах сталкивается с очень ограниченными успехами.

Недавно разработчики, по-видимому, преодолели ограничения, связанные с отсутствием поверхностных маркеров. Уже несколько лет субпопуляция кровяных стволовых клеток выделяется с помощью жидкостной цитометрии по их способности эффективно испускать флюоресцентную связанную с ДНК окраску Hoechst 33342 (Goodell et al., 1996). В разбавленном растворе после обработки УФЛ Hoechst дает голубую флюоресценцию, но связанный с ДНК Hoechst обладает сильным зависимым от концентрации крупным bathochromic сдвигом; чем выше его концентрация в ядрах, тем больше исходит флюоресцентного света от голубой для красной спектральной зоны. Высокая эффективность эманации в стволовых клетках ведет к тому, что при определенных условиях инкубации будет накапливаться значительно меньше окраски, чем в остальных клетках популяции, так что blue/red flow cytometer эмиссия делает эти клетки отличимыми от когорты, испускающей (голубой) в стороне от основной blue/red группы клеток. Они были названы клетками side population (SP). Недавно ATP Binding Cassette subtype G2 (ABCG2), был проверен на повышенную экспрессию в эти SP клетках и стал выявлять источник эффективной эмиссии Hoechst (Zhou et al., 2001). Кроме того, ABCG2 и SP свойства оказались ассоциированы с презумптивными стволовыми клетками во многих клонах, включая нейроны (Murayama et al., 2002), мышцы (Zhou et al., 2001) и эпителий (Summer et al., 2003). Эти находки указывают на то, что SP фенотип м.б. повсеместным свойством стволовых клеток.

Мы проанализировали присутствие SP клеток в энзиматически диссоциированной limbo-corneal популяции клеток (Рис. 4A; Wolosin et al., unpublished). В лимбе человека приблизительно 2500 клеток/ткани (0.5 % от общего количества 500000 клеток, происходящих из ~1.5 mm шириной полоски тканевого обода, представляющего как limbus , так и некоторую часть периферии роговицы) принадлежали к side популяции. Учитывая различия в размерах глаз 2500 фигура для глаз человека, по-видимому, в целом согласуется со 100 клетками, подсчитанными Collison et al. (2002) у мышей. Большинство SP устранялось с помощью fumitremorgin C, ABCG2-специфическим ингибитором (Robey et al., 2001), подтверждая, что этот глазной SP фенотип отражает в первую очередь активность этого транспортера.

Лимбические SP клетки обладают уникальными физическими свойствами. В унисон с этими флюоресцентными измерениями жидкостный cytometer характеризует свойства рассеяния бокового (SSC) и прямого света каждой клетки. По причинам, связанным с зависимостью угла рассеяния света от размеров частиц, SSC отражает сложность цитозоля клеток, обычно обозначаемую как клеточная 'granularity'. Наш анализ показал, что 60-80 % лимбических SP клеток относятся к кагорте клеток, обладающих самым низким SSC рассеянием из всех клеток. Др. словами, SP клетки лишены внутриклеточной сложности, состояние, соответствующее недифференцированной природе стволовых клеток. Полная демонстрация признаков стволовых клеток для SP необходима для дальнейшего тестирования их in vivo cycling свойств и клоногенных свойств.

TABLE 1 SURVIVAL AND DEVELOPMENTAL GENES DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN THE LIMBUS

R values represent the average of 5-7 independent experiments. Each R value was calculated from the limbal and corneal Ct values. All Ct were measure in triplicate in each experiment and were normalized using the geometrical average of the Cts for G3PDH and в-actin.

В противоположность лимбу не обнаруживается SP или клеток с SSC среди зоны роговицы, свободной от стволовых клеток. Мы также проверяли экспрессию ABCG2 в поверхностном эпителии глаз. Иммуноокрашивание подтвердило присутствие ABCG2-позитивных клеток в лимбе, но не в роговице (Fig. 4 B-D). В лимбической зоне наивысшая плотность позитивных клеток появляется в recedes Palisades of Vogt, в Cx43-негативной зоне, как полагают, содержащей наивысшие скопления лимбических стволовых клеток.

Fig. 4. SP cells and ABCG2 expression in the human limbo-corneal epithelium. Human corneas unsuitable for human transplant were obtained from the National Disease Research Interchange. (A) Flow cytometry blue/red emission dot plots of Hoechst 33342-loaded limbal and corneal human epithelial cells. Single cell suspensions were prepared by sequential digestion with Dispase and trypsin. Cells were incubated in culture medium containing 1.5 .g/ ml Hoechst for 90 min at 37.C, spun down and resuspended in ice-cold HBSS containing 2 % fetal calf serum and 2 .g/ml propidium iodide. The Hoechst-loaded cells were analyzed in a MoFlo flow cytometer equipped with UV and Argon lasers. Blue and red emissions from the UV excitation are used to generate fluorescent emission dot plots. Dead cells, labeled by propidium iodide, have been electronically excluded ("gated out") from these plots. Each dot in a plot represents the relationship between the Hoechst blue and Hoechst red emissions for each live cell. For most cells the blue/red ratio approaches or exceeds the normal ratio (represented by the light gray line). The main spot (G0/G1) gathers most cells containing one copy of DNA. The higher intensity zone (S/G2-M)along the gray line contains all cells with higher DNA content. This includes cells that are actively engaged in DNA synthesis (S) or cells that have completed the DNA duplication process but have not yet undergone or completed the cell division cycle (G2-M). In addition, the limbal population contains a cohort of cells, which both, displays lower blue and red emission intensities, and blue to red ratios that place them to the blue side of the gray line. These cells are known as side population (SP) cells. Note that such cells are not present in the corneal population. (B-D) Indirect immunofluorescence staining of cryosections of limbo corneal tissue for ABCG2. (B) Limbal Palisades of Vogt (PV). A broken black line has been added to indicate the location of the basement membrane. (C) Peripheral corneal zone. (D) Central cornea

The conjunctival stem cell

Т.к. конъюнктива является сильно васкуляризованной тканью и эпителий довольно обширен, то её стволовые клетки м.б. или полностью децентрализованы или локализованы более, чем в одной области. Эксперименты с мечение, проведенные на крысах, мышах и кроликах привели разных исследователей к предположениями о локализации стволовых клеток в альтернативных palpebral, fornical и mucocutaneous зонах (Wei et al., 1995; Wirtschafter et al., 1999; Chen et al., 2003).

Developmental expression of ocular surface epithelial genes

Изучение детерминации и дифференцировки поверхностного эпителия глаз зависит от доступности клональных маркеров. Тогда становится возможным отследить взаимоотношения между разными стратифицированными клонами и экспрессию уникальных TSCKs (Moll et al., 1983). В роговице кроликов Chaloin-Dufau et al., (1990) выявили инициальную экспрессию K12 и K3 в эмбриогенезе (E) дни 17 и 21, соотв. У мышей, у которых экспрессируется только K12, Kurpakus et al., (1994) идентифицировали инициальную экспрессию TSCKs в роговичной зоне на E15; K4 первоначально экспрессируется на E14 в конъюнктивальной зоне, покрываемой зачатками век (Pei and Rodin, 1970). Предшествует ли экспрессия универсального типа цитокератинов K5/K14 возникновению de novo TSCKs.

Qin et al., (1997) изучали изменения laminin и collagen IV изоформ у мышей в тот же период. Они установили, что экспрессия конъюнктивальной базальной мембраной laminin белка (alpha2 цепи) впервые выявляется примерно в то же самое время, когда появляются K4-позитивные клетки. Это совпадение по времени м. отражать роль внешних влияний на пути дифференцировки конъюнктивальных клеток. Однако, экспрессия м. также отражать предетерминированную программу автономной эпителиальной дифференцировки. Чтобы решить этот вопрос необходимо определить, может ли laminin секретироваться эпителиальными или развивающейся мезенхимой.

Используя подход генного нокаута Yoshida et al., (2000) идентифицировали IкB kinase α (Ikkα) в качестве главного компонента в сигнальной трансдукции, ведущей к активации экспрессии TSCK. При рождении, самом позднем возраст жизнеспособности Ikkα ^-/- мышей , обнаруживаются лишь следы K12 и K4 в роговице и конъюнктиве, соотв. Напротив, экспрессия K5 усиливается. Физическими результатами являются эпителии, состоящие из многих слоев basal-подобных клеток в обеих тканях скорее, чем из одиночного уплощенного супрабазалного слоя, типичного для этой стадии развития. Ikks фосфорилирует IкB, фактор, который маскирует локализационные последовательности для ядерного связывания NFкB. Соответственно NFкB не обнаруживаются в ядрах нулевых мышей, указывая тем самым на потенциальное участие этого повсеместного транскрипционного регулятора в дифференцировке. Необходимо подчеркнуть, что эти эффекты не уникальны для поверхностного эпителия глаз. Они м. появиться также в эпидермисе согласно сходству ранних событий дифференцировки во всех стратифицированных эпителиях (Li et al., 1999, Hu et al., 2001).

Изучение поздних стадий развития глазной поверхности облегчается высоко незрелой природой этой поверхности у новорожденных грызунов. При рождении веки закрыты и поверхность эпителия глаз состоит из одного базального слоя клеток и частично слоя супрабазальных клеток. Открытие глаз у грызунов происходит примерно на 13 день после рождения (Wider, 1963). Стратификация начинается примерно в это же время и заканчивается на 3-й неделе жизни. Большинство др. событий дифференцировки происходит на постнатальной стадии. Glycoconjugates, и/или glycocalyx белки роговицы, критические для защиты от колонизации патогенами отсутствуют у новорожденных (Hazlett and Mathieu, 1989). Экспрессия гель-формирующих муцинов начинается в fornix спустя 7 дней после рождения и коррелирует с появлением бокаловидных (goblet) клеток (Watanabe et al., 1993; Tei et al., 1999). Экспрессия пронизывающих мембрану муцинов начинается позднее и коррелирует с открытием глаз. Конкурентная экспрессия de novo sialyltransferase для O-glycans м. действовать как регулятор этого позднего развития (Uehara et al., 1995). Предполагается, что свет м. участвовать в координации экспрессии генов роговицы после размыкания век. Sax et al., (2000) сообщили, что онтогенетически зависимая экспрессия роговичной transketolase частично ингибируется у животных, содержащихся в темноте первые 4 недели жизни.

Norman et al., (2004) недавно достигли успеха в понимании постнатальной природы поверхности глаз. Набор роговичных эпителиальных генов, ассоциированный со стратификацией, был идентифицирован и количественно оценен с помощью серийного анализа генной экспрессии. Сравнение профилей экспрессии для роговицы у мышей на 9-й день постнатального развития (D9) (т.е., перед самым открытием глаз и инициацией быстрой стратификации) с полностью стратифицированной тканью взрослых животных показало, что приблизительно из 19000 идентифицированных мРНК около трети обладает более высокой экспрессией на D9 и сходная фракция делает это и во взрослой ткани. Словами авторов: "new probes for exploring corneal epithelial cell stratification, development, and function and for exploring the intricate relationship between programmed and environmentally induced gene expression in the cornea."

Limbal development

Т.к.отсутствие TSCKs и экспрессия α-enolase действуют как маркеры стволовых клеток базального слоя лимбической зоны, то эти два компонента используются для идентификации самой ранней точки, когда лимбические и роговичные базальные клетки становятся различимы. Для TSCKs, инициальная пренатальная экспрессия в центре роговицы в супрабазальных клетках распространяется постепенно в направлении периферии и в базальные клетки во время первых постнатальных недель. Экспансия останавливается на морфологически обнаружимой границе между роговицей и лимбом. Chung et al., (1992) изучали экспрессию α-enolase. В течение первых 10-11 дней после рождения этот взрослый лимбический маркер обнаруживается во всех базальных клетках роговицы и лимба. С этого момента базальные роговичные клетки принимают овальную форму. В течение последующих двух недель, когда базальные клетки центральной части роговицы меняют свою форму на крупные кубоидальные и развивается быстро стратификация, экспрессия белка α-enolase секвестрируется в лимбической области.

Cx43 expression and early ocular surface epithelial differentiation

Очевидно, что имеется существенный временной пробел между началом corneo-conjunctival эпителиальной детерминации в онтогенезе глаз (примерно на E5 у кур, E 9.5 у мышей, E10.5 у крыс и E11.5 у кроликов) и очевидной экспрессией TSCK маркеров.

Самые ранние события в хронологии развития поверхностного эпителия глаз выявлены при изучении экспрессии щелевых соединений. Т.к. pre-ocular эмбриональная головная эктодерма (Ruangvoravat and Lo, 1992) и взрослый эпителий роговицы являются Cx43-позитивны, то разумно предположить, что онтогенетический путь к генезу Cx43-негативных limbal/stem эпителиальных клеток д. включать подавление экспрессии или сборки этого коннексина на некой стадии развития. Поэтому экспрессию Cx43 отслеживали у крыс с E8.5 и далее (Wolosin et al., 2002). В центре роговицы Cx43 щелевые соединения остаются видимыми в течение всего развития, указывая тем самым, что переход от поверхностной эктодермы к роговичному эпителиальному фенотипу происходит без перехода через Cx43-негативную стадию, сходную с таковой для лимибических стволовых клеток. Рис. 5 описывает изменения, происходящие перед отшнуровкой хрусталикового пузырька. Рис. показывает, что перед индукцией хрусталиковой плакоды, наружная эктодерма будущего места глаза состоит из двух слоёв округлых клеток, экспрессирующих более или менее униформные уровни хорошо определяемых Cx43 щелевых соединений (Рис. 5A). Первые изменения в эктодермальной экспрессии или распределении Cx43 происходят при образовании хрусталиковой плакоды. Удлиненные хрусталиковые предшественники экспрессируют большие количества Cx43 (Рис. 5B). Белок накапливается на верхушках клеток скорее, чем в межклеточных контактных зонах. Накопление апикального connexin останавливается внезапно в не удлиненных клетках по краю плакоды. Этот край представляет собой место отшнуровки хрусталикового пузырька (Рис. 5C).

Рис. 6 описывает события, которые происходят после отделения хрусталикового пузырька. Между E11.5 и E12.5 клетки зоны эпителиальной поверхности глаза, находящиеся в максимальной близости к наружному листку развивающейся сетчатки, становятся Cx43 негативными (Fig. 6 A-C). Во время последующего пренатального периода Cx43-негативная зона продолжает расширяться (Fig. 6D). На ст. E19-E20 локализация Cx43-негативных клеток превращается в анатомически идентифицируемый характерный лимб у крыс и совпадает с K12 негативной зоной (Wolosin et al., 2002).

В целом распределение Cx43 щелевых соединений в развивающейся поверхности глаза указывает на то, что лежащий в основе феномен, ведущий к разделению двух доменов внутри limbo-corneal клона, существенно предшествует видимому проявлению событий, которые лишь позднее будут видны или демаскированы с помощью экспрессии TSCK. Онтогенетический паттерн Cx43 согласуется с моделью, согласно которой две взаимосвязанные, но самостоятельные популяции, 'plain' Cx43-позитивные эмбриональные CE клетки и Cx43-негативные эмбриональные CE стволовые клетки, присутствуют на поверхности глаз крыс, начиная с E12.5 и далее. Т.к. со временем клетки, мигрирующие из лимба замещают клетки эпителия роговицы, то клетки центральной эмбриональной роговицы м.б. видимы как временная или пограничная популяция. Интересно посмотреть, как происходит их постепенное замещение за счет потомства лимбических стволовых клеток в течение первых месяцев жизни (Collinson et al., 2002) и связано ли это с изменением клеточного фенотипа.

Итак, это онтогенетическое исследование показало, что a) перед отшнуровкой хрусталикового пузырька паттерн экспрессии Cx43 четко определяет демаркацию между будущим хрусталиковым эпителием и будущим эпителием роговицы (Fig. 5) и b) после отшнуровки уровни экспрессии предопределяют 4 домена поверхности головы (Fig. 6). Зона роговицы поверх развивающегося хрусталика обнаруживает умеренные уровни Cx43 и окружена Cx43^- предшественниками лимба. За границей этих клеток (т.e., в презумптивном эпителии конъюнктивы) экспрессия возобновляется, но частота и сила существенно ниже, чем в зоне роговицы. Все три зоны в этот момент состоят из округлой формы клеток. Презумптивная конъюнктива заканчивается в стратифицированной зоне, экспрессирующей более высокие уровни Cx43, что характерно для развивающегося эпидермиса. Схематический итог этих событий представлен на Рис. 7.

What regulates the earliest stages of ocular surface epithelial development?

Как продемонстрировано с помощью дивергенции уровней экспрессии Cx43 критические индуктивные события в развитии клонов роговицы и конъюнктивы, а также в сегрегации лимба и роговицы м. происходить в конце успешной экспрессии очевидных морфологических или белковых маркеров. Пока мало информации о факторах, которые м. управлять или обеспечивать эти события.

Первым делом необходимо рассмотреть участие в событиях детерминации клонов PAX6, master гена для генеза глаз. Помимо инициального влияния на детерминацию клонов этот ген играет критическую роль и в зрелой ткани (Sivak et al., 2004). У людей гетерозиготная потеря функции PAX6 приводит к ряду множественных онтогенетических дефектов глаз, основным из которых является aniridia, отсутствие радужки. Эпителий роговицы у людей с аниридией обнаруживает заметные

Fig. 5. Cx43 immunostaining in the head ectoderm during early stage of oculogenesis. Micrographs are negative images of immunofluorescent stainings. (A) Section of the E9.5 rat head. The optic vesicle (Ov) has approached the head ectoderm (Ect.) and has flattened against it. Note that the ectoderm is composed of two layers of uniformly Cx43-positive round cells. (B) An E10.5 sample showing the changes in Cx43 expression during formation of the lens placode. Cx43 increases dramatically in the elongating lens placode cells and concentrates in the apical surface The distribution of Cx43 seems to define the demarcation between ectodermal and induced placodal cell (Ect. /Lp). The developing retina (Rt.) is indicated. (C) The distribution of Cx43 during lens vesicle (Lv) excision from the surface ectoderm. Note the difference in Cx43 expression between the outer most cell of the excising lens vesicle, and the adjacent cell, that will not undergo excision, i.e, the future corneal epithelial cell. The insert shows a larger zone of the same micrograph.

Fig. 6. Cx43 immunostaining of the developing rat ocular surface of the eye following lens formation. Unless stated otherwise micrographs are negative images of immunofluorescent stainings. (AC) Images from E11.5-12.5 stages. As development progresses the tip of the retina (Rt.) becomes in very close apposition to the outer ectodermal zone lying just outside the ectoderm overlying the lens vesicle. (A1-A3; A4 is a positive light micrograph of the A3: after capturing the A3 image the glass slide was dismounted, the section was fixed in formalin and staining with H&EA). Careful examination of the ectodermal zone near the tip of the retina shows the presence of single Cx43-cells (asterisks in A2 and A3 and arrowheads on B and C). In a move away from the developing eye along the ectodermal surface, one finds sequentially a cell monolayer expressing a low level of Cx43 puncta, ending in a multilayered epithelium. Based on the developmental features observed in the subsequent stages, the presumptive corneal (Co), conjunctival (Cnj) and epidermal (Skn) domains are indicated in C. The embryonic retina expresses large amounts of Cx43. (D) Cx43 immunostaining in an E14.5 eye. The upper insert is a thumbnail of Cx43 immunofluorescent for the whole eye. At this stage, the eye is fully formed and protrudes upwards. Hairpin-shaped folds (framed areas) herald the ontogeny of the conjunctival sac (sulcus). The eyelids will start forming within the next 48-72 hr. Beyond the hairpin loops the surface epithelia thickens and shows higher Cx43 levels, consistent with the skin (Skn) phenotype. The main frame is a high-resolution micrographs of the area highlighted by the left frames in the thumbnail. A journey-like examination of the outer epithelial layer starting from the Cx43+ epithelium of the cornea (Co) reveals a substantial Cx43- zone, which begins just ahead of, and continues half way into, the bulbar side of the hairpin (segment indicated by the linked arrows). Deeper within the hairpin, still on the bulbar side, the epithelium again becomes Cx43+. The stain occurs in discreet puncta. This expression pattern continues uninterruptedly throughout the bottom of the fold and the contra lateral side of the hairpin until the juncture with the skin (Skn). Based on Cx43 expression levels within the sulcus, the respective areas are identified as the early limbal (Li), and bulbar (bCnj), fornical (Fnx) and palpebral (pCnj) conjunctival domains. The lower inserts is a Nomarski-interference micrograph of the stained area showing the physical integrity of the Cx43-negative epithelial cells

функциональные аномалии, согласующиеся с дефицитом количества или функциональной способности лимбических стволовых клеток (Puangsricharern and Tseng, 1995; Dua et al., 2000). Недостаток лимбических стволовых клеток подтверждается быстрым возобновлением эпителиальной патологии после стандартной трансплантации роговицы aniridic пациентам (Gomes et al., 1996) а также относительной успешностью гетерогенных лимбических трансплантаций для восстановления функции эпителия роговицы вопреки иммунным осложнениям. У мышей скорее, чем аниридия оглавным фенотипическим проявлением PAX6 +/- гетерозиготности является микрофталмия, возможно как результат нарушения роста хрусталика. Эпителий роговицы у таких животных обнаруживает снижение экспрессии слипчивых белков и кератина K12 и обнаруживает инвазии конъюнктивы, согласующиеся с дефектом лимбических клеток (Davis et al., 2003; Ramaesh et al., 2003). Наконец, у PAX6 +/+/PAX6 -/- мышиных химер клетки PAX6 -/- полностью исключены из эпителия роговицы, подчеркивая острую зависимость фенотипа от экспрессии PAX6 (Collinson et al., 2003). Возможно, что градиенты PAX6 или некоторых еще не идентифицированных генов, индуцирующих оптический пузырек, связанных с развитием плакоды (Xu et al., 1997; Kamachi, 1998), влияют на клетки на краю плакодной зоны и тем самым активируют ограниченные субнаборы ниже стоящих генов, чтобы детерминировать отдельные поверхностные домены глаза.

Второй элемент, состоящий из регуляторов экспрессии генов, м.б. идентифицирован в эктодерме, лежащей поверх раннего хрусталикового пузырьки. В частности любой такой регулятор, который или экспрессируется только после образования плакоды или , если он экспрессировался в ранней головной эктодерме, и затем исключается из плакоды. Два таких семейства генов м. удовлетворять этим критериям. Первое семейство м. состоять из генов muscle segregation homeobox (msh), показано, что на ст. Е10 мыши Msx-2/Hox 8.1 (Foerst-Potts and Sadler, 1997) экспрессируется в презумптивном limbo-corneal эпителии, но не в формирующемся хрусталике (Monaghan et al., 1991; Wu et al., 2003). Lincecum et al., (1998) показали, что смешанные клеточные линии, экспрессирующие expressing Msx-1 или Msx-2 дифференциально отсортировываются на базе экспрессии msh изоформ и что эта сегрегация осуществляется с помощью контроля cadherin-обусловленных межклеточных адгезий. Изоформа Msx-1 экспрессируется также в эктодермальных клетках (Monaghan et al., 1991). Т.о., экспрессия msh генов в ранней поверхности глаза м.б. связана с установлением или сегрегацией лимбического и конъюнктивного доменов. Др. интригующее семейство генов это inhibitor of DNA (Id ) семейство. Id's zdkz.ncz Helix-Loop-Helix (HLH) белками, которые негативно регулируют активность ассоциированных с дифференцировкой HLH транскрипционных факторов. Они экспрессируются во время эмбрионального развития

TABLE 2 SIGNAL INTENSITY IN THE AFFYMETRIX HU 133A HUMAN OLIGONUCLEOTIDE ARRAY IN OCULAR SURFACE EPITHELIA FOR THE MRNAS OF THE в-ACTIN, PAX6, ID AND MSH GENES

и важны для регуляции клеточных фенотипов у взрослых. Kee and Bronner-Fraser (2001) идентифицировали заплатку из Id type 4 (Id4)-позитивных эктодермальных клеток на головной эктодерме E2 кур (ст. развития 14). У целых эмбрионов заплатка проявляется в виде обода. окружающего развивающуюся ectoderm/neural зону аппозиции, т.е. до развития плакоды. На ст. E3, сопровождающейся инвагинацией плакодных клеток, Id4 экспрессия обнаруживается на презумптивной эпителиальной поверхности глаз, лежащей поверх Id4-негативного хрусталикового пузырька и эмбриональной сетчатки. Микрофотографии, представляющие msh и Id экспрессию подтверждают , что генный уровень для Msx-2 и Id4 изоформ наивысший в зоне, лежащей поверх верхушек развивающейся сетчатки, т.е. в области, которая станет или лимбом или конъюнктивой или обеими.

Исследование Affymetrix микромассива нуклеотидов экспрессии генов во взрослых LC и CNJ эпителиях человека предоставило информацию об этой последней точке зрения (Табл. 2; Turner and Wolosin, unpublished). В согласии с предыдущими исследованиями PAX6 экспрессируется на очень высоких уровнях и в LC и CNJ. Уровень экспрессии

Fig. 7. Schematic representation of the fate of cells derived from the ectoderm between E9 and E15 in terms of Cx43 expression levels. Levels are represented by degrees of darkness. The ectodermal (Ect), corneal (Co), limbal (Li) and conjunctival (Cn) domains of the ocular surface,in addition to the skin (Skn) and lens (Ln) are indicated. Arrowheads point to a (putative) fixed location throughout development.

несколько выше в LC, отличие, которое, по крайней мере, поверхностно, находится в согласии с гипотезой градиента, сформулированной выше в связи с PAX6. Однако, в этом отношении Msx-2 и Id гены действительно подтверждают выраженные LC/CNJ различия. Мы нашли, что Msx-2 экспрессируется только в LC системе и что Msx-1 не экспрессируется ни в одной из этих тканей. Относительно генов Id, Id1, Id3 и Id4 обнаруживают заметный LC to CNJ паттерн дифференциальной экспрессии. В целом паттерны экспрессии Msx-2 и Id генов у взрослых людей подтверждают мнение, что эти два семейства генов м. участвовать сегрегации доменов и детерминации и/или в поддержании фенотипов разных клонов. Кроме того, Id1 экспрессируется на таком высоком уровне (Табл. 2) в LC, что критическая роль этого гена в функци взрослой роговицы очень вероятна. Интересно бы посмотреть, как PAX6 и эти два дополнительных гена распределяются в LC между лимбическим и роговичным доменами. Наконец, как следует из исследований подавления Cx43 (Fig. 6), необходимо помнить о потенциальном участии эмбриональной сетчатки в качестве индуктивного влияния.

Ocular surface epithelial and stem cell development J. MARIO WOLOSIN , MURAT T. BUDAK and M.A. MURAT AKINCIInt. J. Dev. Biol. 48: 981-991 (2004) doi: 10.1387/ijdb.041876jw

Ocular surface epithelial and stem cell development
J. MARIO WOLOSIN , MURAT T. BUDAK and M.A. MURAT AKINCI
Int. J. Dev. Biol. 48: 981-991 (2004) doi: 10.1387/ijdb.041876jw