Посещений:
Укладка Белков

Эндопазматический Ретикулем

Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum
Bertrand Kleizen and Ineke Braakman
Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:343–349

The endoplasmic reticulum (ER) is a highly versatile protein factory that is equipped with chaperones and folding enzymes essential for protein folding. ER quality control guided by these chaperones is essential for life. Whereas correctly folded proteins are exported from the ER, misfolded proteins are retained and selectively degraded. At least two main chaperone classes, BiP and calnexin/calreticulin, are active in ER quality control. Folding factors usually are found in complexes. Recent work emphasises more than ever that chaperones act in concert with co-factors and with each other.
Endoplasmic reticulum (ER) выполняет множественные функции, включая дотацию липидов др. органеллам (rev. van Meer and Sprong), гомеостаз Ca2+ [1], биогенез органелл [2], укладка белков, quality control (QC) [3,4] и деградация белков. Хотя нативная конформация белков закодирована в его первичных аминокислотных последовательностях, ER существенно усиливает эффективность укладки [5]. ER высоко специализирован для укладки: приблизительно треть всех белков в клетках эукариот транслоцируется в ER [6]; ER обладает уникальным oxidizing потенциалом, который поддерживает образование дисульфидных связей во время укладки белка [7]; а просвет ER переполнен белком с концентрацией более 100 mg/ml. В этом гель-подобном белковом матриксе хапероны (chaperones) и укладывающие энзимы многочисленны, существенно численно превосходят вновь синтезируемые субстраты [8]. Эти укладывающие факторы в целом предупреждают агрегацию и тем самы делают возможным эффективную укладку большого разнообразия белков.

Co-translational and post-translational folding


Секреторные и мембранные белки млекопитающих синтезируются и транслоцируются в ER с помощью ribosome/sec61 translation/translocation кухни [9,10 ]. Во время трансляции/транслокации вновь синтезированные белки сразу же начинают складываться. Комбинирование этих процессов позволяет последовательное укладывание, что м. существенно повышать эффективность укладки, особенно мультидоменовых белков [11]. Молекула иммуноглобулина с ее тяжелыми и легкими цепями подвергается экстенсивной укладке и сборке уже во время синтеза [12]. Др. примером является связанная с рибосомами сходящая цепь Semliki Forest virus capsid protease домена, которая, как было установлено, складывается и аутопротеолитически активируется непосредственно после translocon выхода, указывает на то, что укладка происходит одновременно с трансляцией, но после транслокации [13]. Др. белки, с др. стороны, нуждаются в обширном пост-трансляционном укладывании, чтобы приобрести их собственную нативную конформацию. Гликопротеин оболочки gp160 из HIV-1, напр., синтезируется в течение приблизительно 5 мин., но но находится в течение нескольких часов в ER без видимой деградации [14]. LDL receptor (LDL-R) также упаковывается после синтеза: он спадается в компактную структуру с non-native дисульфидными связями и затем продолжает укладываться в менее компактную структуру с нативными дисульфидными связями [15]. И gp160 и LDL-R нуждаются в экстенсивной посттрансляционной дисульфидной изомеризации, чтобы сложиться в нативную структуру. Thyroglobulin даже укладывается в комплекс высокого молекулярного веса, который первоначально проходит стадию формирования disulphide-сцепленных агрегатов, которые со временем расправляются и собираются в димеры [16]. В то время как некоторые растворимые белки укладываются довольно легко, др. имеют трудности с укладкой и нуждаются в помощи хаперонов и укладывающих белков.

Chaperones in complexes


Предыдущие исследования подтвердили, что хапероны действуют на вновь синтезированные белки в контексте комплекса. Во время укладывания гомодимера thyroglobulin (каждая субъединица котрого в 330 kD), Hsp70 хаперон BiP присутствует в мультимерном комплексе вместе

Таблица 1



Several laboratories found multimeric chaperone and folding enzyme assemblies that interacted with proteins that fold in the ER. The redox protein family, which rapidly expands, includes important constituents of the BiP complex.



с Grp94, Grp170 и redox proteins PDI (protein disulfide isomerase) и ERp72 [17]. Нemagglutinin (HA) вируса гриппа поперечно связывается со стоихометрией 1:1 сlectin хаперонами calnexin (CNX) и calreticulin (CRT), и лишь со следовыми количествами BiP. В отсутствие белкового синтеза, CRT обнаруживается в комплексе с BiP и Grp94, тогда как CNX не обнаруживается [18]. Установлено, что ансамбль хаперонов и укладывающих белков действует на thryroglobulin [19], на медленно укладывающийся apolipoprotein B [20] и на неупакованную тяжелую цепь иммуноглобулина [21] , чтобы помочь в укладке. BiP и Grp94 были представлены всегда, тогда как дополнительные хапероны и укладывающие белки варьируют (Табл. 1). Хаперон BiP образует комплекс с неупакованным иммуноглобулином также независимо от синтеза, указывая тем самым, что имеется внутренне присущий ER chaperone комплекс [21]. Широко масштабный анализ TAP-меченных белков у дрожжей указывает на то, что ~78% изученных белков находятся в мультибелковых комплексах [22]. Т.к. хапероны пользуются дурной славой 'sticky', поэтому они являются частями слишком многих комплексов и поэтому были исключены из анализа.

BiP and calnexin: the first to act


BiP (Grp78) млекопитающих является одним из наиболее многочисленных ER хаперонов и тесно связан с цитозольным Hsp70. Хотя недавняя кристаллическая структура SecY указывает на то, что барьер проницаемости между цитозолем и ER является свойством только translocon, ранее было установлено, что BiP закрывает поры со стороны просвета ER [10,23]. Благодаря своему расположению BiP м. непосредственно взаимодействовать с неуложенной синтезируемой цепью и , следовательно, м. вносить вклад в транслокацию синтезируемой цепи в ER. CNX располагается вблизи транслокона и м. взаимодействовать с синтезируемой цепью N-гликозилированных белков. Предварительным условием для связывания CNX и CRT с вновь синтезируемыми гликопротеинами является последовательное, инициально ко-трансляционное действие с помощью α-glucosidases I и II, которые отстригают два остатка глюкозы, создавая monoglucosylated glycan. CNX непосредственно соединяется с HA, когда ~30 остатков поступают в просвет ER, указывая тем самым, что обе glucosidases также функционируют в очень тесной близости к translocon [24].
Immunoglobulin и HA являются примерами белков, которые исключительно связываются с BiP или CNX/CRT, соотв., тогда как др. белки нуждаются в обоих для своей укладки. Если N-glycans локализованы внутри первых ~50 остатков HA вируса гриппа, то CNX взаимодействует с гликопротеином. Когда эти N-терминальные гликаны удалены, то предупреждается инициальное связывание CNX, а BiP взаимодействует с гликопротеином [25]. Какой хапероновый комплекс будет использован предопределяется с помощью характеристик укладываемого белка.

The BiP chaperone complex


Как хапероновые комплексы помогают укладке белков? Имеется ли функциональное физическое взаимодействие между хаперонами, ко-хаперонами и folding энзимами? BiP обладает ATPase доменом и пептид-связывающим доменом, который координирует повторяющиеся циклы ATP гидролиза и ADP обменов, стимулируя связывание и высвобождение неуложенных белков, соотв. [26]. Ко-хапероны, как было показано детально для цитозольных и бактериальных Hsp70s, влияют на цикл путем модулирования гидролиза ATP (J-proteins) или ADP обменов (напр. Bag-1). Недавно идентифицировано несколько J-domain-содержащих партнерских белков для BiP: ERdj 1-5. ERdj3 в самом деле стимулирует гидролиз ATP of BiP in vitro и, как было установлено, в BiP комплексе с неупакованной тяжелой цепью in vivo [21,27].
Хотя специфический белок обмена нуклеотидов для BiP был идентифицирован в ER млекопитающих, но этот белок, BAP, не найден в BiP комплексе [28]. Два дополнительных фактора обмена нуклеотидов были найдены в дрожжевом BiP (Kar2p), не только Sil1p, но и также Lhs1p, гомолог Grp170 со сходством с Hsp70s и Hsp110. Интересно, что Lhs1p стимулирует ADP обмен в Kar2p, тогда как Kar2p стимулирует гидролиз ATP в Lhs1p [29]. Эта взаимная активация создает эффективный хапероновый переключатель, который м. инициировать последовательное действие с помощью Kar2p и Lhs1p на субстрате. BiP и Grp170 млекопитающих обнаруживаются в одном и том же комплексе, который усиливает их кооперацию.
Чрезвычайно многочисленные ER хапероны Grp94 (Hsp90 гомологи) связывают immunoglobulin во время укладки после того, как они высвобождаются с помощью BiP, участвуя в др. последовательном взаимодействии хаперона [30]. Интересно, что параллели м.б. обнаружены между неуловимым ER BiP/Grp94 хапероновым комплексом и хорошо изученным эукариотическим цитозольным Hsp70/Hsp90 хапероновым комплексом. С др. стороны, X-ray структура N-терминального домена Grp94 демонстрирует конформационные отличия от Hsp90 [31]. Или многие кофакторы, которые действуют на Hsp90, ещё не идентифицированы в ER или они не существуют.

The lectin chaperone complex


С CNX и CRT ER представляет собой уникальную лектин-связывающую хапероновую систему, которая специфически помогает укладке секреторных и мембранных гликопротеинов [3]. Несмотря на их существенную гомологию, исследования CRT- и CNX-дефицитных клеточных линий показали, что их активности и субстрат-специфичность различны [32]. Самостоятельные фенотипы мышей, у которых любой из хаперонов делетирован, подтверждают эти отличия [33,34]. CRT Обнаруживается в комплексе с BiP и Grp94, тогда как CNX нет, хотя это м. отражать уникальность мембранной ассоциации CNX. С др. стороны, нельзя исключить, что CNX и CRT функционируют в отдельных хапероновых комплексах с самостоятельными функциями.
Множество лектиновых хаперонов нуждается в дополнительных белках, включая α-glucosidase II, UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT), ERp57 и EDEM (только для CNX), чтобы укладывать белки andmaintain glycoprotein QC. Некоторые из них были ассоциированы с белковыми комплексами. Пока дополнительные факторы и циклы активности неотличимы для CNX и CRT; Они оба нуждаются в помощиα-glucosidase II также как и UGGT, чтобы высвобождать и повторно связывать гликопротеиновый субстрат, соответственно [3,35]. В то время как CNX/CRT удерживают в основном не полностью уложенные гликопротеины, то UGGT функционирует как сенсор упакованности. Уникальное свойство UGGT (175 kDa) заключается в том, что он специфически распознает наиболее внутреннюю половинку GlcNAc в неправильно уложенных гликопротеинах [36]. Изучение гетеродимеров, состоящих из одной неуложенной субъединицы RNaseB и одной уложенной субъединицы RNaseB, показало, что UGGT специфически 'sensed' и повторно гликозилирует частично неупакованную субъединицу [37]. С помощью более крупного белка, содержащего два Man9-GlcNAc2 гликана, ре-гликозилирование происходит также на расстоянии от локального нарушения конформации, хотя точная степень неправильной укладки все ещё нуждается в формальном определении [38].
Т.к. не полностью упакованные белки обычно экспонируют гидрофобные участки, то не удивительно, что UGGT, подобно BiP, обнаруживает сродство к этого типа последовательностям. UGGT предпочитает гидрофобные кластеры внутри белков в molten глобуло-подобном состоянии [39], и ре-глюкозилирует гидрофобные гликопротеины из ~20-30 остатков [40]. BiP, однако, преимущественно взаимодействует с гептамерными гидрофобными пептидами.

Glycan-independent chaperone function of CNX


Т.к. не гликозилированные белки часто соединяются с CNX и CRT, и т.к. мутации в CNX's lectin сайте не нарушают такого взаимодействия [41], то гликан-независимое связывание полипептидов lectin хаперонами остается дополнительным параметром. Не собранные в ансамбли трансмембранные домены некоторых белков связывают CNX: CD82 tetraspanin мембранный гликопротеин и внутримембранная точковая мутация не гликозилированного протеолипидного белка [42,43]. CNX RNAi knock-down обнаруживают более медленную деградацию мутантного, но не дикого типа протеолипидного белка [43]. CNX , по-видимому. обеспечивает функционирование хаперона в просвете и на мембране ER.

Redox proteins


Укладывающие энзимы м.б. даже более важными для собственно укладки. Доминантный класс является redox-активными белками, oxidoreductases, на что указывает их большое количество (Табл. 1). Они катализируют thiol redox реакции, приводя к образованию дисульфидных связей и изомеризации. Кроме хорошо известных многочисленных oxidoreductases, таких как PDI и ERp57, идентифицированы многие новые oxidoreductases, чья функция и субстрат неизвестны [19,44].
Специальные примеры найдены в plasma клетках. которые секретируют большие количества IgM, так что более 105 дисульфидных связей в сек. возникает в этих клетках (Roberto Sitia, personal communication). Во время развития в plasma клетку, B лимфоцит расширяет свой ER и увеличивает экспрессию ER хаперонов и ER redox энзимов до продукции антител. Эти активированные ER oxidoreductases, которые включают ERp44, по-видимому. действуют на IgM J-цепи, тяжелые цепи и легкие цепи, доминирующие субстраты в плазматических клетках [45,46]. Являются ли эти новые redox энзимы специфичными для типа клеток и субстратов и происходит ли упорядоченная экспансия ER, в то же время приложимы и к др. типам секреторных клеток.
Среди новых redox белков, обнаруженных недавно, ко-хапероны особенно интересны, т.к. они соединяют хапероны с функцией укладывающих энзимов. Белок ERdj5, который содержит J-домен также как и 4 последовательных CXXC thioredoxin-подобных мотивов, м.б. 'private' redox белком для BiP также как ERp57 для CNX и CRT [47]. И CNX и CRT были обнаружены в гетеродимерных комплексах с PDI-подобными redox белком ERp57 [48]. Недавние исследования NMR взаимодействий показали, что ERp57 взаимодействует с самым кончиком CNX/CRT P-домена [49] с его b and b' доменами [50,51]. ERp57 обеспечивает оксидативную укладку гликопротеинов, если комплексуется с CNX или CRT, а его redox способности лишь слегка отличны от таковых у PDI [52]. Хотя и присутствуют в разных хапероновых условиях, ERp57 и PDI обнаруживают строгую аналогию в функции.
Зачем нужна эта когорта redox белков в клетке и каков их индивидуальный вклад в продукцию дисульфидных связей и реакции разрывов в ER. Все эти redox белки акцептируют электроны во время образования дисульфидных связей в белках-субстратах и отдают электроны после редукции дисульфидных связей. PDI отдает свои электроны Ero1, который в свою очередь отдает их молекулярному кислороду посредством FAD [7]. Как приток электронов сказывается на работе др. белков? Обладают ли эти redox белки своими собственными, еще не идентифицированными акцепторами электронов, подобных Ero1 или Ero1 м. также облегчать передачу электронов др. redox белкам помимо PDI?

ER-associated degradation


Если после высвобождения от хаперонов секреторный белок укладывается корректно, то он д. покинуть ER, возможно с помощью lectin ERGIC-53, если он является гликопротеином [35]. Если, с др. стороны, белок не м. уложиться, даже после продолжительного времени, то он д.б. удален с конвеера укладки и отправлен на ER-ассоциированную деградацию (ERAD). Путь ERAD ретро-транслоцирует (dislocates) неправильно упакованный белок обратно в цитозоль, где происходит деградация с помощью протеосом.
На дрожжах было продемонстрировано, что и BiP и PDI участвуют в ERAD. BiP м. удерживать неправильно упакованные белки в обратимо агрегированном состоянии, тогда как PDI непосредственно направляет неправильно упакованные белки на retrotranslocation [53].



QC by BiP- and CNX-containing complexes follows successive steps. BiP and CNX with their accessory proteins associate with nascent chains as soon as they enter the ER lumen (I), and continue to assist folding after translation (II). When the protein has acquired its correctly folded structure, it is ready for exit from the ER (IV). If the protein fails to reach its native state the chaperones and folding enzymes target and guide the misfolded protein for ERAD (III). For at least some proteins, ER to Golgi traffic is necessary before ERAD, probably via COPII exit sites (IV).

Установлено, что Ero1 обеспечивает высвобождение не упакованного холерного токсина, связанного с PDI до retrotranslocation [54]. В др. исследовании смешанные дисульфидные связи были обнаружены между PDI и мембранным гликопротеином BACE457 до ERAD [55]. Напротив, PDI также обнаруживает связь с субстратом redox-независимо [56]. Если укладка гликопротеина не удается, то α-mannosidase I д. отрезать одну mannose, это д. направлять белок на деградацию с помощью EDEM, другого lectin [57]. CNX взаимодействует посредством своего трансмембранного домена с EDEM, чтобы передать неправильно упакованный α1-antitrypsin b BACE457 [58,59]. Взаимодействие CNX/EDEM поддерживает важную передачу от хаперона к ERAD. Т.к. CRT не м. соединяться с EDEM, то будут обнаружены скорее всего многие lectins. Более того, детальный анализ композиции олигосахаридов из EDEM-связанного субстрата, показал, что дополнительные гликоформы подготавливают белок для ERAD. Как BiP так и lectin хапероны участвуют в отсылке неправильно упакованных белков на ERAD. Т.к. неправильно упакованный BACE457 является субстратом для PDI и EDEMit, то остается неясным, оба ли хаперона или их ко-факторы и redox энзимы сотрудничают для достижения этой цели. Т.к. ERp57 сильно напоминает PDI, этот private redox партнер для CNX, то он м. также вызывать редукцию собственных дисульфидных связей для retrotranslocation.

Conclusions


The question remains of how the ER decides at the molecular level between the protein folding and ERAD pathways (Figure 1). The kinetics of the folding and degradation pathways may simply differ, as glucosidase activity is suggested to be higher than mannosidase activity. This may favour the folding cycle over ERAD [60]. After multiple rounds of chaperone binding, proteins that inefficiently fold are eventually targeted for degradation. On the other hand, protein folding might be spatially separated from protein degradation by distinct ER subdomains. Two ERAD substrates, asialoglycoprotein receptor H2a and unassembled MHC class I, accumulated before ERAD in ER subcompartments that colocalised with Sec61, CNX and CRT but not with BiP and PDI [61,62]. Genetic evidence in yeast suggests that the Sar1p/COPII machinery is essential in proteasomal sorting [63]. These various observations narrow down the location of the decisions to the ER exit site (reviewed by Watanabe and Riezman in this issue), which then would be involved in the triad decision between protein folding, protein degradation and protein export. Flexible protein complexes are likely to be at the molecular core of this fate-determining process. Exactly how these folding factor complexes work in mammalian cells can now be addressed using siRNA. Folding factors can be knocked-down one by one to study the effect on the complete folding factor network and hence on protein folding and quality control.

Update


Co-translational folding has received increasing appreciation over the last years. Two recent studies by Woolhead et al. and Gilbert et al. put focus on the ribosome in relation to folding. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) showed folding (increasing compactness) of a transmembrane segment inside the ribosomal tunnel [64]. Comparing density maps of Cryo-EM on translating versus non-translating ribosomes demonstrated occlusion inside the tunnel when ribosome is engaged in protein synthesis of Ig1, Ig2, or GFP [65]. Both laboratories present compelling evidence that newly synthesised proteins may begin to fold inside the ribosome.
Сайт создан в системе uCoz