Посещений:
Эффекты Фолата

Наследственные Нарушения

Folate supplementation in three genetic models: Implication for Undestanding Folate-Dependet Developmental Pathways
K. Kappen
Amer. J. Med. Genet. C. - 2005. - 135, № 1. - P. 24-30



Табл.1 Добавление фолата к разным мышиным моделям врожденных дефектов

Role of Folbp1 in the Regional Regulation of Apoptosis and Cell Proliferation in the Developing Neural Tube and Craniofacies.

L.S.Tang, D.R.Santillano, B.J.Wlodarczyk, R.C.Miranda, R.H. Finnell (rfinnell@ibt.tmc.edu)

Amer. J. Med. Genet. C. - 2005. - 135, № 1. - P. 48-58

Белок, связывающий фолиевую кислоту, Folbp1, является главным медиатором транспорта фолиевой кислоты. Мыши, дефицитные по Folbp1, погибают in utero с множественными уродствами, включая тяжелые черепно-лицевые дефекты. Выявляется массивный апоптоз в дефектных тканях Folbp1-/- латеральных частей нервной пластинки, кроме того, выявляется снижение пролиферации. Однако, теломеразная активность оставалась неизменной, что говорит против хромосомной нестабильности как причины апоптоза. Выявляется присутствие дифференцирующихся нейронов, хотя и в пониженных количествах. Анализ черепно-лицевых структур выявляет сходные изменения, указывая, что популяция предшественников нервного гребня также селективно нарушается при инактивации Folbp1.

Mouse Models of Neural Tube Defects: Investigating Preventive Mechanisms

N.D.E. Greene (n.green@ich.ucl.ac.uk), A.J.Copp

Amer. J. Med. Genet. C. - 2005. - 135, № 1. - P. 31-41

У мышей дефекты нервной трубки (NTD) возникают в результате генетических мутаций или нокаута или от воздействия тератогенных агентов. У генетических моделей NTD, таких как Cart1, splotch, Cited2, crooked tail и при NTD, индуцированных тератогенами, выраженность дефектов снижается в результате добавки фолиевой кислоты мышам. В другой группе мышей, таких как curly tail, axial defects и Ephrin-A5 нокаутов NTD оказываются резистентными к воздействию фолиевой кислоты. У них эффективными оказываются inositol и methionine. Имеющиеся данные показывают, что терапия in utero NTD возможна.
Фолаты обеспечивают хорошо известный эффект (Czeizel, 1996) по предупреждению врожденных дефектов у людей, в особенности черепно-лицеваых и нервной трубки дефектов (Berry, Li, 2002; Green, 2002). Животные модели также подтверждают защитный эффект (Tolarova, Harris, 1995; Green, 2002), хотя некоторые дефекты нервных трубок резистентны к фолатам (Copp, 1998). Примерно 70% дефектов нервной трубки у людей могут быть предупреждены адекватным приёмом фолатов (Ray et al., 2002). Молекулярные основы, лежащие в основе этих различных реакций на фолаты, пока неизвестны.
Интересно, что фолаты благоприятны не только при заболеваниях, связанных с дефицитом фолатов, таких как мыши с делециями Folate receptor 1 (Folr1, первоначально Folbp1) или reduced folate carrier (Rfc1). В этих моделях добавление folinic кислоты ( биологически активной и наиболее стабильной формы фолата) увеличивает выживаемость дефектных эмбрионов до рождения (Rfc1; (Zhao et al., 2001)) или даже взрослой стадии (Folr1; (Piedrahita et al., 1999; Finnell et al., 2002; Spiegelstein et al., 2004). Т.к. Rfc1 и Folr1 участвуют в транспорте фолатов в клетки, то добавление к генетическим мутантам корректирует недостаток поставки в клетки, возможно благодаря добавочным транспортным путям.
Однако, наиболее удивительным был результат, когда добавление фолатов оказывало благоприятный эффект в отсутствие дефектов метаболизма фолатов. У Cart1 дефицитных мутантных мышей (Zhao et al., 1996) анэнцефалия и черепно-лицевые дефекты нормализовались фолатом и увеличивалась выживаемость эмбрионов. Сходным образом, добавление фолатов устраняло эмбриональную гибель Cited2 мутантов (Barbera et al., 2002). Эти результаты указывают на взаимодействие статуса фолатов с онтогенетическими путями - такими как те, что контролируются транскрипционными регуляторами Cart1 и Cited2. Кстати, чувствительные к фолату пути в этих моделях еще предстоит выявить.
Работы в моей лаб. недавно показали, что фолаты нормализуют скелетные дефекты у трансгенных и мутантных мышей (Kappen et al., 2004). В этих моделях аберрантная экспрессия гомеобоксного транскрипционного фактора вызывает дефекты формирования паттерна и роста скелета (Muller et al., 2003; Kappen et al., 2004) или дифференцировку скелетных клеток (Нгур уе al., 1998), соотв.

The Experimental Models


Caudal Dysgenesis in Isl1 Transgenic Mice


Были получены мыши, трансгенные по гомеодоменовому транскрипционному фактору Islet1 (Isl1). Isl1 обычно экспрессируется в дорсальной панкреатической мезенхиме и позднее в дифференцирующихся панкреатических эндокринных клетках. Потеря функции Isl1 даёт мышей без дорсальной части поджелудочной железы (Ahlgren et al., 1997) и без функциональных панкреатических β-клеток. Isl1-дефицитные мыши лишены также функциональных двигательных нейронов (Зафаа уе al., 1996) и имеют пороки сердца (Cai et al., 2003). У наших трансгенных моделей (Табл. 1), Isl1 экспрессия управляется промотор/энхансером от гена Нохс8. Эта регуляторная кассета активирует транскрипцию трансгена в хвостовой почке и задней мезодерме и нейроэктодерме с 8 дня беременности (Gardner et al., 1996).
Соотв. трансген Isl1 вызывает дефекты роста особенно в задней области, в результате чего образуется более короткий или даже отсутствует хвост при рождении (Muller et al., 2003). Большинство родившихся нежизнеспособно, у них обнаруживается аноректальные дисморфии.
Каудальные дефекты роста у Isl1 трансгенных мышей затрагивают наиболее каудальные и некоторые крестцовые позвонки, последние часто расщеплены или полупозвонки. У части животных обнаруживается spina bifida, открытая или скрытая, иногда с эктодермальной тканью, рыхло подвешивающей дорсальную часть столба. Пониженная пенетрантность spina bifida, несмотря на униформный FVB инбредный генетический фон в этой модели, указывает на то, что изменчивость в тяжести фенотипа существует, что может быть информативным для выяснения взаимоотношений снижения роста и закрытия нервной трубки.
Интересно, что мы не нашли признаков аномальной спецификации клеток в самой нервной трубке: гибридизация in situ у Isl1 трансгенных эмбрионов не выявила петурбаций в экспрессии генов, которые как известно чрезвычайно чувствительны к передаче сигналов от хорды (Muller et al., 2003). Обычный паттерн экспрессии говорит против дефектов формирования нейрального паттерна как причины каудального дисгенеза. Вместо этого мы обнаружили повышенный апоптоз, особенно в мезодерме, это указывает на то, что недостаточность мезодермы - предполагаемая исторически - это причина каудального дисгенеза. Затем фенотип spina bifida может быть вторичным по отношению к мезодермальным дефектам. В самом деле, на ранних стадиях эмбриогенеза мы иногда находили выпячивания нейроэктодермальной ткани, обусловленные отсутствием подлежащей мезодермы. Сходным образом, уменьшение клеток в мезодерме хвостовой области согласуется с дефектами закрытия нервной трубки, такими, которые обусловлены неспособностью нервной трубки увеличивать и сгибать стенки (Shum, Copp, 1996; Нище-Gonzalez, Copp, 1999)? чтобы обеспечить дорсальное закрытию
Мезодермальные дефекты участвуют в многочисленных дефектах нервной трубки (Duhamel, 1961; Copp et al., 1990), а добавление фолиевой кислоты (folate), как известно, оказывает благоприятный эффект на некоторые мышиные модели дефектов нервной трубки (Copp, 1998). Поэтому мы попытались определить, будет ли фолат эффективен в предупреждении spina bifida или каудального дисгенеза у Isl1 трансгенных эмбрионов. Добавление фолата, производимое в стандартном режиме (Piedrahita et al., 1999), не уменьшало показателей хвостового дисгенеза у Isl1 трансгенных новорожденных. Inositol, второй агент, который как известно м. предупреждать дефекты нервной трубки у др. моделей (Greene, Copp, 1997)? также оказался неэффективным.
В предварительных экспериментах мы идентифицировали, что возможно Wnt путь вовлечен в каудальный дисгенез у Isl1 трансгенных мышей. Это подтверждается и литературой с доказательствами, что целенаправленное нарушение гена Wnt3a вызывает дефекты хвоста (Takada et al.,. 1994) и (vestigial tail) мутации , которые снижают его биологическую активность, также нарушают развитие хвоста (Greco et al., 1996). Т.о., Wnt3a необходим для собственно каудального морфогенеза, а редуцированная экспрессия у наших Isl1 трансгенных мышей согласуется с его функцией.
Отсутствие фенотипической нормализации при добавлении фолата и инозитола, однако, говорит против того, что Wnt3a-обеспечиваемые онтогенетические пути не чувствительны к статусу фолата или инозитола.

Cartilage Defects in Hoxd4 Transgenic Mice


Ранее мы продемонстрировали роль гомеобоксного транскрипционного фактора Hoxc8 в регуляции созревания хряща (Yueh et al., 1998). У трансгенных мышей (Табл. 1) избыточная экспрессия Hoxc8 в обычном домене экспрессии - дозово-зависимым способом - вызывает задержку созревания хрящей с накоплением пролиферирующих клеток за счет клеток, продуцирующих гипертрофический хрящ. И как следствие сульфатированные протеогликаны внеклеточного матрикса оказываются сильно редуцированными, рёберные хрящи были структурно недостаточны и животные часто погибали при рождении от респираторной недостаточности. Почти идентичный фенотип (Kappen et al., 2004) наблюдался, когда Hoxd4 трансген экспрессировался в тех же самых клетках ( под контролем той же регуляторной кассеты), с задержкой созревания хряща, обнаруживаемой уже на 14.5 день развития.
Добавление фолата к таким Hoxd4 трансгенным мышам восстанавливало жесткость рёбер и позвоночных хрящей и, по-видимому, нормальную продукцию внеклеточного матрикса (Kappen et al., 2004). Не выявлено указаний на систематические аномалии метаболизма фолата у матерей Hoxd4 трансгенного потомства. Было предположено, что специфически хрящ-продуцирующие клетки у развивающихся эмбрионов могут быть прямыми мишенями для благоприятного эффекта фолата. Одной из возможностей может быть то, что хондроциты во ответ на экспрессию трансгена Hoxd4 могут становиться фолат-дефицитными, так что локальный дефицит фолата будет возникать, если Hoxd4 транскрипционный фактор - непосредственно или опросредованно - будет регулировать гены, участвующие в транспорте, утилизации и метаболизме фолата в Hoxd4 трансгенных хондроцитах.
Чтобы изучить возможность локальной нехватки фолата, вызываемой дисрегуляцией транскрипции, мы измеряли уровни экспрессии в хондроцитах всех известных генов, кодирующих белки транспорта фолата или фолат-метаболизирующие энзимы. Во всех случаях контроль проводили в тех же самых выводках. Не выявлено достоверных различий между трансгенными и контрольными выборками. Эти результаты говорят против гипотезы локального дефицита, т.к. не выявляется различий в транскрипции. Аналогичные находки для Hoxс8 подтверждают общее заключение, что метаболизм фолата скорее всего не нарушен в трансгенных хондроцитах.
Однако, благоприятный эффект добавления фолата на созревание хряща у Hoxd4 трансгенных мышей указывает, что фолат действует на др. пути, которые играют роль в созревании хряща. Hoxd4 трансгенная модель подтверждает мнение, что фолат действует на специфические - ещё не установленные - молекулярные пути в дифференцировке хондроцитов.
На существование специфических путей, как мишеней для фолата, указывает тот факт, что реберные и позвоночные хрящи у Hoxd4 трансгенных мышей прекрасно реагируют на фолат, тогда как коленные и трахейные хрящи реагируют плохо (Kappen et al., 2004). Это указывает или на пороги ткане-специфичной реакции созревания хондроцитов или на ткане-специфичные механизмы реакции на фолат. Мезенхима вокруг развивающихся глаз также дефектна у Hoxd4 трансгенов, что приводит к открытым глазам при рождении. Этот фенотип, как известно, затрагивает МЕКК (Xia, Kao, 2004), activin, EGFR (Luetteke et al., 1993; Zenz et al., 2003) и FGFR2 (Li et al., 2001) пути, которые полностью не чувствительны к фолату. Мы полагаем, что наши результаты, хотя и косвенные, предоставляют исчерпывающие доказательства существования специфических онтогенетических механизмов, служащих мишенями в ответ на добавление фолата.

Abberant Skeletal Patterning in Hoxb6 Deficient Mice


Мыши, гомозиготные по целенаправленной делеции (Hoxb6hd) гомеобоксного гена Hoxb6, имеют скелет с дефектами формирования осевого паттерна в шейно-торакальном отделе. В частности, такие мыши имеют трансформации позвонков С6-Т3 в направлении более передних качественных особенностей, с наиболее характерными признаками в виде уродств или полного отсутствия первой пары и рёбер, обычно ассоциированных с 8-м (первым торакальным, Т1) позвонком. Уродства следующей пары рёбер также часты у этих мутантов, сопровождаемые укорочениями, раздвоениями , слияниями и аномальным положением точек прикрепления к грудине реберных хрящей. Наиболее интересно то что фенотип 'missing rib' значительно более пенетрантен на генетическом фоне, представленном преимущественно 129Sv/Ev линией по сравнению с конгенной линией C57Bl/6-Hoxb6hd. Даже когда обнаруживались рудиментарные рёбра или хрящевые элементы в восьмом сегменте позвоночного столба (на C57Bl/6 фоне), образования собственно не атрикулировали с телами позвонков и capitular головки рёбер не развивались.
Добавление фолата было особенно эффективным в восстановлении этого признака: развитие головок ребер и capitular articulation с телом позвонка 8-го сегмента позвоночного столба. Однако, др. скелетные аномалии, особенно гомеозисные трансформации позвонков, оставались неизменными. Также не обнаруживали изменений животные с Hoxb6 мутацией на преимущественно 129Sv/Ev генетическом фоне. Зависимый от линии эффект фолата указывает или на то, что потребление фолата насыщено у 129Sv/Ev беременных самок или что фенотипические проявления Hoxb6 дефицита у 129Sv/Ev мышей слишком тяжелые, чтобы отвечать на фолат.
Однако, внутри контекста Hoxb6-нехватки у C57BL/6 конгенных мышей, важно отметить, что только один аспект Hoxb6 мутантного фенотипа чувствителен к фолату. Собственно формирование головок ребер и их сочленений зависит от Uncx4.1 (Leitges et al,m 2000; Mansouri et al., 2000), который т.обр., представляется потенциальной мишенью для фолата у мутантов Hoxb6 . Это предоставляет строгое прямое доказательство нашего более раннего вывода, что фолат действует на самостоятельные онтогенетические пути, возможно специфически для типов клеток и тканей.

Insights from the Response to Folate Supplementation


(1) Мы продемонстрировали наличие благоприятного эффекта добавления фолата в klde[ генетических моделях абберантного развития скелета. Фолат был эффективен даже когда дефицит фолата у матерей был исключен. Затем, добавление фолата может действовать или на локальную нехватку фолата в специфических типах клеток или на специфические молекулярные мишени, которые являются ткане- или клеточно-специфичными. Не являясь взаимоисключающими, обе возможности строго аргументируют в пользу того, что фолат действует на специфические онтогенетические пути.
(2) Для развивающегося скелета добавление фолата, по-видимому, особенно эффективно во время хондрогенеза, после формирования инициального паттерна. Эта гипотеза подтверждается присутствием, несмотря на адекватный статус фолата, гомеозисных трансформаций, которые, как полагают, специфицируются во время сомитогенеза. Zsk>ncz kb хондрогенные клетки наиболее чувствительными во время конденсации/дифференцировки или во время пролиферации/созревания остаётся ещё выяснить. Всё это предоставляет аргументы, что в развивающемся скелете фолат действует клеточно- и ткане-специфически и регионально локальным способом.
(3)Формирование паттерна осевых структур не затрагивается добавлением фолата у всех трех генетических моделей. Гомеозисные трансформации у Hoxb6 мутантов и каудальные дефекты у Isl1 трансгенных мышей, как полагают, возникают во время сомитогенеза, очевидно перед формированием скелетных конденсатов. Т.к. два дефекта непосредственно не связаны, то это позволяет высказать предположение, что фолат может быть не эффективным во время раннего формирования и удлинения оси.
(4) Isl1 трансгенные мыши редуцируют уровни Wnt3a, но этот сигнальный путь не чувствителен к фолату. Остаётся изучить, является ли этот путь чувствительным к фолату у др. генетических моделей. У Hoxd4 трансгенных мышей МЕКК1, актин, EGFR и EGFR2 пути, участвующие в закрытии век, не чувствительны. У Hoxb6 мутантов процессы формирования осевого паттерна не реагируют на добавления фолата, но Uncx4.1-регулируемые процессы могут быть мишенями для фолата. У Hoxd4 трансгенных мышей транспорт фолата и сами метаболические пути исключены в качестве непосредственных мишеней для фолата. Т.о., косвенно и с помощью негативного исключения наши результаты подчеркивают, что специфические пути стоят ниже эффекта добавления фолата на клеточном и механистическом уровне.
(5) Др. генетические модели ( с мутациями известных генов), которые были объектами добавления фолата в отсутствие дефицита фолата у матерей (Табл. 1) являясь мутациями по гомеодоменовому транскрипционному фактору Cart1 (Zhao et al., 1996), транскрипционному ко-активатору Cited2 (Barbera et al., 2002), paired-доменовому транскрипционному фактору Pax1 (Splotch) и клеточному адаптеру Vangl2 (curly tail), с первыми мутантами, оказавшимися чувствительными к фолату, и последними двумя не чувствительными (Harris,Juriloff, 1999; Juriloff, Harris, 2000). Интересно, что клеточный и временной базис для онтогенетических аномалий в фолат-чувствительных моделях, был разным, что снова указывает на специфические онтогенетические пути, реагирующие на фолат. Всё это позволяет предположить, что потенциально существуют множественные пути, реагирующие на фолат.
(6) Генетические и др. модели материнской или эмбриональной недостаточности фолата - не удивительно - оказались эффективными при добавлении фолата (Табл. 1). Важным следствием этих исследований, однако, является то, что непосредственные пути для утилизации фолата у развивающихся эмбрионов являются перекрывающимися избыточными (по крайней мере, вплоть до поздних стадий беременности), обеспечивают максимальный благоприятный эффект плоду. Т.к. специфические молекулярные пути могут быть особенно чувствительными к фолату и д. существовать пути развития, преимущественно испытывающие влияние фолата, широко используя и повторно используя молекулярные каскады во время многих фаз эмбриогенезе, делая возможным, что реакционные пути, открытые в какой либо парадигме, могут быть генерализованными для всех клеток на некоторых стадиях их дифференцировки.
(7) Недавние данные по статусу фолата у Folf1 и Rfc1 мутантов (Ьф уе al., 2005) показывают, что различия в этих транспортерах влияют на уровни фолата в кровообращении и тканях разным способом: нехватка Rfc1 ассоциирует с низкими уровнями циркуляции фолата, но - по крайней мере, в эпителии колона - нормальные уровни фолата в тканях. Напротив, нехватка Folr1 коррелирует со снижением уровней фолата в тканях, но с нормальным состоянием в сыворотке (Ma et al., 2005). Эти результаты выявляют сложные взаимоотношения между доступностью, системным потреблением, транспортом, утилизацией и клеточным метаболизмом фолата в разных тканях; относительный баланс этих процессов скорее всего является критическим для предупреждения врожденных дефектов, не только при фолат-дефиците, но и более широко в реакциях на фолат в случаях генетических помех.
(8) Точное распределение фолата в тканях у эмбриона изучено недостаточно и сегодня неясно, как контролируется распределение производных фолата carbon-групп по разным биохимическим путям. Фактически очень мало известно о регуляции во времени и пространстве транспортеров фолата и о метаболизирующих энзимах в развивающемся эмбрионе (Barber et al., 1999). Высоко динамический паттерн экспрессии рецепторов фолата чётко указывает, что эти гены не может рассматриваться как гены "домашнего хозяйства" и в свете разных изоформ и множественности генов, эта концепция д. быть поставлена под сомнение и относительно генов, кодирующих энзимы. метаболизирующие фолат.
(9) Наконец, на базе очень ограниченного количества исследований выходит, что чувствительные к фолату биологические процессы и те процессы, которые ответственны а др. добавления ( такие как myo-inositol или methionine) являются действительно эксклюзивными. Это является важным независимым доказательством биологической специфичности в реакциях на пищевые добавления, с находками для одной добавки, имеющей непосредственное реципрокное значение для другой. Мы полагаем. что на базе системных исследований множественных мутантнов/моделей, классификации молекулярных и онтогенетических путей с помощью их чувствительности к фолату, будет возможно получить информацию для рационального предсказания эффективности фолата в ранее не охарактеризованных системах.
Сайт создан в системе uCoz