дают нам четкое представление о внутреннем генерирующим силы механизме растущих микротрубочек, но мало известно о генерации сил с помощью уменьшающихся микротрубочек. Наблюдения в клетках показали, что как притягивающие, так и отталкивающие силы играют роль в симметричном и асимметричном позиционировании центров, организующих микротрубочки в клетке и показали, что эти силы тонко регулируются. Хотя большинство молекулярных механизмов, особенно купирование концов динамических микротрубочек с клеточными мишенями, остается неизвестным и картина возможной стратегии позиционирования только начинает вырисовываться.
Самосборка microtubules (MTs) из ??-tubulin димеров происходит при добавлении пула ГТФ. В зависимости от точно выдержанных условий избыток свободной энергии (?G), который присоединяется при добавлении одиночного ГТФ-tubulin димера к растущей MT, порядка 5-10 k
BT, где k
B является Boltzmann's константой, а T температурой (1 kBT соответствует 4.1 pN·nm при комнатной температуре) [4]. Это указывает на то, что в принципе примерно 50 pN силы может быть продуцировано, если MT растет на расстояние d = 8 nanometer для каждого из 13 добавляемых димеров (Fmax = N?G/d)
3,4. ГТФ, ассоциируемый с ?-tubulin, гидролизуется спустя некоторое время после сборки, это иногда подвергает MT тому, что известно как 'catastrophe' и переключает на состояние быстрого укорочения. ГДФ-ассоциированные димеры нестабильны в полимеризованной форме и они быстро высвобождаются с конца MT как только поступают стабилизированные ГТФ-ассоциированные димеры (эта разборка снова высвобождает примерно 5-10 kBT свободной энергии на димер) [4]. Это приводит к ситуации всеобщей заправки путем консумпции ГТФ, при которой и сборка и разборка являются энергетически благоприятными процессами, которые оказываются доступными в качестве источника энергии для совершения работы. Кроме того, возможно, что некоторая свободная энергия, высвобождаемая посредством самого события гидролиза ГТФ, также вносит вклад в эту силу. Это может быть обусловлено напр., с помощью MT end-tracking белков, которые связывают динамические MTs с мишенью и меняют их MT-сродство в зависимости от состояния нуклеотидов тубулинового димера, к которому они прикреплены [5].
Первые количественные измерения сил, генерируемых одиночными растущими MTs проделаны в экспериментах
in vitro, где MTs собирались из очищенного тубулина, взаимодействуя с гибкими [6] или ригидными [7] барьерами. Хотя убедительные измерения удерживающих сил (внешних сил, необходимых для редукции скорости роста до нуля) всё ещё отсутствуют, ясно, что (достаточно медленно растущие) MTs
in vitro могут противостоять силам, по крайней мере, в 5 pN, что сравнимо с удерживающей силой кинезина [8].
In vivo, где скорость роста MT наивысшая, эти силы могут быть даже боле высокими. Недавние исследования зависимой от силы скорости роста MT при разных концентрациях тубулина [9] и сравнении индуцируемых силой "катастроф" с нормальными катастрофами [10] оба подчеркивают т.наз. механизм Броуновского храповика (ratchet) [11] как возможного механистического сценария для генерации сил MT
in vitro (Рис. 1a)
12,13. В этой картине тепловые флюктуации (Броуновское движение)мишени делают возможными случайные добавления новых субъединиц к растущим филаментам. Это обусловливает рост филамент даже, когда внешняя сила противодействует движению мишени. Т.к. амплитуда флюктуаций снижается по мере увеличения силы, то скорость, с которой новые субъединицы могут вставляться, снижается. При удерживающей силе эта скорость снижается до постоянной величины, при которой субъединицы случайно отсоединяются и в конечном итоге рост больше не происходит. В принципе также возможно, в противоположность тому, что предполагает механизм Броуновского храповика , и последние данные это подтверждают
9,10, что скорость удаления субъединиц существенно усиливается с помощью сил. Общие предсказания для взаимоотношения сила-скорость, которые включают эту возможность, также были выдвинуты
14-16.
Интересно, что одним из результатов модели генерализованного Броуновского храповика для мульти-филамент MTs (Рис. 1b) , является то, что взаимоотношение сила-скорость (но не удерживающая (stall) сила сама по себе [13]) зависит от детальных характеристик роста [14]: оптимальная генерация сил (т.е. самое малое снижение скорости для данной внешней силы) достигается, когда рост происходит регулярным способом и каждая добавляемая субъединица проталкивает мишень на небольшое, одинаковое расстояние вперед. Когда рост скорее нерегулярный и не все добавления субъединиц могут совершать работу (Рис. 1b), то скорость роста снижается быстрее в зависимости от силы. Сравнение имеющихся данных с теми двумя возможностями привело к предположению, что MTs, растущие
in vitro без содействия клеточных microtubule associated proteins (MAPs) не могут фактически эффективно конвертировать всю свободную энергию от их сборки в работу
9,16.
Силы, генерируемые с помощью разборки MTs, не были изучены в деталях как ансамбль сил.
In vitro, эти силы могут быть измерены только, если некоторые персистирующие соединения находятся между разбираемыми MT и объектом, к которому эти силы приложены. Однако, это очевидно на основании ранних экспериментов
in vitro с использованием моторов, покрытых кусочками и прикрепленных к динамическим концам MT, так что разборка MT была способна выполнять работу [17].
Force generation at kinetochores and cortical interaction sites
Сегодня не остается сомнений, что сборка и разборка MT могут генерировать силы, обсудим имеющиеся доказательства таких сил, действительно функционирующих в живых клетках. Имеется множество разнообразных примеров процессов, управляемых сборкой MT. Динамические MTs, как было установлено, взаимодействуют с внутриклеточными мембранами и деформируют их в тубулярные формы
18,19. Здесь мы ограничимся только тремя случаями: генерацией сил в месте взаимодействия MT-кинетохора, генерацией сил в клеточном кортексе малых дрожжевых клеток и генерацией сил в кортексе крупных (эмбриональных) клеток (Рис. 2).
Исследования с помощью ЭМ показали, что концы динамических MTs взаимодействуют 'head-on' с кинетохорами митотических хромосом (см. напр., [20]). Т.к. очевидно, что такое прикрепление не мешает продолжающемуся росту и укорочению MT, то были высказаны первые предположения о базирующейся на MT-(dis)assembly генерации сил [3]. Двигательные или мотор-подобные белки также в больших количествах присутствуют на кинетохорах, это расширяет репертуар MT-based сил, которые могут быть генерированы в этих местах взаимодействий (rev. 21 and 22). Недавние исследования
in vivo, включая отслеживание позиции кинетохор
23,24 и лазерное разделение веретена MTs [25] предоставляют всё более и более прямую информацию об относительной важности динамики MT, моторных белков и возможно др. компонентов веретена в генерации сил, необходимых для перемещения хромосом во время раннего митоза и анафазы. Эти экспериментальные наблюдения часто сопровождаются теоретическим моделированием для тестирования различных возможных сценариев
24,26,27. Картина, которая вырисовывается, это деполимеризацией управляемое перемещение хромосом в качестве важного признака анафазы во всех или большинстве систем. Неясно, однако, играют ли силы, генерируемые с помощью роста MT, важную роль на интерфейсе кинетохор [23o], хотя они, по-видимому, вносят вклад в т.наз. полярные силы отторжения, которые возникают в результате взаимодействия между MTs веретена и хромосомными плечами
26,27.
В интерфазе делящихся дрожжей возможно (благодаря GFP-мечению и confocal imaging techniques) показать непосредственно, что двигающие силы MT выполняют функциональную роль
28,29. Чтобы удержать положение ядра примерно в середине клетки, пучки MT зарождаются (nucleated) на ядерной мембране и растут в направлении тыла клетки, где они достигают клеточной мембраны через короткое время ещё до начала катастрофы и укорочения их обратно к своим местам нуклеации
29,30. Во время этого продолжительность контакта, рост MTs могут быть скоррелированы с деформацией ядерной мембраны [29] также как и с перемещением ядра целиком от тыльной стороны клетки (Janson and Tran, unpublished). В мейотических клетках, с др. стороны, перемещения ядра, по-видимому, обеспечиваются с помощью тянущих сил [31]. Недавние эксперименты показали, что лазерное рассечение MTs представляет собой прекрасный инструмент для дальнейшей расшифровки соотв. ролей притягивающих и отталкивающих сил во время позиционирования ядра и веретена у делящихся дрожжей
32,33.
У почкующихся дрожжей взаимодействия MT с кортексом существенны во время митозов, когда веретено нуждается в асимметричном расположении в шейке почки. Здесь большинство доказательств подчеркивает генерацию тянущих сил или с помощью двигательных белков или за счёт деполимеризации MT, обусловленной в результате 'head-on' контактов с кортикальными комплексами
31,34 (Рис. 2a). Рано в процессе, когда наведение MTs всё ещё нуждается в направлении на почку, концы MT, по-видимому, скользят вдоль кортекса или благодаря действию кортикального dynein [35] или путем перемещения с помощью myosin вдоль кортикальных актиновых кабелей [36]. После установления кортикального контакта вне почки bud, фронтальные (head-on) тянущие силы, генерируемые с помощью разборки MT, по-видимому, устанавливают положение веретена в почке [35]. Чтобы предотвратить полную транслокацию веретена внутрь почки, д. действовать антагонистические силы при взаимодействии с кортексом материнской клетки [34oo].
Тянущие силы, генерируемые кортексом, также являются, по-видимому, доминирующим механизмом позиционирования веретена и центров организации MT в крупных клетках эукариот (Рис. 2b). У одно-клеточных эмбрионов
Caenorhabditis elegans веретено позиционировано асимметрично в отношении заднего конца эмбриона за счет обусловленных dynein тянущих сил, генерируемых кортексом [37]. Эксперименты по рассечению лазером не только демонстрирую, что притягивающие силы генерируются [38], но и также то, что дисбаланс между двумя сторонами, по-видимому, обусловливается присутствием большого количества генерирующих силы единиц на задней стороне (as opposed to an increase in the magnitude of the forces generated at each posterior interaction site) [39]. Известно также, что в интерфазных животных клетках позиция центросом контролируется dynein-родственными тянущими силами (см. [40] и [41]). Однако, во время сборки веретена имеются опять же доказательства, что кортикальные силы, генерируемые с помощью концов MT, взаимодействующими с системой actomyosin также играют важную роль [42o].
Во всех случаях, рассмотренных выше, остался открытым вопрос, как регулируется генерация сил и как разные типы сил скоординированы. До сих пор неясно в большинстве случаев действительно ли и как разные типы тянущих (pulling) сил сбалансированы с помощью антагонистических сил, генерируемых с помощью MT pushing (выталкиванию) или, напр., с помощью базирующихся на actomyosin силах, генерируемых в цитоплазме [41].
Positioning strategies: pushing versus pulling
Почему большинство отталкивающих (pushing) сил используется в определенных системах, а тянущие (pulling) силы в др.(Рис. 3)? Одним из важных аспектов является определенно размер системы. Просто невозможно генерировать эффективные толкающие силы, когда MTs становятся через чур длинными. Растущие MT могут перемещаться от MT-организующего центра через клетку, а противостоящие, противодействующие силы в состоянии осуществить своё тормозящее действие только при условии, что противодействующие силы меньше, чем критическая сгибающая сила MT. Когда MT изгибаются, то толкающая сила организующего центра снижается, а продолжающийся рост MT не обязательно ведет к дальнейшему перемещению вперед из организующего центра. Длинные MTs изгибаются легче, чем короткие MTs: необходимы сжимающие силы, чтобы уменьшать изгибы на MT с квадратом от их длины [9]. Напр., MT с типичной жесткостью 25 pN·µm
2? которая фиксирована на одном из концов, способна противостоять силам вплоть до 5 pN только если он остается короче 10 µm (Fccongruent with20?/L2). Это возможно бъясняет, почему маленькие делящиеся клетки могут использовать MT отталкивание для позиционирования ядра (Рис. 3a), тогда как веретена в значительно более крупных C. elegans эмбрионах нуждаются в тянущих силах (Рис. 3b).
Др. важным аспектом может быть асимметрия системы. Может быть легче контролировать асимметричное позиционирование, когда используются тянущие силы или потому, что генераторы кортикальных сил могут быть распределены асимметричным образом
39, 43или из-за геметрию индуцирующих эффектов, как предположено Tsou et al. (они полагают, что моторами обусловленное латеральное скольжение MTs вдоль кортекса генерирует тянущие силы, величина которых зависят от угла между кортексом и прикрепленными MT) [44]. Это может быть причиной того, что почкующиеся дрожжевые клетки, даже несмотря на то, что они малы, используют тянущие силы для позиционирования своего веретена в шейке почки.
In vitro эксперименты в microfabricated камерах [45] и теоретические подсчеты [46] показывают, что толкающие силы могут на самом деле использоваться для нахождения центра закрытой геометрии. Они также подтверждают, что позиционировние нарушается, как только MTs становятся достаточно длинными, чтобы гнуться и изгибаться [45]. Единственным лекарством против этого является сделать так, чтобы MTs подвергались катастрофам достаточно часто [47] (Рис. 3a). Это гарантирует, что MTs будут оставаться в контакте с кортексом достаточно долго, чтобы связывать толкающие силы с организующим центром, тогда как предупреждение MTs от становления достаточно длинными, чтобы помешать движению из организационного центра, обусловливается отталкивающими силами, генерируемыми MTs из др. направления. Установлено, что даже в небольших клетках делящихся дрожжей, MTs извиваются и изгибаются у клеточных концов мутантных клеток, у которых уменьшена скорость катастроф [48].
Насколько известно не сообщалось о количественном теоретическом моделировании или модельных экспериментах, но мы полагаем, что процессы позиционирования, базирующиеся только на нерегулируемых отталкивающих силах, не могут быть стабильными. Мы полагаем, как тольеко организующие центры оказываются близко к одной из сторон клетки, то становится возможным большее количество взаимодействий MT-cortex, что приводит к возникновению более крупных сил в том же самом направлении, указывая тем самым, что равные количества MTs нуклеированы во всех направлениях и что каждый MT-cortex контакт (или фиксированный процент их) генерирует (только) тянущие силы. Напротив, в случае толкающих сил, большее число взаимодействий MT-cortex автоматически ведет к более крупным силам в противопложном направлении и стабильная ситуация достигается, когда места организующих центров (в среднем) посредине [46]. У эмбрионов C. elegans очевидно, что не все MTs взаимодействуют с кортикальными силы-генерирующими сайтами [39]. Следовательно, скорее всего, что антагонистические толкающие силы генерируются с помощью др. MTs и что баланс между ними скомбинирован с регуляцией действительного количества генераторов тянущих сил на передней и задней сторонах, и это контролирует финальное (асимметричное) расположение веретена (см. Рис. 3b).
Regulatory mechanisms
В последнее время появилась информация о ассоциированных с MT белках, которые взаимодействуют специфически с MT концами (rev. 49-52). Эти белки регулируют динамику MT и обеспечивают взаимодействия с кортикальными сайтами
34,53-55 (Рис. 1c). Очевидно, что даже генераторы кортикальных сил сами по себе сначала перемещаются на концы динамичных MTs, чтобы достичь своего кортикального места предназначения
31,56. Избирательная и асимметичная загрузка белков на MT концы, которые обеспечивают взаимодействия MT-cortex, исключаются в качестве одного из инструментов по созданию асимметрии [57o]. Напр., было показано на почкующихся дрожжах, что Kar9, который ответственен за взаимодействие с системой actomyosin, которая ведет веретено в почку, преимущественно загружается на MTs, исходящие от полюсов веретена, которые предназначены для почки, а не для др. полюса веретена.
Регуляция времни взаимодействия MTs с кортексом клетки может обеспечивать др. путь контроля генерации сил. Установлено в разных системах, что, что MTs подвергаются катастрофам более часто вблизи или при контакте с клеточным кортексом
30,58. Недавно было показано, что время кортикального контакта дифференциально регулируется между передней и задней сторонами у
C. elegans [59]. Силы, генерируемые самими растущими MTs могут ускорять катастрофы [10] и тем самым ограничивать время контакта, которое необходимо для создания толкающих сил. Время контакта может также регулироваться с помощью исчезновения из кортекса белков связывающихся с концами, таких как EB1 (Mal3/Bim1), что, по-видимому, предупреждает катастрофы. У делящихся дрожжей было показано, что Mal3 удаляется специфически с концов MT, когда они контактируют с клеточными концами (cell ends) [60]. У почкующихся дрожжей флюктуации в количестве Bim1 соответствуют состоянию полимеризации (growing versus shrinking) MTs на Shmoo кончике [61], указывая тем самым, что варьирующие уровни белков семейства EB1 могут регулировать эффективность событий отталкивания.
Conclusions
In conclusion, it is abundantly clear that forces generated by dynamic MTs play an essential role in controlling the position of mitotic spindles, chromosomes, nuclei and MT organizing centers in the cell. These forces are heavily regulated in a way that is intimately connected to the regulation of MT dynamic instability. In the future our focus needs to be on understanding, mechanistically, how dynamic MT ends interact with cortical interaction sites (and kinetochores), and how these interactions are regulated by different end-binding proteins. Optical-tweezers-based techniques [62] may be one promising in vitro route to study changes in the molecular growth characteristics of MTs induced by the presence of end-binding MAPs (Kerssemakers and Dogterom, unpublished). In addition, scenarios for positioning strategies need to be further tested through genetic and physical manipulation of living cells, in combination with theoretical modeling, computer simulations and model experiments.
Сайт создан в системе
uCoz 
Jacob WJ Kerssemakers, Guillaume Romet-Lemonne and Marcel E Janson