В середине 1970s, были приготовлены поддатливые гели из коллагена хвостов крыс (в основном из collagen I), которые оказались эффективными в поддержании некоторых эпителиальных клеток или в восстановлении некоторых дифференцированных функций в культуре [10-13]. Эксперименты с использованием этих текучих гелей и работы по модуляции уровней коллагена в культуре сухожилий цыплят [14,15], привели к предположению, что д.б. сформулированы искусственные микроусловия ('designer microenvironments') для изучения ткаенеспецифичности [16]. Разумным было желание в легко поддающейся обработке системе, пригодной для экспериментальных манипуляций: клетки, которые могут культивироваться, чтобы стать функциональными или терять функцию по желанию. Итак, цель - цивильное и средовое инженирование тканей и органов. Суммируя наши наблюдения с др. исследованиями, которые подтвердили документально влияние тканевых взаимодействий, стромы и ECM на развитие и функциональную регуляцию тканей, мы постулировали, что 'единицей функции' у высших организмов является не одиночная клетка, а клетка и окружающий её ECM. Более того, было предположено, что ECM м. передавать сигнал в ядро и наоборот и что этот процесс является и динамичным и реципрокным [7]. Если операционной единицей функции является большее, чем клетка, то экспериментальные системы с использованием диссоциированных клеток в тканевой культуре будут неадекватными для выяснения механизма тканевой специфичности, хотя они м.б. пригодны для разрешения многих др. вопросов.
Мы избрали для изучения молочные железы, более конкретно ацинусы молочных желез в качестве экспериментального 'organism' (Рис. 1). Молочная железа один из немногих органов, в которых главное развитие происходит после рождения животного; она также подвергается циклам роста и дифференцировки, апоптоза, регрессии и ремоделирования в течение жизни организма. Молочная железа является разносторонней экспериментальной моделью для изучения того, как формируется и функционирует единица. Имеется достаточно примеров из др. лаб.[1], подтверждающих наше утверждение, что данные, полученные на ацинусах молочных желез, б. приложимы к др. железистым органам - если и не во всех деталях, то, по крайней мере, в терминах широкой концепции. Подход с коллагеновым гелем д.б. использован для индукции de novo тканеспецифических функций - не только экспрессии молочных белков [17,18], но и глобальных, тканеспецифических метаболических паттернов [19]. Мы показали, что сигналы, направляющие синтез молочных белков, исходят от basement membrane (BM), т.к. BM и некоторые её компоненты м. замещать текучий коллагеновый гель
Fig.1. The mammary acinus as an experimental animal. Schematic
presentation of a 3D acinus in basement membrane. Questions
currently being addressed include the following. How is an acinus
formed? How does it maintain polarity? How does it become
disordered in malignancy? What molecules and signaling pathways
are involved?
Fig.2. The structure resulting from acinus formation in 3D BM cultures resembles an in vivo mammary acinus [21]. (a) A low magnification transmission
EM of an acinus formed in culture. (b) A light microscope picture of an acinus from a section of a gland in vivo2
в индукции экспрессии молочного белка [20]. В противоположность др. культуральным условиям культивируемые клетки на вершине поддатливой
богатой laminin BM обеспечивают в результате заметную степень и морфологической и функциональной дифференцировки [18,21] (Рис. 2). Причина функциональной дифференцировки заключается в текучем (floating) коллагеновом геле, на это указывает отложение эндогенной BM в этих условиях [22]. Однако, дифференцировка не происходит, если BM была cross-linked или если тонкий слой BM накладывался на чашку. В этих условиях клетки не деформировали гель и , следовательно, не становились деполяризованными. Т.о., потребность в молекулах BM, изменении клеточной формы [23] и в поддатливом субстрате стала очевидной. М. ли одиночные клетки в контакте с ECM дифференцироваться и экспрессировать молочные белки? Да. Клетки будут секретировать молочный белок β-casein, если гель сделан из BM, но нет, если он состоит из collagen I [24], указывая тем самым на потребность в специфических компонентах BM. Ингибирование β1-integrin-cell взаимодействий д. прерывать пердачу сигналов, которые индуцируют экспрессию β-casein, указывая на потребность в β1-integrin лигандах [24]. Компонент BM, который взаимодействует с β1-интегринами, является laminin-1 [25], молекула. которая, как первоначально сообщалось, является важной для развития полярности в почках [26]. Впервые ECM-(laminin) чувствительный элемент был найден в промоторе гена β-casein и был назван BCE-1 (bovine casein element 1)[27,28]. Транскрипционный фактор, связывающийся с BCE1 необходим, но недостаточен для передачи сигналов. Многочисленные исследования показали, что эти транскрипционные факторы необходимы также для экспрессии генов молочных белков в ответ на гормональные и др. сигналы
in vivo [29,30]. Энхансер д.б. активирован с помощью BM и/или laminin, или с помощью изменений в ацетилировании гистонов, последние даже если клетки были на 2D субстрате [31]. Функциональная дифференцировка зависит от степени сложности тканевой архитектуры, достигаемой в культуре [32] (Рис. 3). В отличие от β-casein, большинство др. молочных белков не синтезируются при выше описанных условиях, это указывает на необходимость межклеточных взаимодействий и образования поляризованных ацинусов [32]). Т.о., уровень специфицированной функции детерминирует единицу функции. В исследовании функции эпителиальных клеток молочных желез в культуре стало очевидным, что межклеточные взаимодействия и замкнутость ацинусов вокруг просвета являются равными партнёрами в регуляции аспекта поляризации в функциональной дифференцировке. Т.к. единица тканевой специфичности больше, чем клетка плюс её ECM, то функциональной единицей д. рассматриваться сам орган [33].
The importance of laminin, polarity and
myoepithelial cells
Значение laminin 1, β1-integrin и др. ECM рецепторов в функции молочных желёз продемонстрирована и в культуре и
in vivo [24,34-37]. Однако, если эпителиальные клетки молодых желёз м. формировать функциональные ацинусы в присутствии обогащенного laminin геля в культуре, то какова тогда роль миоэпителиальных клеток, которые окружают просветные эпителиальные клетки
in vivo (Рис. 1)? Глядящие в просвет (luminal) клетки, внедренные в 3D collagen-I, экспрессируют различные поверхностные интегрины со своей внедренной в 3D BM [38]. Было использовано два подхода для выяснения роли миоэпителиальных клеток в функциональной интеграции ацинусов. Когда очищенные первичные просветные клетки вмуровывали в колаген I гель, то они формировали
Fig. 3. Milk protein production requires a hierarchical set of events including availability of lactogenic hormones, correct cytoskeletal organization, laminin-1,
proper cell–cell interactions, formation of acini with apico-basal polarity, and cavitation and formation of lumina for secretion of milk [33].
направленные изнутри (inside-out) структуры ( т.е. они имели обратную полярность). Внедрение очищенных миоэпителиальных клеток, BM или laminin 1 (но не ламинина 5 или 10/11) в эти гели восстанавливало полярность ацинусов [39] (Рис. 4). Др. структурные единицы, такие как десмосомы [40] и полудесмосомы [41] также безусловно необходимы для достижения и поддержания полярности ацинусов. Эти данные подтверждают ранние находки относительно важности ламинина в передаче сигналов генам молочных белков [25], в тканевой архитектуре и полярности клеток MDCK [42]. Механизмы, с помощью которых эпителиальные клетки становятся полярными и формируют соединения, и роль laminin I в этом процессе рассматривались неоднократно [42-47,48]. Важно напомнить, однако, что хотя эпителиальные клетки в tissue culture plastic и м. рассматриваться как 'polar' т.к. они имеют чёткую апикально/базальную полярность, эта полярность не является функциональным эквивалентом тех же самых клеток в 3D полярных ацинусах. Рассуждения выше о продукции молочных белков в культуре выясняют, что функциональная дифференцировка в 2D и 3D не эквивалентна; более того, общие сигнальные пути также регулируются по-разному в 2D и 3D.
Normal and malignant breast cells can be
distinguished in 3D BM
Одна из характеристик эпителиальных клеток в tissue culture plastic заключается в том, что в отличие от фибробластов не всегда
Fig. 4. Myoepithelial cells contribute to correct polarity of luminal epithelial cell acini by providing laminin-1. Luminal epithelial cells make inside-out acini
in collagen (middle) as shown by sialomucin (green) and ESA (red) staining. Addition of laminin-1 producing myoepithelial cells (MEP) to the 3D
collagen cultures reverts the polarity (right) to resemble that of luminal epithelial cell acini in laminin-rich 3D BM (left) ([39], reproduced with
permission). Lr, laminin-rich.
легко отличить нормальные от злокачественных клеток, поскольку они часто растут с одинаковыми скоростями и сходны также морфологически. Вместе с лаб. Ole Petersen's мы разработали многостороннюю методику для быстрого отличия нормальных и злокачественных клеток молочных желез людей в 3D BM в определенной среде [49], модифицируя подход, разработанный дл грызунов и обсужденный выше (Рис. 2) [1,50-52]. Результатом был не только инструмент для дискриминации между нормальными и злокачественными клетками, но и система для изучения фенотипического поведения клеток пред озлокачествлением [53,54]. Эти данные показали, что клетки молочных желез теряют архитектурную интеграцию перед тем как стать злокачественными. Более того, деструкция BM
in vivo и в культуре м. приводить к потере архитектуры молочных желёз[55], потере функциональной дифференцировки [56], злокачественному поведению [57] и опухолям молочных желёз [58]. Принимая во внимание, что аберрации микроусловий и тканевой структуры м. приводить туморогенезу, возникает вопрос, верно ли противоположное: возможно ли восстановление тканевой структуры нормальным поведением?
Restoration of tissue architecture can trump
the malignant phenotype of breast cancer cells
Изучение поверхностных рецепторов клеток молочных желёз людей в серии прогрессии, описанной выше (HMT3522) [53,54] показало, что некоторые пути интегринов и рецепторов ростовых факторов переутомляются ('overdrive') что ведет к дисбалансу передачи сигналов. Коррекция активности β1 integrin и EGFR и/или ингибирование родственных сигнальных путей (MAP киназа и PI3 киназа) д. ревертировать злокачественный фенотип несмотря на злокачественный генотип [59-61]. Ре-экспрессия некоторых молекул, которые изменены или подавлены в злокачественных клетках, такие как dystroglycan и возможно молекулы супрессоров опухолей AZU-1 (TACC1), м. также восстанавливать нормальный фенотип [62,63]. Неожиданно, даже метастатические клетки м.б. ревертированы (или убиты), если обрабатываются комбинацией ингибиторов адгезии и ингибиторов сигнальных молекул [64]. Реверсионный assay даёт драматический пример того как отличается регуляция сигнальных путей в 2D и 3D: если клетки были ревертированы, используя β1-integrin или EGFR ингибирующие антитела, то передача сигналов через эти пути нормализуется. Неожиданно общие уровни белка EGFR и β1-integrins также нормализовались. Эта регуляция петлёй обратной связи не происходила в 2D культурах [60]
(см. Table 1). Дополнительные доказательств указывают на то, что некоторые биологические процессы, также как и адгезивные комплексы используют разные пути в 2D и 3D [65,66-70]).
Реверсионный assay м. также, как полагают, использоваться для скрининга, который помогает нам понять, как моделировать ацинусы. Принимая во внимание, что злокачественная популяция (напр., HMT3522-T4-2) м.б. ревертирована к почти нормальному фенотипу разными способами (Рис. 6a), то и др. злокачественные клетки м.б. сходным образом ревертированы к морфологически нормальной форме (Рис. 6b). Исследование генетической экспрессии показало, что разные методы реверсии T4-2 клеток м. модулировать разные гены, но продуцировать сходную архитектурную и поведенческую конечный результат. Напр., сравнение ряда генов, экспрессия которых меняется, когда T4-2 клетки ревертируют путём блокирования β1-integrin или EGFR показало, что из ~8000 тестированных генов имеется лишь кучка генов, которые обычно изменяются обоими методами реверсии, несмотря на тот факт, что экспрессия ~200-250 генов меняется, когда T4-2 клетки ревертируются с помощью любого из агентов (Рис. 6c). Интересно, что анализ путей, в которые вовлекаются дифференциально экспрессируемые гены и биохимические данные [59,60,63],однако, указывают на то, что некоторые канонические сигнальные пути и в самом деле являются внутренне присущими и реципрокно связанными с ацинусами независимо от использованных ревертирующих агентов. Как эти ацинусы приобретают эти замечательные свойства остаётся выяснить.
Fig. 5. Non-malignant and tumorigenic breast epithelial cells can be distinguished from each other in the 3D BM assay. HMT3522–T4-2 (tumorigenic) cells (middle panel) can be reverted to a near-normal morphology, as discussed in the text. Organization of F-actin (green) that is lost in T4-2 (tumor) cells (nuclei shown in red) is restored in T4-2 cells reverted by down-modulation of EGFR signaling [60] or other means (see Figure 6).
Табл.1 Cross-modulation of EGFR and β1-integrin
β1 integrin and EGFR protein levels and signal activation are coordinately modulated in HMT-3522 cells cultured in 3D lrBM but not in 2D. When 3D
T4-2 cells are treated with functional inhibitors of either β1-integrin or EGFR (T4-2 treated) to revert the cells, endogenous b1-integrin and EGFR
protein levels down-modulate coordinately. This phenomenon does not occur in 2D.
Restoration of form as a means of
deciphering how form is maintained:
modeling breast tissue architecture
Чтобы интерпретировать наши специфичные для молочных желез результаты и создать концептуальный каркас для последующего моделирования, мы начали получать стимулы от др. дисциплин с надеждой, что любые параллели, которые возникнут, м. привести к дальнейшим размышлениям. Коротко очертим, каков механизм, базирующийся на стохастической изменчивости [3], которыЙ, как считается, важен для клеточной судьбы и наведения [71,72] и который м. иметь отношение к ацинусам молочных желёз. В литературе природа взаимоотношений между PI3K, PIP3 и PTEN выявляется как потенциальный молекулярный механизм, лежащий в основе феноменов, таких как спонтанная поляризация, клеточные движения
Fig. 6. Reversion strategies as a means of understanding signaling integration in acini. (a) Up- or down-regulation of many factors can cause the
reverted phenotype of T4-2 cells in 3D BM. (b) Many different cell lines, including metastatic cells, can be reverted by combination of the treatments
shown in (a). (c) Venn diagram summarizing gene expression analysis of 8000 genes using cDNA arrays. Genes that showed differential
expression between T4-2 and reverted T4-2 cells when reversion was achieved either by b1-integrin blocking (left) or by EGFR down-regulation
(right) are shown. Differentially expressed genes are defined as genes that show a p-value of 0.05 or lower in four experiments.
и дифференцировка, а также хемотаксис, зависящий от концентрационного градиента морфогена. Эти феномены, как полагают, возникают в результате взаимодействия между купированными компонентами стратегии нарушения клеточной симметрии, само-усиливающимися локальными активаторами, которые м. умножать стохастическую изменчивость (шумы) нелинейным способом, и дально-действующими ингибиторами, которые способствуют конкуренции за активацию между разными областями [71,72]. Этот сценарий поддерживает данное состояние (позитивные петли обратной связи), репрессируют нежелательные состояния (негативные петли обратной связи) и предупреждают изменения состояний, запущенных с помощью малых сигналов. Энзим PI3K и сигнальный фосфолипид PIP3 формирует позитивную петлю обратной связи и м.б. приравнены к локальным само-энхансерам, тогда как PTEN м.б. кандидатом на роль дально-действующего ингибитора (он противодействует активности PI3K путём дефосфорилирования PIP3). Короче, локальный само-энхансер м. б. переписан с терминах двух компонентов, A (PI3K) и B (PIP3), в которых A влияет на B (A ! B), а B влияет на A (B ! A). Дально-действующий ингибитор C (PTEN) влияет на A (C ! A). Ниже мы расширим интерпретацию A, B и C вводя молекулярные виды, чтобы включить 'клеточные модули' Hartwell et al. [4]. На шкале, более соответствующей ацинусам и молочным железам A, B и C д. б. представлены модулями тканевого уровня, такими как 'внеклеточный матрикс', 'полярность' и т.д. Более плодотворно рассматривать, что организация и поведение ткани характеризуется не только её способностью поддерживать гомеостаз (ошибкоустойчивость к шумам), но и также её способностью использовать внутренне присущие неопределенности в продуктивным пространство- и время-зависимым образом. Т.о., решение клеток в ткани пролиферировать, дифференцироваться или подвергаться апоптозу м. возникать благодаря внутриклеточным и/или внеклеточным сигналам, которые склонны к стохастическим вариациям, нарушающим баланс между и/или выбирающими среди пред-существующих состояний. В нашем экспериментальном организме, ацинусе молочных желез, события, такие как передача BM сигналов, образование кластеров рецепторами, взаимообщение, цитоскелетные перестройки м ремоделирование хроматина м. сделать возможным врожденную асимметричную амплификацию процессов и событий (локальное само-усиление и ингибирование на большом расстоянии), инициируемых в соотв. месте и в соотв. время, чтобы сделать возможной реверсию туморогенного фенотипа. В пространстве и во времени осуществляемая близость, расположение и ориентация будут предопределять области, способные эксплуатировать стохастические вариации, чтобы увеличить вероятность активации мишени с помощью эффектора. Событие активации д. запускать
позитивную петлю обратной связи, которая умножает сигнал, что приводит в результате к накоплению вторичных мессенджеров и дополнительных нижестоящих сигналов. Т.о., спецификация позиции небольших инициальных событий д. давать большие локальные сигналы, способные запускать в движение каскад(ы), которые дают в результате наблюдаемый фенотип. Существуют выраженные различия в локализации ряда различных молекул в 2D и 3D [59,60]. Вызывая одно и то же событие в определенной клеточной и тканевой локализации [73,74], в 2D и 3D микроусловиях, м. запускать разные каскады и тем самым различия в возможном поведении. Хотя эта идея чисто спекулятивна, мы полагаем со временем она найдет экспериментальное подтверждение, как это имело место с бактериями [3].
Conclusions
The efforts to model an acinus of the mammary gland was
rooted in the early studies of cell and developmental
biologists in the late 1960s and early 1970s, and yet it has
taken a few decades to amass enough data for its utility to
be recognized. It is now ready for broader use, and several
laboratories in addition to ours are using the 3D BM
model of breast acini to generate tissue-relevant data
[66,75,76]. Models of skin, kidney, liver, and other
tissues have also been attempted with varying degrees
of success (briefly reviewed in [1]). The skin models, in
particular, are sophisticated and robust (for reviews on
this topic see [77–79]). Along with tissue-specific conditional
knockout and transgenic mice, we believe it is
imperative to develop functional 3D models of other
tissues. The dearth of knowledge in areas such as pancreatic
and other glandular epithelial cancers make them
important candidates for a concerted effort to establish
functional tissue models in culture.
This commentary has focused on efforts to model aspects
of tissue architecture in culture, what has been learned
from these studies, and thoughts on asymmetry-breaking
mechanisms that might be relevant to cells in an acinus.
An acinus is only one part of breast tissue. In general,
tissues can be viewed as large, heterogeneous communities
of cells that respond swiftly and dynamically to
variations in their immediate microenvironment but
nevertheless remain robust and essentially stable. Coordination,
control and communication occur in a space- and
time-dependent manner so that the demands on a tissue,
for example the demand for milk in the breast, is handled
appropriately. Such physiological processes take place on
underlying anatomical structures. An emerging field of
study is the ‘anatomy’ and ‘physiology’ of complex networks
such as the World WideWeb, the Internet backbone
and so on [5,6]. Therefore, exploiting parallels between
biological tissues and such systems may yield useful tools
for modeling the human breast acinus discussed here. The
challenge is to deconstruct a tissue into a hierarchy of
functional units (nodes) and to reassemble them (i.e. to
form connections between the nodes) in a manner that
captures the key properties of the entire ensemble.
Сайт создан в системе
uCoz
Aylin Rizki and I Saira Mian