Функция

Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes E.Brasset, C.Vaury Heredity, 2005, V.94, No 6, P. 571-576
Рис.1. \| Insulators possess two main properties Рис.2. \| Boundaries interact with nuclear pore proteins by the nuclear pore complex Рис.3. \| Schematic model of the insulator function in the nuclear organization of chromatin. Рис.4. \| Connection between enhancer-blocking activity and imprinting: the mammalian insulator ICR taken as an example.	Точный контроль экспрессии генов, осуществляется посредством взаимодействий между основной транскрипционной кухней на промоторе гена и специфическими белковыми комплексами энхансерных или сайленсерных элементов. Энхансеры и сайленсеры осуществляют дально-действующие эффекты независимо от их положения и ориентации. Тем не менее, соседние гены, потенциально испытывающие влияние от присутствия того же самого энхансера внутри определенного хромосомного локуса, могут обладать независимыми транскрипционными профилями. Как же объясняется ограниченный предел действия энхансера. Формирование независимых доменов генной функции может зависеть от класса регуляторных элементов, способных блокировать несоответствующее действие энхансеров или сайленсеров. Такие регуляторные элементы названы insulators (Kuhn, Geyer, 2003). Инсуляторы определяются по двум функциональным свойствам, показанным на Рис. 1). Во-первых, инсулятор способен блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, когда располагается в промежуточном положении (Conte et al., 2002; Geyer, Corces, 1992; Kellum, Shedl, 1992). Во-вторых, инсулятор (называемый также барьером) предупреждает распространение соседнего конденсированного хроматина и защищает эфкспрессию генов от позитивных или негативных эффектов хроматина (Kellum, Shedl, 1991; Reseman et al., 1993; Saitoh et al.,, 2000). What are the mechanisms of action of insulators? Инсуляторы являются регуляторными элементами, которые могут защищать гены от несоотв. регуляторных взаимодействий. Трансгенные подходы помогли выяснить точную последовательность событий, необходимых для изоляции (insulation), и показали, что короткие последовательности - если мультимеризованы - могут воспроизводить эффект инсулятора (Scott et al., 1999). Они помогли определить общие свойства инсуляторов, такие как блокирующую энхансер и/или барьерную функции. Однако, пока невозможно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этих функций или интегрировать в общую схему дополнительные наблюдения, такие как: (i) разделимость блокирующей энхансеры и барьерной функции (Recillas-Targa et al., 2002); (ii) эффективность инсулятора зависит от его структуры и от природы энхансера, промотора и геномного контекста (Scott et al., 1999; Walters et al., 1999); и (iii) инсуляторы не являются постоянными и непроходимыми элементами (Cai, Shen, 2001); Muravyova et al., 2001). Существуют две не исключающие др. др. модели: одна из них выдвинута благодаря серии данных, описывающих связи между инсуляторами и структурами хроматина высшего порядка, а др. на основании интегральных данных, описывающих связи между свойствами инсуляторов и транскрипцией генов. Insulators and higher-order chromatin structure Структурная модель предполагает, что свойства инсуляторов являются результатом их взаимоотношений с организацией структуры хроматина высшего порядка (Labrador, Corces, 2002). Эксперименты, проведенные на инсуляторах Drosophila melanogaster, идентифицировали ретро-элемент, названный gypsy, помогающий проиллюстрировать эту модель. Этот инсулятор был идентифицирован непосредственно в 3' в 5' длинном терминальном повторе gypsy. Этот фрагмент в 340 п.н., который содержит кластер из 12 выродившихся (degenerate) сайтов связывания для zinc-finger DNA белка, Su(Hw). Этот инсулятор способен блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами и защищать ген от соседнего хроматинового эффекта (van der Vlag et al., 2000). Оба свойства зависят от Su(Hw), который рекрутирует белок Mod(mdg4). Инсулятор gypsy не является специфическим для одиночного энхансера, а. как было установлено, действует как блокатор для более чем 20 энхансеров. Если этот так, то инсулятор не устанавливает непроходимого барьера. В определенных условиях инсулятор проходим, эффект. блокирующий энхансеры, нейтрализуется и сообщение энхансер-промотор восстанавливается. Такая проходимость наблюдается, когда два инсулятора gypsy помещены между энхансером и промотором. Эта потеря инсуляторной активности, как было предположено, является результатом внутрихромосомного спаривания между двумя инсуляторами gypsy, в результате чего хроматин образует складку и позволяет дистальному энхансеру контактировать с промотором. С помощью расширения одиночный вставленный gypsy инсулятор д. блокировать общение энхансер-промотор путем взаимодействия или с др. инсулятором, локализованным в удаленном локусе, или в специфическом ядерном сайте (Cai, Shen, 2001; Muravyova et al., 2001). Доказательства, что gypsy инсулятор создает хроматиновые домены подтверждены тем фактом, что Su(Hw) и Mod(mdg)4 ассоциируют с 500 сайтами в геноме Drosophila melanogaster, но сливаются только в 25 крупных структурах. Эти структуры названы инсуляторными тельцами, и как предполагается, образуют отдельные петлевые домены внутри генома. Последовательности gypsy инсулятора д. затем становиться геномными сайтами, где такие взаимодействия оказываются благоприятными и, таким образом, ответственны за генерацию таких петель. Согласно этой модели Gerasimova et al., (2000) показали, что ядерное позиционирование последовательностей может быть изменено. Если, прикрепить к gypsy инсулятору последовательности, то они целенаправленно направляются на периферию ядра, где инсуляторные тельца обнаруживаются в своём большинстве. Более того, недавние эксперименты показали, что спаривание между двумя гетерологичными инсуляторами, такими как связывающие сайты для GAGA фактора и gypsy инсулятором, также могут происходить в геноме и это возможно является способом обойти активность инсулятора (Melnikova et al.,, 2004). Почти все описанные инсуляторы позвоночных нуждаются в связывании регуляторного белка CTCF для своей активности. Некоторые недавние результаты показали, что CTCF очищается вместе с ядрышковым белком, присутствующим на периферии ядрышек, подтверждая тем самым, что он помогает смещать инсуляторы на периферию ядрышка. Эти взаимодействия могут генерировать петли, сходные с теми, что описаны для инсуляторного элемента gypsy у Drosophila melanogaster(Yusufzai et al., 2004). Всё это вместе с фактом, что CTCF также ассоциирует с ядерным матриксом, указывают на функциональную связь между инсуляторами и ядерным матриксом и ядерной организацией. Связь между активностью инсуляторов и их взаимодействием с некоторыми ядерными структурами в дальнейшем была подтверждена данными, полученными благодаря генетическому скринингу, осуществленному у дрожжей и специфически нацеленному на выделение генов, участвующих в возможной связи между ядерным порядком и границами хроматина. Различные белки, участвующие в ядерно-цитоплазматическом трафике, такие как экспортины Cse1p или Mex67p, были идентифицированы при этом скрининга и они, по-видимому, блокируют распространение гетерохроматина за счет прямого и косвенного закрепления инсуляторных элементов в ядерных порах (Ishii et al., 2002) (Рис. 2). Faswb, notch мутация у Drosophila melanogaster, разрушает пограничный элемент, это приводит в результате к альтерации структурной организации хромосомы, видимой за счет элиминации диска в гигантских политенных хромосомах личиное (Vazquez, Schedl, 2000). Хотя все эти примеры приложимы к 3D петлям в функции инсуляторов, но некоторые результаты не совсем согласуются со структурной моделью, как уникальной моделью инсуляции. Напр., первые инсуляторы, идентифицированные у Drosophila в виде специализированных структур хроматина, scs и scs' (Kellum, Schedl, 1991,1992), являлись границами, окружающими локус 87А7, где располагались два hsp70 гена. Как было предположено выше для gypsy элементов, взаимодействие между scs и scs' не являются генеральным свойством этих элементов, а зависят от последовательностей, локализованных вне специфического домена, несущего инсуляторную функцию (Kuhn et al., 2004). Кроме того, Majumder и Cai тестировали эффект спаривания на активность блокирования энхансеров у 11 гомологичных и гетерологичных инсуляторных комбинаций. Результаты показали, что в отличие от гомологичного спаривания gypsy инсулятора или гетерологичного спаривания gypsy и сайтов связывания для GAGA фактора (Melnikova et al., 2004), гетерологичные комбинации gypsy и др. инсуляторов, а также гомологичное спаривание с др. пограничными элементами, такими как scs или SF1, не всегда редуцируют их блокирующую энхансеры активность (Majumder, Cai, 2003). Далее, некоторые спаренные инсуляторы обнаруживают более высокий уровень энхансер-блокирующей активности, чем любой одиночный инсулятор, указывая тем самым, что они могут функционировать независимо или аддитивно (Majumder, Cai, 2003). В целом, структурная модель предполагает, что инсуляторы разделяют хроматиновые нити на петли, прикрепленные к фиксированным околоядерным субстратам, вообще-то к ядерному lamin, который служит в качестве каркаса для поддержания ядерной организации. Однако, если такие 3D петли провоцируются специальными локализациями вне ядра, то они могут также служить средством для предупреждения цис-диффузии некоторых молекул, необходимых для транскрипционной кухни. Формирование петель может затем действовать как первичная ступень транскрипционной модели. Insulators and gene transcription Транскрипционная модель предполагает, что инсуляторы оказывают непосредственное влияние на транскрипцию (Geyer, 1997; Bell, Felsenfeld, 1999; Dorsett, 1999). Т.о., транскрипционная модель зависит от превалирующей модели энхансерной функции и может быть суммирована в виде двух разных механизмов. Если предположить, что сигнал распространяется воль волокон хроматина от энхансера к промотору, тогда инсуляторы образующие ансамбли в нуклеопротеиновых комплексах, могут блокировать распространение энхансерного сигнала вдоль ДНК. В этом случае они действуют как физические барьеры, способные остановить активацию гена его энхансером. Эксперименты, проведенные с транскрипционным фактором GAGA из Drosophila melanogaster иллюстрируют эту модель. GAGA может стимулировать транскрипцию, соединяя энхансер с родственным ему промотором. Это облегчает дально-действующую активацию путём создания белковых мостиков, которые способствуют общению энахсера с промотором. Инсуляторы могут вмешиваться в это свойство GAGA и ограничивать поставку этого фактора к промотору (Majumder et al., 2002). Предполагается, что энхансер распространяется в качестве облигаторного перемещающегося сигнала в направлении промотора, затем инсулятор д. конкурировать с промотором за энхансер и отлавливать его в непродуктивное взаимодействие (Geyer, 1997). Подтверждением этой модели служит факт, что промотор обнаруживается внутри scs и scs' элементов (Glover et al., 1995; Avramova, Tikhonov, 1999), подтверждая, что эти элементы могут быть не только нейтральными структурными элементами, как предполагает структурная модель, а скорее их промотор может титровать энхансерную функцию и удерживать её от активации транскрипции. Ограничением для транскрипционной модели служит то, что она не способна объяснить, почему пограничные элементы находятся между энхансером и промотором, чтобы функционировать как блокаторы энхансера. В любом случае, она не способна объяснить, как энхансер блокированный с одной стороны с помощью инсулятора, может активировать промотор на др. стороне. Т.о., д. рассматриваться альтернативная модель, использующая белки, называемые facilitators, которые сводят энхансер и промотор вместе. Среди таких facilitators, Drosophila Chip белок, которые взаимодействует с Su(Hw) (Morcillo et al.,, 1997). Генетические доказательства показывают, что Su(Hw) оказывается более эффективным инсулятором, когда общение энхансер-промотор ослабляется за счёт мутаций в Chip. предполагается, что образование Chip-Su(Hw) комплексов разрывает цепь взаимодействия между Chip и гомеодоменовыми белками, вмешиваясь в процесс, который подводит энхансер в направлении промотора. Недавний анализ показал, что барьерные элементы могут играть роль в предупреждении разделения между молчащим и активным состянием хроматина. Репрессивный хроматин был охарактеризован несколькими молекулярными маркёрами, такими как обильное метилирование гистона Н3 по лизину 9, гипоацетилирование гистонов Н3 и Н4, а также связывание гетерохроматинового белка 1. С др. стороны, транскрипционно активный хроматин ассоциирует с гиперацетилированием Н3 лизина 9 и 14. Некоторые наблюдения подтверждают, что барьеры разрывают код гистоновых модификаций, необходимых для распространения молчания вдоль волокон хроматина. Напр., метилированные нуклеосомы вокруг HS4 инсулятора β-глобинового локуса кур, как полагают, рекрутируют Suv39H1 и делает возможным метилирование соседних нуклеосом. 5'HS4 инсулятор β-глобиновго локуса д. ацетилировать соседние вышестоящие нуклеосомы, которые предупреждают метилирование и тем самым останавливают распространение сигнала конденсации (Burgess-Beusse et al., 2002). Эта модификация состояния нуклеосом внутри инсулированного трансгена -указывает на то, что др. модель может объяснить позиционный эффект защиты инсуляторов. Инсуляторы могут непосредственно облегчать ацетилирование нуклеосом. Возникающий в результате открытая структура хроматина д. связывать факторы, защищающие ген от метилирования ДНК (Recillas-Targa et al., 2002). В заключение, отдельные данные безусловно подтверждают и/или структурную и транскрипционную модели. Поэтому возможно, что инсуляторы м. использовать некоторые из этих механизмов, хотя это необходимо ещё доказать. Role of insulatord in nuclear function Partition of distinct chromosomal regions В дополнение к структурной роли в организации ДНК внктри ядра, хроматин также интимно вовлечен в регуляцию экспрессии эукариотических генов (Felsenfrld et al., 1996). Барьеры являются фундаментальными деятелями, удерживающими соседние домены активного и неактивного хроматина в самостоятельными и предупреждая эти регионы от нежелательных взаимодействий (Рис. 3). У дрожжей Saccharomyces cerevisiae барьеры описаны в местах соединений между гетерохроматиновой областью с гипоацетилированными лизинами во всех стрежневых гистонах, и активной эухроматиновой областью с многочисленными ацетилированными гистонами (Kimura et al., 2002; Suka et al., 2002). Эти результаты подтверждают, что инсуляторы могут устанавливать метки, специфицирующие функциональные качественные особенности соседних доменов хроматина. У кур ген рецептора folate отделен от вышестоящего β-глобинового локуса областью в 16 т.п.н. молчащего хроматина. На 5' границе β-глобинового локуса, последовательность 5'HS4, маркированная конституитивным DNAse I-hypersensitive сайтом, действует как барьер, препятствующий вторжению вышестоящего соседнего репрессивного хроматина (Prioleau et al., 1999). Наконец, в теломерах дрожжей молчащие локусы типов спаривания (НМ) и рДНК повторы обладают многими признаками гетерохроматиновых генов. Эти характеристики вместе с компактной организацией генома подтверждают, что регуляция дрожжевых генов использует эффективные механизмы для инсуляции генов от др. остальных. Некие последовательности, названные STAR (subtelomeric antisilencing region), способны противостоять сайленсером-управляемой репрессии в локусе типа спаривания HML и действовать с анти-сайленсерными свойствами против распространения молчащего хроматина (Singh, Klar, 1992; Fourel et al., 1999, 2001). Во всех этих случаях инсуляторы д. гарантировать, что переход от одного домена к следующему будет происходить в фиксированной позиции. Insulators facilitates complex gene regulations В эухроматине инсуляторы способны блокировать внешние энхансеры и сайленсеры (Akasaka et al., 1999). Т.о., они играют фундаментальную роль в блокировании несоотв. действия этих регуляторных последовательностей на ген и в изоляции независимых транскрипционных единиц от перекрёстной реакции с соседними регуляторными последовательностями (Рис. 4). Др. пример, связанный с Drosophila melanogaster связан с Fab-7 элементом. В комплексе bithorax, BX-C, набор парасегмент-специфических регуляторных доменов разделен границами, такими как Fab7. Эти границы ответственны за автономную активность IAB-6 и IAB-7, которые контролируют экспрессию гена Abd-B в парасегментах 11 и 12. соотв. Fab-7 активен в широком наборе тканей от раннего эмбриогенеза вплоть до взрослой стадии. Fab-7 граница содержит разделяемые области, который функционируют на разных стадиях развития (Schweinsberg, Schedl, 2004). Этот пример иллюстрирует, как инсуляторы могут ограничивать регуляторные взаимодействия в определенном локусе, а также представляют пример, как такие инсуляторные элементы могут осуществлять дифференциальные активности и дирижировать сложными регуляторными областями. Наконец, обнаружена связь между энхенсер-блокирующей активностью и импринтированными локусами, указывающая на роль инсуляторов в установлении эпигенетических маркеров в хроматине. Эта функция была выявлена благодаря анализу инсулятора млекопитающих ICR (imprinted control region), функционального элемента, найденного в эндогенном локусе IGF2/H19. Регулируемый с помощью специфичного родительского метилирования, инсулятор участвует в импринтинге этого локуса. Когда он присутствует на материнской хромосоме, то его инсуляторная функция блокирут доступ IGF2 промотора к энтодермальным энхансерам, давая в результате исключительно экспрессию Н19. Когда он присутствует на отцовской хромосоме, то ICR метилируется и способствует установлению инсуляции (Thorvaldsen et al., 1998; Webber, Tilghman, 1998). ICR, таким образом, выполняет две антогонистические роли в зависимости от его родительского происхождения: или он выполняет инсуляторскую функцию или он участвует в поддержании метилированного состояния хроматина (Engel et al., 2004) (Рис. 4) Insulators and higher-order nuclear organization of chromatin within the nucleus Как показано выше некоторые данные указывают на то, что инсуляторы участвуют во вторжении хроматина в ядерные субструктуры. MARs (matrix attachment regions) обнаруживаются вблизи некоторых регионов, определяемых как инсуляторы. Один из таких примеров это фланкирующий MAR элемент гена apoB человека, локуса, предположительно представляющего сайт прикрепления для хромосомной петли (Antes et al., 2001). У кур MAR элемент также идентифицирован на 5' границе локуса lysozyme, который, как полагают, обеспечивает организацию хроматинового домена гена lysozyme (Stief et al., 1989). Т.о., благодаря своим ассоциированным факторам инсуляторы могут играть фундаментальную клеточную роль по рекрутированию генов мишеней в специфические ядерные компартменты как способ поддержания ткань- или онтогенетически-органиченный паттерн экспрессии. Инсуляторы могут способствовать взаимодействию между отдельными регуляторными элементами и промоторами. Возможная модель, объясняющая дальние взаимодействия между энхансерами и промоторами, базируется на инсуляторах. Как было сказано выше, два инсулятора могут взаимодействовать посредством комплексов, с ними связанных. Это взаимодействие может генерировать образующие петлю последовательности, разделяющие энхансер и его промотор, и сводить энхансеры и промоторы в дозированную близость. Инсуляторы могут затем облегчать взаимодействия на больших расстояниях. Недавние исследования активного локуса β-globin подтвердили эту модель. В самом деле, они предоставили доказательства дально-действующей регуляции гена in vivo с использованием взаимодействия между транскрипционными элементами с выпячивающимся петлей хроматином. Кроме того мышиный β-глобиновый locus control region (LCR) найден в физической близости от активных глобиновых генов, хотя этот LCR локализуется на расстоянии в 40-60 т.п.н.. Это взаимодействие и looping-out наблюдаются только в экспрессирующих тканях и не наблюдаются в неэкспрессирующих тканях (Tolhuis et al, 2002). Эти данные предоставляют дополнительные доказательства, что вовлечение инсуляторов в такую регуляцию является динамическим процессом, который происходит только во время транскрипции in vivo. Conclusion The prevalent mechanism leading to gene regulation operates via complex chromatin structures. In this context, insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes because together with the chromatin structure, they act as crucial organizers of the genome dynamic. Since they have been identified in many eukaryotic genomes, they are supposed to have conserved roles in the organisms: they guarantee specificities of enhancer-promoter interactions, and define autonomous domains for transcription; they counteract regulatory communication between adjacent domains; they facilitate interactions between distant enhancers and promoters; and they act as genome organisers participating in nuclear organization. All these functions are not static as previously thought, but act as dynamic functions adapted to the transcriptional and/or developmental state of the cell. Thus, they provide the plasticity required to respond to developmental and environmental cues. As expected, in light of all these functions it is not surprising to find clear connections between insulator mutations and human diseases as illustrated in a congenital form of myotonic dystrophy associated with a loss of the function of the DM1 insulator (Filippova et al, 2001). Although all the roles reported above have been clearly attributed to insulators, it is nevertheless intriguing to find in some cases that deletion of some insulator sequences is not lethal and sometimes has no obvious phenotype. Genomic redundancies can certainly explain some of these results. Further, an as yet unsolved question is to understand why mutant alleles of genes implicated in the insulator function of a large number of sequences scattered in the genome, such as Su(Hw) for gypsy, are not lethal. It is obvious that further analyses of these functional elements of the chromosomes and their associated factors are necessary for the understanding of interactions linking large genomic regions into one regulatory, organizational and evolutionary unit.

Точный контроль экспрессии генов, осуществляется посредством взаимодействий между основной транскрипционной кухней на промоторе гена и специфическими белковыми комплексами энхансерных или сайленсерных элементов. Энхансеры и сайленсеры осуществляют дально-действующие эффекты независимо от их положения и ориентации. Тем не менее, соседние гены, потенциально испытывающие влияние от присутствия того же самого энхансера внутри определенного хромосомного локуса, могут обладать независимыми транскрипционными профилями. Как же объясняется ограниченный предел действия энхансера. Формирование независимых доменов генной функции может зависеть от класса регуляторных элементов, способных блокировать несоответствующее действие энхансеров или сайленсеров. Такие регуляторные элементы названы insulators (Kuhn, Geyer, 2003). Инсуляторы определяются по двум функциональным свойствам, показанным на Рис. 1). Во-первых, инсулятор способен блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, когда располагается в промежуточном положении (Conte et al., 2002; Geyer, Corces, 1992; Kellum, Shedl, 1992). Во-вторых, инсулятор (называемый также барьером) предупреждает распространение соседнего конденсированного хроматина и защищает эфкспрессию генов от позитивных или негативных эффектов хроматина (Kellum, Shedl, 1991; Reseman et al., 1993; Saitoh et al.,, 2000).

What are the mechanisms of action of insulators?

Инсуляторы являются регуляторными элементами, которые могут защищать гены от несоотв. регуляторных взаимодействий. Трансгенные подходы помогли выяснить точную последовательность событий, необходимых для изоляции (insulation), и показали, что короткие последовательности - если мультимеризованы - могут воспроизводить эффект инсулятора (Scott et al., 1999). Они помогли определить общие свойства инсуляторов, такие как блокирующую энхансер и/или барьерную функции. Однако, пока невозможно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этих функций или интегрировать в общую схему дополнительные наблюдения, такие как: (i) разделимость блокирующей энхансеры и барьерной функции (Recillas-Targa et al., 2002); (ii) эффективность инсулятора зависит от его структуры и от природы энхансера, промотора и геномного контекста (Scott et al., 1999; Walters et al., 1999); и (iii) инсуляторы не являются постоянными и непроходимыми элементами (Cai, Shen, 2001); Muravyova et al., 2001). Существуют две не исключающие др. др. модели: одна из них выдвинута благодаря серии данных, описывающих связи между инсуляторами и структурами хроматина высшего порядка, а др. на основании интегральных данных, описывающих связи между свойствами инсуляторов и транскрипцией генов.

Insulators and higher-order chromatin structure

Структурная модель предполагает, что свойства инсуляторов являются результатом их взаимоотношений с организацией структуры хроматина высшего порядка (Labrador, Corces, 2002). Эксперименты, проведенные на инсуляторах Drosophila melanogaster, идентифицировали ретро-элемент, названный gypsy, помогающий проиллюстрировать эту модель. Этот инсулятор был идентифицирован непосредственно в 3' в 5' длинном терминальном повторе gypsy. Этот фрагмент в 340 п.н., который содержит кластер из 12 выродившихся (degenerate) сайтов связывания для zinc-finger DNA белка, Su(Hw). Этот инсулятор способен блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами и защищать ген от соседнего хроматинового эффекта (van der Vlag et al., 2000). Оба свойства зависят от Su(Hw), который рекрутирует белок Mod(mdg4). Инсулятор gypsy не является специфическим для одиночного энхансера, а. как было установлено, действует как блокатор для более чем 20 энхансеров. Если этот так, то инсулятор не устанавливает непроходимого барьера. В определенных условиях инсулятор проходим, эффект. блокирующий энхансеры, нейтрализуется и сообщение энхансер-промотор восстанавливается. Такая проходимость наблюдается, когда два инсулятора gypsy помещены между энхансером и промотором. Эта потеря инсуляторной активности, как было предположено, является результатом внутрихромосомного спаривания между двумя инсуляторами gypsy, в результате чего хроматин образует складку и позволяет дистальному энхансеру контактировать с промотором. С помощью расширения одиночный вставленный gypsy инсулятор д. блокировать общение энхансер-промотор путем взаимодействия или с др. инсулятором, локализованным в удаленном локусе, или в специфическом ядерном сайте (Cai, Shen, 2001; Muravyova et al., 2001). Доказательства, что gypsy инсулятор создает хроматиновые домены подтверждены тем фактом, что Su(Hw) и Mod(mdg)4 ассоциируют с 500 сайтами в геноме Drosophila melanogaster, но сливаются только в 25 крупных структурах. Эти структуры названы инсуляторными тельцами, и как предполагается, образуют отдельные петлевые домены внутри генома. Последовательности gypsy инсулятора д. затем становиться геномными сайтами, где такие взаимодействия оказываются благоприятными и, таким образом, ответственны за генерацию таких петель. Согласно этой модели Gerasimova et al., (2000) показали, что ядерное позиционирование последовательностей может быть изменено. Если, прикрепить к gypsy инсулятору последовательности, то они целенаправленно направляются на периферию ядра, где инсуляторные тельца обнаруживаются в своём большинстве.

Более того, недавние эксперименты показали, что спаривание между двумя гетерологичными инсуляторами, такими как связывающие сайты для GAGA фактора и gypsy инсулятором, также могут происходить в геноме и это возможно является способом обойти активность инсулятора (Melnikova et al.,, 2004).

Почти все описанные инсуляторы позвоночных нуждаются в связывании регуляторного белка CTCF для своей активности. Некоторые недавние результаты показали, что CTCF очищается вместе с ядрышковым белком, присутствующим на периферии ядрышек, подтверждая тем самым, что он помогает смещать инсуляторы на периферию ядрышка. Эти взаимодействия могут генерировать петли, сходные с теми, что описаны для инсуляторного элемента gypsy у Drosophila melanogaster(Yusufzai et al., 2004). Всё это вместе с фактом, что CTCF также ассоциирует с ядерным матриксом, указывают на функциональную связь между инсуляторами и ядерным матриксом и ядерной организацией.

Связь между активностью инсуляторов и их взаимодействием с некоторыми ядерными структурами в дальнейшем была подтверждена данными, полученными благодаря генетическому скринингу, осуществленному у дрожжей и специфически нацеленному на выделение генов, участвующих в возможной связи между ядерным порядком и границами хроматина. Различные белки, участвующие в ядерно-цитоплазматическом трафике, такие как экспортины Cse1p или Mex67p, были идентифицированы при этом скрининга и они, по-видимому, блокируют распространение гетерохроматина за счет прямого и косвенного закрепления инсуляторных элементов в ядерных порах (Ishii et al., 2002) (Рис. 2).

Faswb, notch мутация у Drosophila melanogaster, разрушает пограничный элемент, это приводит в результате к альтерации структурной организации хромосомы, видимой за счет элиминации диска в гигантских политенных хромосомах личиное (Vazquez, Schedl, 2000).

Хотя все эти примеры приложимы к 3D петлям в функции инсуляторов, но некоторые результаты не совсем согласуются со структурной моделью, как уникальной моделью инсуляции. Напр., первые инсуляторы, идентифицированные у Drosophila в виде специализированных структур хроматина, scs и scs' (Kellum, Schedl, 1991,1992), являлись границами, окружающими локус 87А7, где располагались два hsp70 гена. Как было предположено выше для gypsy элементов, взаимодействие между scs и scs' не являются генеральным свойством этих элементов, а зависят от последовательностей, локализованных вне специфического домена, несущего инсуляторную функцию (Kuhn et al., 2004). Кроме того, Majumder и Cai тестировали эффект спаривания на активность блокирования энхансеров у 11 гомологичных и гетерологичных инсуляторных комбинаций. Результаты показали, что в отличие от гомологичного спаривания gypsy инсулятора или гетерологичного спаривания gypsy и сайтов связывания для GAGA фактора (Melnikova et al., 2004), гетерологичные комбинации gypsy и др. инсуляторов, а также гомологичное спаривание с др. пограничными элементами, такими как scs или SF1, не всегда редуцируют их блокирующую энхансеры активность (Majumder, Cai, 2003). Далее, некоторые спаренные инсуляторы обнаруживают более высокий уровень энхансер-блокирующей активности, чем любой одиночный инсулятор, указывая тем самым, что они могут функционировать независимо или аддитивно (Majumder, Cai, 2003).

В целом, структурная модель предполагает, что инсуляторы разделяют хроматиновые нити на петли, прикрепленные к фиксированным околоядерным субстратам, вообще-то к ядерному lamin, который служит в качестве каркаса для поддержания ядерной организации. Однако, если такие 3D петли провоцируются специальными локализациями вне ядра, то они могут также служить средством для предупреждения цис-диффузии некоторых молекул, необходимых для транскрипционной кухни. Формирование петель может затем действовать как первичная ступень транскрипционной модели.

Insulators and gene transcription

Транскрипционная модель предполагает, что инсуляторы оказывают непосредственное влияние на транскрипцию (Geyer, 1997; Bell, Felsenfeld, 1999; Dorsett, 1999). Т.о., транскрипционная модель зависит от превалирующей модели энхансерной функции и может быть суммирована в виде двух разных механизмов. Если предположить, что сигнал распространяется воль волокон хроматина от энхансера к промотору, тогда инсуляторы образующие ансамбли в нуклеопротеиновых комплексах, могут блокировать распространение энхансерного сигнала вдоль ДНК. В этом случае они действуют как физические барьеры, способные остановить активацию гена его энхансером. Эксперименты, проведенные с транскрипционным фактором GAGA из Drosophila melanogaster иллюстрируют эту модель. GAGA может стимулировать транскрипцию, соединяя энхансер с родственным ему промотором. Это облегчает дально-действующую активацию путём создания белковых мостиков, которые способствуют общению энахсера с промотором. Инсуляторы могут вмешиваться в это свойство GAGA и ограничивать поставку этого фактора к промотору (Majumder et al., 2002).

Предполагается, что энхансер распространяется в качестве облигаторного перемещающегося сигнала в направлении промотора, затем инсулятор д. конкурировать с промотором за энхансер и отлавливать его в непродуктивное взаимодействие (Geyer, 1997). Подтверждением этой модели служит факт, что промотор обнаруживается внутри scs и scs' элементов (Glover et al., 1995; Avramova, Tikhonov, 1999), подтверждая, что эти элементы могут быть не только нейтральными структурными элементами, как предполагает структурная модель, а скорее их промотор может титровать энхансерную функцию и удерживать её от активации транскрипции. Ограничением для транскрипционной модели служит то, что она не способна объяснить, почему пограничные элементы находятся между энхансером и промотором, чтобы функционировать как блокаторы энхансера. В любом случае, она не способна объяснить, как энхансер блокированный с одной стороны с помощью инсулятора, может активировать промотор на др. стороне. Т.о., д. рассматриваться альтернативная модель, использующая белки, называемые facilitators, которые сводят энхансер и промотор вместе. Среди таких facilitators, Drosophila Chip белок, которые взаимодействует с Su(Hw) (Morcillo et al.,, 1997). Генетические доказательства показывают, что Su(Hw) оказывается более эффективным инсулятором, когда общение энхансер-промотор ослабляется за счёт мутаций в Chip. предполагается, что образование Chip-Su(Hw) комплексов разрывает цепь взаимодействия между Chip и гомеодоменовыми белками, вмешиваясь в процесс, который подводит энхансер в направлении промотора.

Недавний анализ показал, что барьерные элементы могут играть роль в предупреждении разделения между молчащим и активным состянием хроматина. Репрессивный хроматин был охарактеризован несколькими молекулярными маркёрами, такими как обильное метилирование гистона Н3 по лизину 9, гипоацетилирование гистонов Н3 и Н4, а также связывание гетерохроматинового белка 1. С др. стороны, транскрипционно активный хроматин ассоциирует с гиперацетилированием Н3 лизина 9 и 14. Некоторые наблюдения подтверждают, что барьеры разрывают код гистоновых модификаций, необходимых для распространения молчания вдоль волокон хроматина. Напр., метилированные нуклеосомы вокруг HS4 инсулятора β-глобинового локуса кур, как полагают, рекрутируют Suv39H1 и делает возможным метилирование соседних нуклеосом. 5'HS4 инсулятор β-глобиновго локуса д. ацетилировать соседние вышестоящие нуклеосомы, которые предупреждают метилирование и тем самым останавливают распространение сигнала конденсации (Burgess-Beusse et al., 2002). Эта модификация состояния нуклеосом внутри инсулированного трансгена -указывает на то, что др. модель может объяснить позиционный эффект защиты инсуляторов. Инсуляторы могут непосредственно облегчать ацетилирование нуклеосом. Возникающий в результате открытая структура хроматина д. связывать факторы, защищающие ген от метилирования ДНК (Recillas-Targa et al., 2002).

В заключение, отдельные данные безусловно подтверждают и/или структурную и транскрипционную модели. Поэтому возможно, что инсуляторы м. использовать некоторые из этих механизмов, хотя это необходимо ещё доказать.

Role of insulatord in nuclear function

Partition of distinct chromosomal regions

В дополнение к структурной роли в организации ДНК внктри ядра, хроматин также интимно вовлечен в регуляцию экспрессии эукариотических генов (Felsenfrld et al., 1996). Барьеры являются фундаментальными деятелями, удерживающими соседние домены активного и неактивного хроматина в самостоятельными и предупреждая эти регионы от нежелательных взаимодействий (Рис. 3).

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae барьеры описаны в местах соединений между гетерохроматиновой областью с гипоацетилированными лизинами во всех стрежневых гистонах, и активной эухроматиновой областью с многочисленными ацетилированными гистонами (Kimura et al., 2002; Suka et al., 2002). Эти результаты подтверждают, что инсуляторы могут устанавливать метки, специфицирующие функциональные качественные особенности соседних доменов хроматина.

У кур ген рецептора folate отделен от вышестоящего β-глобинового локуса областью в 16 т.п.н. молчащего хроматина. На 5' границе β-глобинового локуса, последовательность 5'HS4, маркированная конституитивным DNAse I-hypersensitive сайтом, действует как барьер, препятствующий вторжению вышестоящего соседнего репрессивного хроматина (Prioleau et al., 1999).

Наконец, в теломерах дрожжей молчащие локусы типов спаривания (НМ) и рДНК повторы обладают многими признаками гетерохроматиновых генов. Эти характеристики вместе с компактной организацией генома подтверждают, что регуляция дрожжевых генов использует эффективные механизмы для инсуляции генов от др. остальных. Некие последовательности, названные STAR (subtelomeric antisilencing region), способны противостоять сайленсером-управляемой репрессии в локусе типа спаривания HML и действовать с анти-сайленсерными свойствами против распространения молчащего хроматина (Singh, Klar, 1992; Fourel et al., 1999, 2001).

Во всех этих случаях инсуляторы д. гарантировать, что переход от одного домена к следующему будет происходить в фиксированной позиции.

Insulators facilitates complex gene regulations

В эухроматине инсуляторы способны блокировать внешние энхансеры и сайленсеры (Akasaka et al., 1999). Т.о., они играют фундаментальную роль в блокировании несоотв. действия этих регуляторных последовательностей на ген и в изоляции независимых транскрипционных единиц от перекрёстной реакции с соседними регуляторными последовательностями (Рис. 4).

Др. пример, связанный с Drosophila melanogaster связан с Fab-7 элементом. В комплексе bithorax, BX-C, набор парасегмент-специфических регуляторных доменов разделен границами, такими как Fab7. Эти границы ответственны за автономную активность IAB-6 и IAB-7, которые контролируют экспрессию гена Abd-B в парасегментах 11 и 12. соотв. Fab-7 активен в широком наборе тканей от раннего эмбриогенеза вплоть до взрослой стадии. Fab-7 граница содержит разделяемые области, который функционируют на разных стадиях развития (Schweinsberg, Schedl, 2004). Этот пример иллюстрирует, как инсуляторы могут ограничивать регуляторные взаимодействия в определенном локусе, а также представляют пример, как такие инсуляторные элементы могут осуществлять дифференциальные активности и дирижировать сложными регуляторными областями.

Наконец, обнаружена связь между энхенсер-блокирующей активностью и импринтированными локусами, указывающая на роль инсуляторов в установлении эпигенетических маркеров в хроматине. Эта функция была выявлена благодаря анализу инсулятора млекопитающих ICR (imprinted control region), функционального элемента, найденного в эндогенном локусе IGF2/H19. Регулируемый с помощью специфичного родительского метилирования, инсулятор участвует в импринтинге этого локуса. Когда он присутствует на материнской хромосоме, то его инсуляторная функция блокирут доступ IGF2 промотора к энтодермальным энхансерам, давая в результате исключительно экспрессию Н19. Когда он присутствует на отцовской хромосоме, то ICR метилируется и способствует установлению инсуляции (Thorvaldsen et al., 1998; Webber, Tilghman, 1998). ICR, таким образом, выполняет две антогонистические роли в зависимости от его родительского происхождения: или он выполняет инсуляторскую функцию или он участвует в поддержании метилированного состояния хроматина (Engel et al., 2004) (Рис. 4)

Insulators and higher-order nuclear organization of chromatin within the nucleus

Как показано выше некоторые данные указывают на то, что инсуляторы участвуют во вторжении хроматина в ядерные субструктуры. MARs (matrix attachment regions) обнаруживаются вблизи некоторых регионов, определяемых как инсуляторы. Один из таких примеров это фланкирующий MAR элемент гена apoB человека, локуса, предположительно представляющего сайт прикрепления для хромосомной петли (Antes et al., 2001). У кур MAR элемент также идентифицирован на 5' границе локуса lysozyme, который, как полагают, обеспечивает организацию хроматинового домена гена lysozyme (Stief et al., 1989).

Т.о., благодаря своим ассоциированным факторам инсуляторы могут играть фундаментальную клеточную роль по рекрутированию генов мишеней в специфические ядерные компартменты как способ поддержания ткань- или онтогенетически-органиченный паттерн экспрессии.

Инсуляторы могут способствовать взаимодействию между отдельными регуляторными элементами и промоторами. Возможная модель, объясняющая дальние взаимодействия между энхансерами и промоторами, базируется на инсуляторах. Как было сказано выше, два инсулятора могут взаимодействовать посредством комплексов, с ними связанных. Это взаимодействие может генерировать образующие петлю последовательности, разделяющие энхансер и его промотор, и сводить энхансеры и промоторы в дозированную близость. Инсуляторы могут затем облегчать взаимодействия на больших расстояниях.

Недавние исследования активного локуса β-globin подтвердили эту модель. В самом деле, они предоставили доказательства дально-действующей регуляции гена in vivo с использованием взаимодействия между транскрипционными элементами с выпячивающимся петлей хроматином. Кроме того мышиный β-глобиновый locus control region (LCR) найден в физической близости от активных глобиновых генов, хотя этот LCR локализуется на расстоянии в 40-60 т.п.н.. Это взаимодействие и looping-out наблюдаются только в экспрессирующих тканях и не наблюдаются в неэкспрессирующих тканях (Tolhuis et al, 2002). Эти данные предоставляют дополнительные доказательства, что вовлечение инсуляторов в такую регуляцию является динамическим процессом, который происходит только во время транскрипции in vivo.

Conclusion

The prevalent mechanism leading to gene regulation operates via complex chromatin structures. In this context, insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes because together with the chromatin structure, they act as crucial organizers of the genome dynamic. Since they have been identified in many eukaryotic genomes, they are supposed to have conserved roles in the organisms: they guarantee specificities of enhancer-promoter interactions, and define autonomous domains for transcription; they counteract regulatory communication between adjacent domains; they facilitate interactions between distant enhancers and promoters; and they act as genome organisers participating in nuclear organization. All these functions are not static as previously thought, but act as dynamic functions adapted to the transcriptional and/or developmental state of the cell. Thus, they provide the plasticity required to respond to developmental and environmental cues. As expected, in light of all these functions it is not surprising to find clear connections between insulator mutations and human diseases as illustrated in a congenital form of myotonic dystrophy associated with a loss of the function of the DM1 insulator (Filippova et al, 2001). Although all the roles reported above have been clearly attributed to insulators, it is nevertheless intriguing to find in some cases that deletion of some insulator sequences is not lethal and sometimes has no obvious phenotype. Genomic redundancies can certainly explain some of these results. Further, an as yet unsolved question is to understand why mutant alleles of genes implicated in the insulator function of a large number of sequences scattered in the genome, such as Su(Hw) for gypsy, are not lethal. It is obvious that further analyses of these functional elements of the chromosomes and their associated factors are necessary for the understanding of interactions linking large genomic regions into one regulatory, organizational and evolutionary unit.

Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomesE.Brasset, C.VauryHeredity, 2005, V.94, No 6, P. 571-576

Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes
E.Brasset, C.Vaury
Heredity, 2005, V.94, No 6, P. 571-576