Последнее обновление: 01/26/2025 06:56:08  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
АТЛАС ЭКСПРЕССИИ HOX-ГЕНОВ В РАЗВИВАЮЩЕЙСЯ ПОЧКЕ (мыши)

ATLAS OF HOX GENE EXPRESSION IN THE DEVELOPING KIDNEY
Larry T. Patterson & S. Steven Potter
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 229:771-779, 2004

Перевод Л.М. Константиновой
Hox genes often play important roles in segment identity determination and organogenesis. To better understand the roles of Hox genes during kidney development, we performed an extensive analysis of their expression patterns. Section in situ hybridizations were used to define the expression of 37 Hox genes at embryonic day (E) 12.5, E13.5, E15.5, and E17.5 of kidney development. Several interesting principles emerged. First, the conception of colinearity was preserved. Hox genes from the more 3' positions in clusters were more often expressed in the ureteric bud, which is derived from the anterior of the intermediate mesoderm. Second, Hox genes were expressed throughout the ureteric bud without any segment specificity. Third, in the different segments of forming nephron we did observe overlapping domains of Hox gene expression, which initiated distally at the junction between the nephron and uretericbud, and extended proximally variable distances. Finally, we observed that paralogous Hox genes often showed surprisingly diverse expression patterns. Indeed, contiguous genes on a single cluster more often showed similar expression patterns than paralogs. In summary, the resulting atlas of Hox gene expression provides a foundation for further study of the overlapping functions Hox genes in the developing kidney.

Табл.1 Использованые Ribo-зонды

Список литературы:

Allanson JE, Pantzar JT, MacLeod PM. 1983. Possible new autosomal recessive syndrome with unusual renal histopathological changes. Am J Med Genet 16:57–60.
Argao EA, Kern MJ, Branford WW, Scott WJ Jr, Potter SS. 1995. Malformations of the heart, kidney, palate, and skeleton in alpha-MHC-Hoxb-7 transgenic mice. Mech Dev 52:291–303.
Bell E, Wingate RT, Lumsden A. 1999. Homeotic transformation of rhombomere identity after localized Hoxb1 misexpression. Science 284:2168–2171.
Branford WW, Benson GV, Ma L, Maas RL, Potter SS. 2000. Characterization of Hoxa-10/Hoxa-11 transheterozygotes reveals functional redundancy and regulatory interactions. Dev Biol 224: 373–387.
Carroll TJ, McMahon AP. 2000. Secreted molecules in metanephric induction. J Am Soc Nephrol 11(Suppl 16):S116– S119.
Cho EA, Patterson LT, Brookhiser WT, Mah S, Kintner C, Dressler GR. 1998. Differential expression and function of cadherin- 6 during renal epithelium development. Development 125:803–812.
Cillo C, Barba P, Freschi G, Bucciarelli G, Magli MC, Boncinelli E. 1992. HOX gene expression in normal and neoplastic human kidney. Int J Cancer 51:892– 897.
Davis AP, Witte DP, Hsieh-Li HM, Potter SS, Capecchi MR. 1995. Absence of radius and ulna in mice lacking hoxa-11 and hoxd-11. Nature 375:791–795.
Dolle P, Izpisua-Belmonte JC, Brown JM, Tickle C, Duboule D. 1991. HOX-4 genes and the morphogenesis of mammalian genitalia. Genes Dev 5:1767–1767.
Favier B, Rijli FM, Fromental-Ramain C, Fraulob V, Chambon P, Dolle P. 1996. Functional cooperation between the non-paralogous genes Hoxa-10 and Hoxd-11 in the developing forelimb and axial skeleton. Development 122: 449–460.
Fetterman GH, Fabrizio NS, Studnicki FM. 1967. The study by microdissection of structural tubular defects in certain examples of the hereditary nephropathies. In: Heptinstall R, editor. Proceedings of the Third International Congress of Nephrology. New York: S. Karger. p 235–250.
Gaunt SJ. 1988. Mouse homeobox gene transcripts occupy different but overlapping domains in embryonic germ layers and organs: a comparison of Hox-3.1 and Hox-1.5. Development 103: 135–144.
Gaunt SJ, Sharpe PT, Duboule D. 1988. Spatially restricted domains of homeogene transcripts in mouse embryos: relation to a segmented body plan. Development Suppl 104:169–179.
Gaunt SJ, Krumlauf R, Duboule D. 1989. Mouse homeo-genes within a subfamily, Hox-1.4, -2.6 and -5.1, display similar anteroposterior domains of expression in the embryo, but show stage- and tissue-dependent differences in their regulation. Development 107:131–141.
Godsave S, Dekker EJ, Holling T, Pannese M, Boncinelli E, Durston A. 1994. Expression patterns of Hoxb genes in the Xenopus embryo suggest roles in anteroposterior specification of the hindbrain and in dorsoventral patterning of the mesoderm. Dev Biol 166:465–476.
Graham A, Papalopulu N, Krumlauf R. 1989. The murine and Drosophila homeobox gene complexes have common features of organization and expression. Cell 57:367–378.
Izpisua-Belmonte JC, Duboule D. 1992. Homeobox genes and pattern formation in the vertebrate limb. Dev Biol 152: 26–36.
Kawazoe Y, Sekimoto T, Araki M, Takagi K, Araki K, Yamamura K. 2002. Regionspecific gastrointestinal Hox code during murine embryonal gut development. Dev Growth Differ 44:77–84.
Kessel M, Gruss P. 1990. Murine developmentalcontrol genes.Science249:374– 379.
Kessel M, Balling R, Gruss P. 1990. Variations of cervical vertebrae after expression of a Hox-1.1 transgene in mice. Cell 61:301–308.
Kmita M, van Der Hoeven F, Zakany J, Krumlauf R, Duboule D. 2000. Mechanisms of Hox gene colinearity: transposition of the anterior Hoxb1 gene into the posterior HoxD complex. Genes Dev 14:198–211.
Le Mouellic H, Lallemand Y, Brulet P. 1992. Homeosis in the mouse induced by a null mutation in the Hox-3.1 gene. Cell 69:251–264.
Lelievre-Pegorier M, Vilar J, Ferrier ML, Moreau E, Freund N, Gilbert T, Merlet- Benichou C. 1998. Mild vitamin A defi- ciency leads to inborn nephron deficit in the rat. Kidney Int 54:1455–1462.
Look AT. 1997. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 278:1059–1064.
McGinnis W, Krumlauf R. 1992. Homeobox genes and axial patterning. Cell 68:283–302.
Nelson CE, Morgan BA, Burke AC, Laufer E, DiMambro E, Murtaugh LC, Gonzales E, Tessarollo L, Parada LF, Tabin C. 1996. Analysis of Hox gene expression in the chicklimbbud.Development122:1449– 1466.
Oosterveen T, Niederreither K, Dolle P, Chambon P, Meijlink F, Deschamps J. 2003. Retinoids regulate the anterior expression boundaries of 5 Hoxb genes in posterior hindbrain. EMBO J 22:262–269.
Patterson LT, Pembaur M, Potter SS. 2001. Hoxa11 and Hoxd11 regulate branching morphogenesis of the ureteric bud in the developing kidney. Development 128:2153–2161.
Peterson RL, Papenbrock T, Davda MM, Awgulewitsch A. 1994. The murine Hoxc cluster contains five neighboring AbdB-related Hox genes that show unique spatially coordinated expression in posterior embryonic subregions. Mech Dev 47:253–260.
Potter EL. 1972. Normal and abnormal development of the kidney. Chicago: Year Book Medical Publishers. 305 p.
Qiao J, Cohen D, Herzlinger D. 1995. The metanephric blastema differentiates into collecting system and nephron epithelia in vitro. Development 121:3207– 3214.
Roberts DJ, Smith DM, Goff DJ, Tabin CJ. 1998. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development 125:2791–2801.
Sharpe PT, Miller JR, Evans EP, Burtenshaw MD, Gaunt SJ. 1988. Isolation and expression of a new mouse homeobox gene. Development 102:397– 407.
Taylor HS, Vanden Heuvel GB, Igarashi P. 1997. A conserved Hox axis in the mouse and human female reproductive system: late establishment and persistent adult expression of the Hoxa cluster genes. Biol Reprod 57:1338– 1345.
Valerius MT, Patterson LT, Feng Y, Potter SS. 2002. Hoxa 11 is upstream of integrin alpha8 expression in the developing kidney. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 8090–8095.
Warot X, Fromental-Ramain C, Fraulob V, Chambon P, Dolle P. 1997. Gene dosage- dependent effects of the Hoxa-13 and Hoxd-13 mutations on morphogenesis of the terminal parts of the digestive and urogenital tracts. Development 124:4781–4791.
Wellik DM, Hawkes PJ, Capecchi MR. 2002. Hox11 paralogous genes are essential for metanephric kidney induction. Genes Dev 16:1423–1432.
Zeltser L, Desplan C, Heintz N. 1996. Hoxb- 13: a new Hox gene in a distant region of the HOXB cluster maintains colinearity. Development 122:2475–2484.
Zhao Y, Potter SS. 2001. Functional specificity of the Hoxa13 homeobox. Development 128:3197–3207.
Zhao Y, Potter SS. 2002. Functional comparison of the Hoxa 4, Hoxa 10, and Hoxa 11 homeoboxes. Dev Biol 244:21–36.


ВВЕДЕНИЕ


Такой сложный орган, как почка является производным промежуточной мезодермы. Критическим моментом в её формировании является трансформация исходной мезенхимы в эпителиальную ткань, приводящая к образованию пронефрического протока, который продлевается в каудальном направлении и становится мезонефрическим протоком. Последний в ответ на сигналы продуцирует зачаток мочеточника, который растёт и затем разветвляется. Из клеток исходного зачатка развивается эпителий мочеточника, почечной лоханки и сосочка, а также - собирающих протоков полностью сформированной почки. Зачаток мочеточника также индуцирует мезенхиму метанефроса, которая уже трансформировалась в эпителиальную ткань. Это вновь приводит к росту эпителия и дифференцировке в нефроны, состоящие из гломерул, проксимальных тубул (трубочек), петель Генле и дистальных тубул. На ранних стадиях развития эти нефроны формируют соединения с собирающими протоками (подробно - www.nephrology.iupui.edu/imaging/). Организация нефрона и собирающего протока предполагает линейную ось, вдоль которой происходит дифференцировка нескольких типов клеток эпителия. Как эта ось появляется, и как регулируется дифференцировка клеток вдоль неё - неизвестно, хотя и очень важно в плане функции и клинических нарушений. Отсутствие специфических тубулярных сегментов у человека, таких как проксимальные спирально извитые трубочки, рассмотрено в обзоре Allanson с соавторами (1983). Кроме того, у пациентов с синдромом Lowe (окуло-церебро-ренальный синдром) формируется аномальный паттерн гломерул: с неправильным расположением васкулярного и уринарного полюсов гломерул. Кроме того, эти пациенты имеют интеркалярные клетки, локализованные в спирально извитых трубочках, тогда как в норме они присутствуют только в соединительных трубочках и собирающем протоке (Fetterman et al., 1967). Наконец, установлено наличие аномальной пролиферации мезангиальных клеток и (в другом случае) плотной соединительной ткани в гломерулах (Potter, 1972).
В дополнение к сложности развития почки, сегменты нефрона функционируют не независимо, но на основе пространственной организации (паттерна) нефрона, собирающего протока и сосудов почки. Конечно, большинство дистальных сегментов должно приспосабливаться к изменениям в составе гломерулярного фильтрата, которые происходят более проксимально. Кроме того, правильная функция проксимальных сегментов зависит от функции дистальных сегментов. Так, натриевый градиент, создаваемый толстой восходящей частью петли Генле создаёт осмотическое давление, необходимое для абсорбции воды из нижней части. Чтобы этот механизм функционировал, сегменты должны располагаться в непосредственной близости друг к другу. Дистальные трубочки поддерживают контакт с гломерулами, обеспечивая тубуло-гломерулярную связь и соответствующий уровень работы фильтрационного барьера. Трубочки не могут быть произвольно (случайным образом) ориентированы, но должны быть собраны вместе согласно радиальному паттерну и правильному расположению сегментов. Однако даже в нормальных почках установлены отклонения от этого требования, и некоторые нефроны утрачивают правильный план строения петли Генле (Potter, 1972).
Генетические основы формирования паттерна почечной ткани в ходе развития остаются неизвестными и в этом аспекте резонно обратиться к Hox-генам дрозофилы. Они детерминируют идентификацию сегментов и в случае мутаций вызывают удивительные превращения одних сегментов в другие. Этими генами у дрозофилы кодируются транскрипционные факторы с эволюционно-консервативными гомеодоменами, содержащими helix-turn-helix-мотив. И у млекопитающих, и у мух наблюдается колинеарность экспрессии Hox-генов в отношении порядка их расположения вдоль хромосомы и хронологии включения (Graham et al., 1989). У млекопитающих известны четыре Hox-кластера (A, B, C и D), образованных путём дупликации простого, наследуемого кластера. 39 Hox-генов, сгруппированных в эти кластеры, распадаются на 13 групп паралогов (на основании сходства последовательностей). Кроме указанного сходства, члены каждой группы паралогов часто имеют очень сходный паттерн экспрессии вдоль передне-задней оси эмбриона и выполняют резервную функцию в ходе развития первичной оси тела, конечностей и органов (Kessel & Gruss, 1990; Davis et al., 1995).
Также было показано, что Hox-гены у млекопитающих детерминируют идентификацию сегментов. В отношении осевого скелета у позвоночных встречаются гомеозисные трансформации по типу или неправильной экспрессии (misexpression) Hox-гена, или потери функции. Например, в случае Hoxa2 наблюдаются такие структурные изменения, как приобретение posterior-характеристик передними отделами позвоночника: шейными позвонками (Kessel et al., 1990). Напротив, в случае мутации гена Hoxc8 у мышей позвонки поясничного отдела имеют характеристики, присущие более высоко расположенным отделам (Le Mouelic et al., 1992).
Многие Hox-гены экспрессируются в развивающихся и уже развившихся почках, и их точная регуляция необходима для нормального развития. В нескольких работах по гибридизации in situ были представлены, в частности, данные по экспрессии Hox-генов мыши в почке, но они не являются полными, так как эти работы не были сфокусированы на изучении данного органа. Кроме того, локализация экспрессии более 30 HOX-генов в почках человека не может быть оценена с помощью Northern-блоттинга (Cillo et al., 1992). Исследования, проведенные на мышах, показали важность прямой регуляции Hox-генов в развивающейся почке. Сверх-экспрессия гена Hoxb7 приводит к удвоению почки (Argao et al., 1995), неправильная экспрессия гена Hoxd13 - к ренальной агенезии (Kmita et al., 2000). Наконец, мутация генов-паралогов группы 11 может приводить к дефектам разветвления в морфогенезе или к агенезии почки (Davis et al., 1995; Patterson et al., 2001; Wellik et al., 2002).
В данном сообщении мы приводим исчерпывающий анализ экспрессии Hox-генов мыши в процессе развития ренальной системы. Мы исследовали экспрессию 37 Hox-генов с помощью гибридизации in situ в сериях срезов почки на сроках от E12.5 до E17.5. При этом было установлено несколько интересных моментов. Мы наблюдали колинеарность между позицией Hox-гена в кластере и паттерном экспрессии в развитии почки. Нами обнаружены перекрывающиеся области в случае экспрессии Hox-гена в формирующемся нефроне, но не в зачатке мочеточника. Наконец, мы установили, что паралоги Hox-генов часто дают весьма неожиданные паттерны экспрессии, которые отличаются меньшим сходством, чем паттерны прилежащих, смежных (contiguous) генов. В итоге наше исследование позволило создать атлас экспрессии Hox-генов в развивающейся почке мыши, что послужит основой дальнейшего анализа перекрывающихся функций Hox-генов в органогенезе почки.

РЕЗУЛЬТАТЫ


Мы представляем обширный анализ паттерна экспрессии Hox-генов в ходе развития почки. Эти результаты расширяют предыдущие исследования отдельных Hox-генов и представляют общую перспективу экспрессии Hox-генов почки. Гибридизация in situ осуществлялась с использованием рибопроб, специфических для 37 Hox-генов (Table 1). Выделения паттернов их экспрессии производилось в срезах развивающейся почки на сроках: E12.5, E13.5, E15.5 и E17.5. Поскольку в отношении Hoxa13 и Hoxb13 уже было установлено, что их экспрессия в почке отсутствует (Zeltser et al., 1996; Warot et al, 1997) гибридизация этих генов in situ не осуществлялась. Экспрессия была установлена для 28 генов.

Мезенхима


Суммарно в ходе развития в мезенхиме почки была выявлена экспрессия 24 Hox-генов. Для паттернов их экспрессии наблюдались три варианта. Одни гены экспрессировались диффузно, экспрессия других концентрировалась вокруг зачатка мочеточника, наконец, третья группа генов экспрессировалась по периферии развивающейся почки. Ген Hoxc10 с экспрессией, ограничивающейся мезенхимой, был типичным представителем большинства генов кластера C (Fig. 1A-C).

Fig. 1. Hox gene expression in embryonic day (E) 13.5 kidneys. A–C: In situ hybridizations showed mesenchyme-restricted expression for Hoxc10. D–F: Hoxb7 showed expression limited to the ureteric bud. G–I show variations in relative signal intensities in different domains of the mesenchyme. G: Hoxa10 expression was found predominantly in the mesenchyme surrounding the ureteric bud terminus and was slightly decreased in the intervening mesenchyme (arrow). H: Hoxd12 was expressed in the cortical mesenchyme. I: Hoxd10 expression was more diffuse throughout the mesenchyme. m, mesenchyme; ub, ureteric bud. A and D are 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains to reveal histology. B, E, G, H, and I are darkfield in situ hybridization patterns. C and F show overlaps of DAPI and in situ hybridization patterns. Scale bars  100 m in A (applies to A–C), in D (applies to D–F), in G (applies to G–I).

Для гена Hoxa10 (Fig. 1G) экспрессия преимущественно была установлена в мезенхиме, непосредственно окружающей зачаток мочеточника, и не наблюдалась в районах между зачатками. Экспрессия гена Hoxd12 была обнаружена в мезенхиме на периферии развивающейся почки и отсутствовала в центральной зоне (Fig. 1H). Ген Hoxd10 и многие другие Hox-гены экспрессировались в мезенхиме диффузно (Fig. 1I). Нами также была установлена необычная динамика паттерна экспрессии гена Hoxb9 (Fig. 2). Этот ген имел высокий уровень экспрессии в мезенхиме срезов почки на сроках E12.5 и E13.5. Однако на сроке E17.5 экспрессия Hoxb9 заметно снижалась в мезенхиме и активировалась в зачатке мочеточника.

Fig. 2. Dynamic renal expression pattern of Hoxb9 between embryonic day (E) 12 and E17. A–C: Expression in an early day 12 kidney was found within the mesenchyme and not within the ureteric bud (arrows). D–F: Hoxb9 expression in a late day 12 kidney was found in the mesenchyme and was patchy in the ureteric bud (arrows, no expression; arrowheads, expression in the bud). G–I: On day 13.5, expression was found in the mesenchyme and was no longer patchy in the ureteric bud (arrowhead). J–L: At E17.5 expression of Hoxb9 was predominantly found within the ureteric bud (arrowhead). Scale bars  100 m in A (applies to A–C), in D (applies to D–F), in G (applies to G–I), in J (applies to J–L).

По крайней мере, несколько генов из групп паралогов со 2-й по 12-ую экспрессировались в мезенхиме. Всё же многие из генов, локализованных на 3'-концах Hox-кластеров, включая Hoxa1, a2, a3, b1, b3 и d1 не были обнаружены в ренальной мезенхиме или (за исключением Hoxd1) где-либо ещё в почке. Гены, локализованные на 5'-концах кластеров, наиболее вероятно давали положительный сигнал гибридизации в мезенхиме почки. Мы не наблюдали однородного (nested) паттерна в отношении генов внутри a-кластера и сходства в экспрессии при сравнении генов-паралогов. В обоих кластерах A и B абдоминальных генов (Abd-B) экспрессия была более высокой в мезенхиме, окружающей зачаток мочеточника. Наконец, все Hox-гены кластера С из группы паралогов (с 4 по 11) экспрессировались в мезенхиме и все, кроме Hoxc5, только в мезенхиме.
Паттерны экспрессии Hox-генов в развивающейся почке суммированы на Fig. 3. Как показано наверху рисунка, зачаток мочеточника представляет собой образование Т-образной формы. С правой стороны каждого зачатка мочеточника изображена ранняя стадия формирования нефрона, с уплотнённой мезенхимой метанефроса вокруг зачатка и ранним эпителиальным почечным сосудом - под зачатком. С левой стороны каждого изображения - более поздняя стадия формирования нефрона, с зачатком мочеточника, связанным с тельцем S-образной формы, которое разделено на дистальный и проксимальный сегменты.

Зачаток мочеточника




Fig. 3. Summary of Hox gene expression patterns in the developing kidney. Diagram depicts expression for each of the Hox genes arranged into clusters A–D and paralogous groups 1–13. The central T-shaped structure represents the ureteric bud (ub). The right side of each panel depicts earlier developmental structures with a renal vesicle (rv). The left side depicts later stages when the ureteric bud (ub) is connected to the S-shaped body. The Sshaped body consists of the distal segment (ds), the intermediate segment (is), and the proximal segment (ps). Mesenchyme (m) is shown surrounding the epithelial structures. Red dots represent areas of expression. Panels are included for all Hox genes, including those without detectable expression (no red dots) and those with diffuse expression (evenly distributed dots).

Тринадцать Hox-генов экспрессировались в ткани зачатка мочеточника и его ветвей. Динамический паттерн был установлен для двух из них. Так Hoxd1 экспрессировался в зачатке мочеточника на сроке E12.5 , но не позже (Fig. 3). Экспрессия гена Hoxb9 (Fig. 2) отсутствовала на ранней эмбриональной стадии (до 12-дневного возраста), а позже E12 следы экспрессии наблюдались у разветвляющегося зачатка мочеточника. На ещё более поздних стадиях в производных от зачатка структурах наблюдалась сильная экспрессия гена Hoxb9. А, кроме того, был установлен уникальный паттерн экспрессии Hoxb9: с ограничением на ранних стадиях в мезенхиме метанефроса, затем на сроке E13.5 - с проявлением экспрессии и в мезенхиме, и в зачатке мочеточника, а ещё позже, на сроке E17.5 - с преимущественной экспрессией в зачатке мочеточника.
Мы не наблюдали сегментарной экспрессии в зачатке мочеточника или его ветвях для 13 Hox-генов, которые экспрессировались в зачатке. Единственным наблюдением того, что ген, экспрессирующийся в ткани зачатка мочеточника, экспрессируется и во всей разветвляющейся структуре, были следы ранней экспрессии Hoxb9.
Гены, находящиеся в Hox кластерах ближе к 3'-позиции (паралоги групп 1-8), экспрессировались в зачатке мочеточника и его производных более сходным образом, чем локализованные ближе к 5'-позиции (паралоги групп 9-13). Мы наблюдали экспрессию в зачатке для 13 из 17 Hox-генов с 3'-локализацией, и лишь для 2 из 11 Hox-генов с 5'-локализацией.

Нефрон


Мы обнаружили в характере экспрессии Hox-генов развивающегося нефрона большую вариабельность, чем в зачатке мочеточника. Возникнув на ранней стадии развития нефрона, экспрессия Hoxb2, 4, 5, 6 и 8 продолжалась в зачатке мочеточника, начиная от места их соединения, далее в проксимальном направлении, но, не затрагивая наиболее проксимального сегмента S-образного тельца (Fig.4A-C).



Fig. 4. Hox gene expression is restricted to segments of the developing nephron. A–C: Hoxb6 expression was found in the ureteric bud (ub) at embryonic day (E) 13.5 and continued into the S-shaped developing nephron to the intermediate segment (arrows). No signal was detected in the most proximal segment of the S-shaped body (asterisks). D–F: E13.5 kidney showed no expression of Hoxa10 in most of the ureteric bud (arrowheads). Expression in the S-shaped body began at the junction with the ureteric bud and continued proximally to the intermediate segment where expression terminated abruptly (arrows). G–L: Expression of Hoxa10 was seen in a few cells on the inner aspect of the ureteric bud terminus (G–I), which are enlarged in J–L (arrows). Scale bar  100 m.

Отличающийся от этого паттерн был отмечен для генов Hoxa9, Hox10 и Hoxa11, экспрессия которых в формирующемся нефроне тоже начиналась в месте его соединения с зачатком мочеточника и продолжалась дальше, но исключалась в средних и проксимальных сегментах S-образного тельца (Fig.4D-F). Похожий паттерн экспрессии был установлен для генов C и D-кластеров. Гены Hoxc5, d4, d9 и d10 экспрессировались в развивающемся нефроне (Fig.3).
Все гены, экспрессировавшиеся в нефроне, также экспрессировались и в мезенхиме, хотя обратное утверждение не всегда было справедливо. Наконец, в нефронах мы не обнаружили доказательств однородных (nested) паттернов экспрессии ни для членов одного кластера, ни для членов групп паралогов.

Экспрессия белков


Для Hoxa11 был установлен параллельный характер паттернов экспрессии белков и мРНК (Fig.5).

Fig. 5. A,B: Immunohistochemistry for Hoxa11 showed expression in the mesenchyme cells surrounding the ureteric bud, in cells of the distal nephron that are fused to the ureteric bud (arrow in A), and in cells on the inner aspect of terminal branches of the ureteric bud (arrows in B). The sample in A was double stained, with yellow reflecting localization of uvomorulin (E-cadherin).

Иммуно-гистохимическое исследование Hoxa11 на сроке E16.5 выявило чувствительность к тесту в мезенхиме (особенно вокруг зачатка) и в нефроне (в месте соединения с терминальными ветвями зачатка мочеточника). Эти результаты коррелировали с данными гибридизации in situ, подтвердившими наличие экспрессии в мезенхиме и в нефроне раннего срока развития. Путём гибридизации in situ , проведённой для Hoxa10 (Fig.3G-L) была установлена иммуночувствительность клеток во внутренних частях конца зачатка мочеточника: в районах без выявленной связи его с нефроном. Идентификация белков, продуцируемых Hox-генами, является важной задачей, так как ранее для гена Hoxc6 было установлено, что паттерн его транскрипции, определённый путём гибридизации in situ, не соответствует паттерну, определённому иммуно-гистохимически (Nelson et al., 1996). Напротив, в случае Hoxa11 такая корреляция для паттернов экспрессии данного гена, установленных этими методами, наблюдалась

Паттерн кластер-специфической Hox-экспрессии


Неожиданной находкой был тот факт, что по типам экспрессии гены внутри одного кластера проявили большее сходство друг с другом, чем со своими паралогами из других кластеров. Эти результаты были наиболее показательными в HoxB-кластере (Fig. 3), где все семь генов, давших сигнал гибридизации в почке, экспрессировались в зачатке мочеточника, а пять из семи генов экспрессировались в одной и той же области раннего нефрона. Гены Abd-B-класса в кластере A также проявляли экспрессию в сходных областях: не экспрессировались в зачатке мочеточника, тогда как в области соединения нефрона с зачатком мочеточника их экспрессия наблюдалась. В кластере C шесть из семи генов с экспрессией в почечной ткани транскрибировались только в мезенхиме, но не в мочеточнике. Напротив, паралоги часто совершенно различались по месту экспрессии: Hoxc8 преимущественно экспрессировался в зачатке мочеточника, а Hoxb8 - в мочеточнике и нефроне, а также - в мезенхиме.

ОБСУЖДЕНИЕ


В данном сообщении представлена информация о паттернах экспрессии Hox-генов в развивающейся почке. У позвоночных эти гены ассоциируются с паттерном развития, пролиферацией клеток, разветвлением процессов морфогенеза, индуктивными взаимодействиями (McGinnis & Krumlauf, 1992; Look, 1997; Roberts et al., 1998; Patterson et al., 2001). Следовательно, эти гены являются основными кандидатами на роль регуляторов нефрогенеза. Однако наше предыдущее представление об экспрессии Hox-генов в ходе формирования почки было неполным, часто являлось производным от результатов гибридизации in situ в единственной, ранней (E12.5) точке развития (Gaunt, 1988; Gaunt et al., 1988,1989; Sharpe et al., 1988). Для исправления этого недостатка мы использовали зонды на 37 Hox-генов, чтобы изучить паттерн их экспрессии на многих стадиях развития почки. Составленный в результате этой работы атлас экспрессии указанных генов может быть важной основой для дальнейшего исследования роли Hox-генов в нефрогенезе.
В формировании собирающего протока Hox-гены проявили простой тип паттерна экспрессии. За исключением трёх генов Hoxb9, Hoxa10 и Hoxa11, остальные гены или экспрессировались во всём протоке, или не экспрессировались в нём совсем. Эти данные контрастируют с результатами по другим генам, такими как гены семейства Wnt, которые сегментарно экспрессируются в формирующихся собирающих протоках (Carrol & McMahon, 2000). Наличие экспрессии множества Hox-генов в ходе развития протока позволяет предположить возможность обширной функциональной избыточности, дублирования. Наконец, интригующим является тот факт, что ген Hoxa11 экспрессируется в нескольких клетках на нижней стороне конца зачатка мочеточника. Интересно было бы спекулятивно предположить, что эти клетки маркируют место объединения нефрона с зачатком мочеточника и что продукт гена Hoxa11 может облегчать их взаимодействие. А может быть, эти клетки являются представителями клеток мезенхимы, которые оккупируют зачаток мочеточника - этот процесс был описан ранее (Qiao et al., 1995).
Для экспрессии Hox-генов в мезенхиме наблюдалась большая вариабельность. Некоторые гены экспрессировались в мезенхиме диффузно, для других характерным было усиление экспрессии в уплотнённой части мезенхимы вокруг верхушек. А ген Hoxd12 интенсивно экспрессировался в периферической мезенхиме. Эти паттерны подтверждают роль Hox-генов в построении почечной мезенхимы. Нами установлены дополнительные инстанции пространственно ограниченной экспрессии Hox-генов в развивающемся нефроне. Для большинства из них экспрессия обнаружена в дистальной части нефрона, в месте его соединения с собирающим протоком и представленной варьирующим расстоянием в направлении проксимального нефрона. Следует ещё заметить, что все гены, экспрессировавшиеся в мезенхиме, позже экспрессировались в нефроне. Но не для всех генов наблюдалось обратное, в плане экспрессии, соотношение. Результирующее перекрывание доменов экспрессии имеет сходство с таковым, наблюдавшимся ранее при изучении Hox-генов, участвующих в развитии центральной нервной системы (ЦНС), осевого скелета, половых путей и кишечника (Kessel & Gruss, 1990; Taylor et al., 1997; Kawazoe et al., 2002) - а, следовательно, предполагает и роль перекрывания в регуляции развития нефронов.
О раннем развитии нефрона и его сегментации известно очень мало. В работах предшественников эти процессы связывались с экспрессией кадгеринов (Cho et al., 1998). Функция кадгеринов в опосредованных гомотипических взаимодействиях "клетка-клетка" хорошо подходит для их предполагаемой роли в моделировании и поддержании паттерна проксимо-дистальной оси нефрона.

Колинеарность


При изучении развити ЦНС и осевого скелета было показано, что Hox-гены с 3'-локализацией внутри кластера имеют границы экспрессии, расположенные ближе к переднему (rostral) концу. Эта колинеарность экспрессии и положения генов в кластере наблюдалась также для развивающейся почки. Гены с 3'-локализацией в Hox-кластере часто экспрессировались в зачатке мочеточника, который ведёт своё происхождение от передней промежуточной мезодермы и пронефрического протока. Эти результаты согласуются с тем, что уже известно об экспрессии в пронефрическом протоке генов Hoxb4, Hoxb5 и Hoxb7 у Xenopus (Godsave et al., 1994). Напротив, гены с 5'-локализацией в кластере обычно не экспрессировались в зачатке мочеточника. Кроме того, была почти точная корреляция между локализацией генов в кластере и передне-зедней экспрессией. Эта корреляция наблюдалась в зачатке мочеточника и мезенхиме метанефроса, однако её не было в развивающихся субструктурах формирующегося нефрона.

Паттерн кластер-специфической экспрессии


Смежные Hox-гены каждого отдельного кластера в развивающейся почке часто проявляли очень сходный характер экспрессии, в то время как паттерны паралогов сильно различались. Кластер-специфическая экспрессия в почке контрастирует с тем, что наблюдалось в развивающейся ЦНС и осевом скелете, где паттерн экспрессии паралогов носил более сходный характер. Интересно отметить, что детерминация сегментации тела является одной из эволюционно древнейших функций Hox-генов.
Результаты изучения паттерна экспрессии Hox-генов свидетельствуют об эволюционной дивергенции регуляции генов в развивающейся почке с момента дупликации Hox-кластеров. Простейшее объяснение может быть основано на приобретении кластер-специфичности энхансерами, влияющими на экспрессию множества фланкирующих Hox-генов. Недавно было показано, что энхансер ретиноевой кислоты контролирует экспрессию Hoxb5, Hoxb6 и Hoxb8 у эмбриона мыши (Oosterveen et al., 2003). Было бы интересно узнать, как эти энхансеры функционируют в почке. Указанные выше гены так же, как два других из HoxB-кластера, экспрессировались в мезенхиме и в ткани раннего нефрона, что можно использовать для объяснения редукции числа нефронов у грызунов (крыс), дефицитных по витамину A (Lelievre-Pegorier et al., 1998).
Кластер-специфический паттерн экспрессии Hox-генов также наблюдался в развивающихся конечностях, где гены A-кластера имеют общий домен экспрессии вдоль передне-задней оси (Izpisua-Belmonte & Duboule, 1992). Эволюционные изменения регуляции, отмеченные в случае конечностей, могут быть элементом адаптации к жизни на суше (как дополнение к развитию конечностей). Необходимым элементом такой жизни является адаптация в контроле жидкости и электролитов. Различие в ренальной экспрессии у четырёх кластеров Hox-генов предполагает, что жидкостная и электролитная адаптация могли добавиться к давлению отбора в ходе эволюции регуляции Hox-генов. Кроме того, по-видимому, эти механизмы развились для контроля Hox-экспрессии в первичной оси эмбриона, осях конечностей и в почке.

Перекрывающиеся функции Hox-генов


Мы рассмотрели пространственно ограниченный, широко перекрывающийся паттерн экспрессии 26 Hox-генов развивающейся почки. Функциональная избыточность (дублирование) наблюдается: 1) между паралогами Hox-генов (как установлено для одиннадцатой группы паралогов); 2) между не-паралогами Hoxa10 и Hoxd11 (как в случае развития конечностей было описано в 1996 г. Favier c соавторами); 3) между смежными генами Hoxa10 и Hoxa11 (Branford et al., 2000).
Перекрывающиеся паттерны Hox-экспрессии в почке, ряд экспрессирующихся генов и известные резервные функции паралогов и смежных Hox-генов служат объяснением, почему большинство дефектов почек не были идентифицированы у мышей с помощью мутаций Hox-мишеней. Для обнаружения полной функции Hox-генов в развитии почки, может быть, необходимо исследовать мышей с искомыми мутациями в ряде фланкирующих генов.

→ | K титульной странице | K оригиналам в pdf- и html-формате
Посещений:

Сайт создан в системе uCoz