Kinetochore–spindle microtubule interactions during mitosis
Susan L Kline-SmithE, Sharsti Sandall and Arshad Desai Current Opinion in Cell Biology Volume 17, Issue 1 , February 2005, Pages 35-46
Кинетохора является белковой структурой, которая собирается на центромерной ДНК и обеспечивает прикрепление хромосом к микротрубочкам во время митоза. Это описание несколько упрощено: недавние протеомные исследования показали, что миниатюрные кинетохоры Saccharomyces cerevisiae представлены, по крайней мере, 60 белками, организованными как минимум в 14 различных субкомплексов. Многие из этих белков, такие как centromeric histone variant CENP-A, и целые субкомплексы, такие как Ndc80Hec1 комплекс, законсервированы от дрожжей до человека, несмотря на разныю природу ДНК последовательностей, на которой они собираются в ансамбли. Достигнуты определенные успехи в нашем понимании молекулярных основ того, как кинетохоры образуюжт динамические прикрепления к микротрубочкам веретена и как эти прикрепления ориентируются корректно, чтобы гарантировать расхождение сестринских хроматид в дочерние клетки.
Рис.1. Formation of stable
kinetochore–microtubule attachments. Microtubules are in red
and centromeric chromatin is in gray. Kinetochores are indicated by
ovals in various shades of green corresponding to the level of
kinetochore-localized spindle checkpoint proteins, which are
progressively depleted as microtubules attach to kinetochores. With 95%
depletion of Ndc80 complex subunits, significant depletion of
checkpoint proteins still occurs, suggesting the existence of some type
of attachment between kinetochores and spindle microtubules. However,
stable kinetochore fibers do not form, and chromosome alignment and
segregation is severely perturbed. Thus, the Ndc80 complex plays a
critical role in stabilization of microtubule attachments, allowing the
formation of mature kinetochore fibers capable of aligning and
segregating chromosomes properly.
Рис.2.Regulation of
kinetochore–microtubule dynamics. The assembly dynamics of
kinetochore-attached microtubules is coupled to chromosome movement on
the spindle. Regulators of microtubule dynamics localized to
kinetochores, such as the CLASP family of MAPs and the kinesin-23
family of microtubule depolymerases, are likely to play important roles
in this process. Kinetochore-localized CLASPs (in green) may stimulate
the growth of kinetochore-attached microtubules during anti-poleward
movements that align chromosomes at the metaphase plate. Polymerization
of kinetochore microtubule plus ends is also necessary for poleward
microtubule flux during metaphase. In contrast, the microtubule
depolymerase activity of kinesin-23 proteins (in blue) may contribute
to poleward chromosome movement, although discrepancies between studies
in different systems concerning this putative role need to be resolved.
Arrows indicate the predicted direction of chromosome movement. MT,
microtubule.
Рис.3.Error correction
mechanisms ensure chromosome bi-orientation on the spindle. Attachment
of sister kinetochores to microtubules emanating from opposing spindle
poles, a configuration referred to as bi-orientation, is critical to
ensure chromosome alignment and segregation. This cartoon depicts how
errors in microtubule attachments may be resolved in vertebrate cells
by Aurora B kinase and the kinesin-23 protein MCAK, a newly identified
substrate of Aurora B. Kinetochores and centromeric heterochromatin are
in gray, unphosphorylated MCAK (active microtubule depolymerase) is in
green, and MCAK phosphorylated in the neck region (inactive
depolymerase) is in black. Throughout mitosis, populations of both
phosphorylated and unphosphorylated MCAK exist at the centromere,
although the precise localization of active versus inactive MCAK is
controversial. One interpretation is that active MCAK is more prevalent
when incorrect attachments are present and tension is low. MCAK can
then depolymerize inappropriately attached microtubules. Upon
attachment of sister kinetochores to opposite spindle poles, the
resulting increase in tension prevents Aurora-B-mediated
re-orientation, perhaps by affecting local regulation of MCAK activity.
In fungi, the Dam1 complex is the key target of Aurora BIpl1
implicated in this error correction process. Such a complex has not
been identified in metazoans.
Stefan Westermann, Hong-Wei Wang, Agustin Avila-Sakar, David G. Drubin, Eva Nogales and Georjana Barnes (gbarnes@socrates.berkeley.edu)
The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends
Nature (23 March 2006) | doi:10.1038/nature04409
Хромосомы посредством своих кинетохор взаимодействуют с плюс концами микротрубочек и они расходятся к полюсам веретена, т.к. кинетохорные трубочки укорачиваются во время анафзаы A митоза. Молекулярная природа и качественные особенности связанных с ними белков, которые делают возможной деполиперизацию микротрубочек, чтобы тянуть хромосомы к полюсам во время анафазы, еще не установлены. У почкующихся дрожжей Dam1 комплекс из 10 белков является критическим связывающим микротрубочки компонентом кинетохор1, который олигомеризуется в 50-nm кольцо вокруг микротрубочки in vitro2,3. Было установлено с использованием в реальном времени двухцветной флюоресцентной микроскопии, что кольцевой комплекс перемещается processively на несколько микрометров на концах деполимеризующихся микротрубочек, не отсоединяясь от решетки (lattice). ЭМ анализ 'end-on views' выявил 16-складчатую симметрию кинетохорных колец. Это не совпадающее по регистру расположение по отношению к 13-складычатой симметрии микротрубочек согласуется с механизмом скольжения, базирующемся на электростатическом взаимодействии поверхностей кольца и микротрубочки. Dam1 кольцевой комплекс является молекулярным устройством, которое может передавать силу, генерируемую деполимеризацией микротрубочки в движение вдоль lattice, чтобы облегчить расхождение хромосом.
Рис.1. | A microscopy assay to study the interaction of the Dam1 complex with dynamic microtubules in vitro.
Рис.2. | Collection of multiple Dam1 rings at a depolymerizing microtubule end.
Рис.3. | One-dimensional diffusion of Dam1 rings on stable microtubules.
Рис.4. | Image analysis of the Dam1 ring complex around microtubules.
Литература
The EMBO Journal
Article (02 Apr 2001)
Nature
Letters to Editor (17 Nov 2005)
Nature Cell Biology
Brief Communications (01 Oct 2001)
Во множество задач митотических кинетохор входят и прикрепление хромосом к митотическому веретену, купирование продукции сил за счет динамики микротубулярного полимера и/или моторных белков для перемещения хромосом и ингибирование анафазной сегрегации хроматид до тех пор, пока все хромосомы прикреплены и соответственно расположены1,2. Здесь будут рассмотрены работы по связыванию кинетохор с микротрубочками веретена, по регуляции и динамике микротрубочек, прикрепленных к кинетохорам и по механизмам, которые гарантируют соотв. ориентацию прикрепленных хромосом по отношению к веретену. Мы не будет рассматривать spindle checkpoint2,3 или спецификацию сборки кинетохор [4].
Forming and maintaining stable microtubule attachments
Кинетохоры формируются на центромерном хроматине, чтобы сгенерировать связывающий микротрубочки интерфейс (interface), который связывает хромосомы с митотическим веретеном. Многочисленные белки и белковые субкомплексы участвуют собственно в сборке кинетохор и прикреплению микротрубочек2,5-7, хотя в точности функции большинства из этих белков остаются неясными. Новые идеи о том, как кинетохоры прикрепляют хромосомы к микротрубочкам веретена , возникли благодаря изучению комплекса Ndc80 (Ndc80Hec1, Nuf2, Spc24, и Spc25), который законсервирован от дрожжей до человека8-23 (Table 1). Вариации в хромосомной архитектуре и в способности связывания кинетохор и микротрубочек в царстве животных [24] делает консервацию этого комплекса исключительной находкой. Иммунофлюоресцентный и иммуноэлектронный анализ клеток позвоночных показывает, что Ndc80 комплекс белков локализуется на наружной пластинке кинетохора14,15,19,25, на которой заканчиваются плюс концы микротрубочек [26]. Ndc80Hec-2 и Nuf2 стабильно связаны с кинетохорами, как показывает флюоресценция после photobleaching [19], a её уровни на кинетохорах остаются неизменными во время формирования соединений кинетохор с микротрубочками15,19,20,22,25,27. Эти аттрибуты создают компоненты Ndc80 комплекса, кандидаты на непосредственную роль в обеспечении взаимодействий между кинетохорами и микротрубочками.
Table 1. Mitotic defects resulting from inactivation
of Ndc80 complex proteins in eukaryotic systems.
Species
Complex components
Experimental method
Results
References
Mitotic
progression and morphology
H.
sapiens
Ndc80Hec1
Nuf2 Spc24 Spc25
RNAi Nuf2 in HeLa cells
Chromosome alignment and spindle defects.
Reduced stability of kinetochore fibers to cold treatment. Reduced
inter-kinetochore distances. Poor kinetochore morphology and
microtubule binding at EM level [25].
Active spindle checkpoint.
15,25
RNAi Spc24, Spc25, Ndc80Hec1
in HeLas
Chromosome alignment and spindle defects.
Active spindle checkpoint.
22,23,27
RNAi Nuf2 in HeLa cells
Chromosome alignment and spindle defects.
Active spindle checkpoint with 95% depletion. Inactive spindle
checkpoint with more penetrant depletions.
[36]
Targeting
of kinetochore components
RNAi Nuf2, Ndc80Hec1
in HeLa cells
Decreased levels of Mad1 and Mad2 targeting
to kinetochores restored by nocodazole depolymerization of microtubules.
22,30
RNAi Nuf2 in HeLa cells
For penetrant depletions, Mad1 and Mad2
targeting is abolished. Kinetochore localization is not restored upon
nocodazole treatment.
[36]
RNAi Spc24, Spc25 in HeLa cells
Loss of outer kinetochore proteins,
including Mad1 and Mad2, is mostly restored after nocodazole treatment.
[23]
RNAi Nuf2, Spc24, Spc25 in HeLa cells
RNAi of Nuf2 [30]
or Spc25 [22]
abolishes Ndc80 binding at kinetochores. RNAi of Spc24 abolishes
kinetochore targeting of Spc25 and vice versa [23].
Localization is not restored upon nocodazole treatment.
22,23,30
Mitotic
progression and morphology
X.
laevis
Ndc80 Nuf2 Spc24 Spc25
Injection of ?-Nuf2, ?-Ndc80 into XTC cells
Failure of chromosome alignment and
segregation. Cells exit mitosis prematurely, presumably because spindle
checkpoint is inactive. Spindle checkpoint is also inactivated in egg
extracts following immunodepletion.
[20]
Injection of ?-Spc24, ?-Spc25 into S3 cells
Chromosome alignment and segregation
defects. Decreased inter-kinetochore distances. Active spindle
checkpoint.
[23]
Targeting
of kinetochore components
Immunodepletion of Nuf2, Ndc80 from egg
extracts
Multiple outer kinetochore proteins fail to
target in immunodepleted extracts.
[20]
Mitotic
progression and morphology
C.
elegans
Ndc80 Nuf2HIM-20
Spc25KBP-3
RNAi of Ndc80, Nuf2HIM-20
Chromosome–microtubule
attachments form, but congression and segregation are aberrant. Ndc80,
Nuf2, and Spc25 are part of a larger KNL-2/3 complex, which includes
Mis12 and 6 novel kinetochore proteins [21].
18,21
nuf2him-20
mutant
Defective chromosome alignment and
disrupted kinetochore structure, as assayed by EM of high pressure
frozen embryos.
[11]
Mitotic
progression and morphology
S.
cerevisiae
Ndc80 Nuf2 Spc24 Spc25
ndc80,
nuf2
mutant and degron alleles
Disrupted kinetochore–microtubule
binding. Aberrant centromere movements. Active spindle checkpoint.
Most kinetochore proteins localize in ChIP
assays, except Stu2 and the Dam complex (both require microtubules to
target to kinetochores 34,35.
12,28,29,31,32.
spc24,
spc25 mutants
Most kinetochore proteins localize in ChIP
assays [12];
Bub1 and Mad2 do not in spc25
mutants [32].
12
and 32.
Mitotic
progression and morphology:
S.
pombe
Ndc80 Nuf2 Spc24 Spc25
nuf2
mutants
Allele-specific effects on spindle length
and spindle checkpoint activity. Defects in centromere motility and
chromosome segregation.
13
and 17.
Defects in mitotic progression, spindle and
kinetochore morphology, and targeting of kinetochore components are
organized above according to experimental system and inhibitory method.
H. sapiens, Homo sapiens; S.
cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae;
S. pombe, Schizosaccharomyces
pombe; X. laevis, Xenopus laevis.
Please see text for comments.
Дефекты комплекса Ndc80 нарушают соединение кинетохор с микротрубочками, congression хромосом и сегрегацию хромосом во всех системах, которые были проанализированы, хотя лежащие в основе причины вызывают споры (Table 1). В дополнение к техническим вариациям между исследованиями, особенно в отношении RNAi в клетках млекопитающих, трудности в определении роли в сборке внешних кинетохор по отношению к непосредственной роли во взаимодействиях между кинетохорами и микротрубочками, по-видимому, лежат в основе большинства кажущихся противоречивыми заключениями. Недавние находки в клетках тканевой культуры почкующихся дрожжей и эмбрионов Caenorhabditis elegans показали, что поставка большинства внешних кинетохорных белков в основном защищена после разрушения Ndc80 комплекса белков, хотя уровни некоторых белков spindle checkpoint снижаются12,15,18,21-23,27-32. (Table 1). Напротив, хромосомы, собранные в экстратах яиц Xenopus, иммуноистощенных по Ndc80 и Nuf2 неспособны локализовать множественные компоненты внешних частей кинетохор [20]. Однако, т.к. эти дефекты сборки не восстанавливаются с помощью очищенных белков, то возможность, что они являются результатом деплеции дополнительных взаимодействующих белков не может быть исключена [20] (Table 1). Недавние исследования на metazoans идентифицировали более крупную сеть законсервированных взаимодействующих белков, которые включают Ndc80 комплекс, что делает эту возможность вполне вероятной [21]. У почкующихся дрожжей мутационная инактивация субъединиц Ndc80 комплекса приводит в результате к неспособности белков, связывающих микротрубочки, таких как Dam1 комплекс и Stu2, чтобы связаться с кинетохорами, как показывает иммунопреципитация хроматина28,29,32,33; однако, ни Dam1 комплекс, ни Stu2 не могут ассоциировать с центромерной ДНК в отсутствие микротрубочек34,35 (Table 1). Т.о., очевидные дефекты сборки вследствие ингибирования функции комплекса Ndc80 скорее всего являются следствием дефектов в формировании стабильных прикреплении микротрубочек.
Некоторые линии доказательств указывают, прикрепления микротрубочек могут формироваться, когда белки комплекса Ndc80 истощены, но эти прикрепления нестабильны и не могут поддерживать congression и сегрегацию хромосом. В клетках позвоночных, деплетированных по Nuf2 или Ndc80Hec1, неспособны формироваться стабильные волокна микротрубочек кинетохор, но белки kinetochore checkpoint, такие как Mad1 и Mad2, всё ещё существенно деплетированы в кинетохорах15,19,20,22,23,25,27,30 (Table 1). Интересно, что индуцированная лекарствами деполимеризация микротрубочек восстанавливает поставку Mad1 и Mad2 до нормальных уровней, указывая тем самым, что кинетохоры. собираемые в Nuf2- или Ndc80Hec1-depleted клетках, полностью способны связывать КПП (checkpoint) белки22,30. Однако недавнее исследование показало, что с более пенетрантными делециями Nuf2 и Ndc80Hec1 checkpoint белки неспособны находить кинетохоры даже после деполимеризации микротрубочек [36o] (Table 1). Хотя имеющиеся данные исключают стоихометрическую роль для комплекса Ndc80 в поставке checkpoint белков, расхождения между разными исследованиями RNAi клеток млекопитающих остаются непонятными.
Зависящая от микротрубочек редукция checkpoint белков на кинетохорах истощает белки Ndc80 комплекса, указывая тем самым, что эти кинетохоры могут формировать временные, тем не менее нестабильные, прикрепления к микротрубочкам (Рис. 1). В подтверждение этой идеи ЭМ анализ Nuf2-depleted клеток показал, что внешняя морфология кинетохор сильно изменена и количество встроенных плюс концов микротрубочек драматически уменьшается в этих клетках [25]. Более того, анализ эмбрионов C. elegans показывает, что частично хромосомы выстраиваются и сегрегация всё ещё происходит у эмбрионов, лишенных Ndc80, Nuf2HIM-20 или Spc25KBP-3, хотя соединения между хромосомами и веретеном механически нестабильны18,21 (Table 1). Напротив, полная неспособность расхождения хромосом происходит у эмбрионов. лишенных наиболее проксимальных к хроматину компонентов кинетохор, CENP-AHCP-3 и CENP-CHCP-418,37.
В целом эти результаты указывают на то, что комплекс Ndc80 не действует как поддержка поставки белков для кинетохор, а скорее играет критическую роль по стабилизации прикреплений микротрубочек путем поддержания структурной интеграции сайтов связывания для плюс концов микротрубочек к внешним частям кинетохор [25]. Определение, как комплекс Ndc80 взаимодействует с др. компонентами кинетохор д. дать более детальное понимание, как механически стабильные прикрепления микротрубочек формируются и поддерживаются. Напр., недавние исследования C. elegans идентифицировали два новых компонента кинетохор, KNL-2 и KNL-3, которые необходимы для поставки комплекса Ndc80 на кинетохоры18,21. Кроме того, оба белка биохимически ассоциируют с компонентами комплекса Ndc80 и это взаимодействие консервативно ив клетках человека18,21. Совместный анализ in vivo и in vitro комплекса Ndc80 и более крупной KNL-2/3 взаимодействующей белковой сети д. помочь в расшифровке того, как формируются стабильные соединения kinetochore-microtubule.
Growth of kinetochore-attached microtubules
Рост микротрубочек кинетохор путём добавления тубулина к кинетохоре является важным для движения хромосом перед анафазой. Пример такого типа роста наблюдается во время congression хромосом в метафазную пластинку, когда деполимеризация микротрубочек на ведущих кинетохорах связана с полимеризацией на отстающих кинетохорах1,38. Кинетохоры содержат множественные белки, которые могут способствовать росту микротрубочек (напр., 39-48), хотя физиологические вклады этих белков в динамику kinetochore-microtubule не определены. Недавно идентифицировано семейство CLASP microtubule-associated proteins (MAPs), которое включает CLASP1 человека49,50 и MAST/Orbit у Drosophila51,52, как потенциальных регуляторов динамики kinetochore-microtubule. CLASPs локализуются вблизи плюс концов микротрубочек и стабилизируют микротрубочки, когда избыточно экспрессируются, как GFP-слитые белки в интерфазных клетках49,50. CLASPs локализуются также на кинетохорах независимым от микротрубочек способом и являются наиболее наружными идентифицированными кинетохорными белками50,52. Ингибирование активности CLASP с помощью инъекций антител или RNAi не предупреждает формирование соединений между кинетохорами и микротрубочками, а скорее ведет к укорочению кинетохорных микротрубочек и к супрессии осцилляций хромосом50,52. Хотя в точности неясно, как динамика кинетохорных волокон нарушается в таких клетках, имеющиеся данные указывают на то, что CLASPs стимулируют рост прикрепленных к кинетохорам микротрубочек (Рис. 2a). Эта идея подтверждается способностью лекарств, способствующих росту микротрубочек, устранять дефекты коротких кинетохорных микротрубочек в CLASP-ингибированных клетках50,52.
Выяснение того, как связанные с кинетохорами CLASP регулируют динамику микротрубочек, может дать информацию о молекулярных механизмах группировки хромосом и вообще о др. проявлениях роста микротрубочек на кинетохорах, таких как во время истока (flux) микротрубочек [53]. Добавление tubulin к концам микротрубочек, присоединенных к кинетохорам, также может подтверждать интегральное участие в сборке митотического веретена. Эта идея возникла недавно благодаря наблюдениям направленного наружу роста кинетохорных микротрубочек на неприкрепленных кинетохорах, расположенных лицом в др. сторону от веретена. Кинетохорные волокна, формируемые таким образом, транслоцируются в направлении полюсов, соединяя хромосомы в полюсами веретена [54oo]. Этот феномен происходит как в соматических клетках, восстанавливающихся после воздействия леарств, которые предупреждают разделение полюсов веретена, так и в необработанных клетках, указывая тем самым, что клетки обладают путем, базирующемся на кинетохорах, формирования кинетохорных микротрубочек, который независим от улавливания микротрубочек, исходящих из центросом [54]. Кроме того эксперименты по рассечению лазером, проведенные на сперматоцитах кузнечиков, показали, что кинетохорные волокна могут расти из кинетохор и д. достигать полюсов веретена, прежде чем произойдет сегрегация хромосом [55]. В общем, эти исследования указывают на то, что кинетохорами обеспечиваемый рост микротрубочек является внутренне присущей активностью кинетохор в сложных системах, где она может играть роль по прикреплению хромосом к веретену и/или по перемещению хромосом к веретену.
Depolymerization of kinetochore-attached microtubules
Деполимеризация микротрубочек на кинетохорах является, как полагают, необходима для направленного к полюсам движения во время выстраивания и расхождения хромосом1,38. Наиболее логичными кандидатами на такие активности являются члены семейства kinesin-23 (первоначально названные Kin I kinesins) [56], которые обладют стимулируемой концами микротрубочек ATPase активностью, чтобы индуцировать деполимеризацию любого из концов микротрубочек57-60. Во время митозов kinesin-23 белки локализуются на кинетохорах и на центромерных областях между сестринскими кинетохорами61,62. Kinesin-23 белки определенно необходимы для соответствующего позиционирования хромосом на веретене у позвоночных и беспозвоночных61-65, хотя их точная роль на кинетохорах пока спорна. Анализ эмбрионов Drosophila указывает на то, что Klp59C, один из двух kinesin-23 белков у этого организма, остается ассоциированным с анафазными кинетохорами, где он может играть роль в деполимеризации ассоциированных с кинетохорами микротрубочек [64] (Рис. 2b). Однако, ингибирование MCAK, a kinetochore-localized kinesin-23 в клетках позвоночных не нарушало скорости движения в направлении полюсов хроматид во время анафазы [62o]. Будущие работы по анализу всего семейства kinesin-23 белков у позвоночных необходимы для примирения этих наблюдений и понимания того, как kinesin-23 белки участвуют в перемещении хромосом в направлении полюсов.
Во время митозов у почкующихся дрожжей, деплеция связывающего микротрубочки белка Stu2 супрессирует динамику микротрубочек веретена, включая и кинетохорные микротрубочки и в результате возникают неподвижные центромеры66,67. Кинетохоры не нужны для стабилизации микротрубочек веретена, наблюдаемой в Stu2-depleted клетках, это указывает на то, что Stu2 влияет на динамику микротрубочек посредством независимого от кинетохор механизма [66]. Эти находки указывают на то, что Stu2 может дестабилизировать микротрубочки in vivo, идея, которая подтверждается исследованиями in vitro, демонстрирующими, что рекомбинантный Stu2 может способствовать деполимеризации микротрубочек [68o] несмотря на свое сходство с белками семейства XMAP215/TOG, которые строго способствуют росту микротрубочек in vivo и in vitro [69]. Неожиданно, оказалось, что XMAP215 также дестабилизирует микротрубочки при специфических условиях in vitro [70], подчеркивая тем самым разнообразие потенциальных взаимодействий между микротрубочками и членами этого MAP семейства [71]. Затрагивают ли ортологи Stu2 позвоночных динамику kinetochore-microtubule, является важным вопросом, адресованным к будущему. Важно также отметить, что белки, такие как kinesin-23 depolymerases и XMAP215/TOG являются выдающимися глобальными регуляторами динамики микротрубочек и двуполярности веретена65,72-79. Следовательно, потенциальные непрямые эффекты их ингибирования д. приниматься во внимание во время фенотипического анализа и могут лежать в основе кажущихся противоречивых результатов исследований в разных системах или при использовании разных методов ингибирования.
Ensuring proper chromosome orientation through regulation of kinetochore-microtubule attachments
На всём протяжении митозов, существует потенциал для неподходящих соединений кинетохор с микротрубочками, которые д. б. устранены, чтобы предупредить неправильное расхождение и анеуплоидию [80]. Соответствующие соединения д. давать bi-oriented хромосомы, при этом одна кинетохора связана исключительно с микротрубочками, исходящими из одного полюса веретена, тогда как её сестринская кинетохора связана с противоположным полюсом веретена. Такие би-ориентиованные соединения приводят в результате к натяжению между двумя сестринскими кинетохорами [81]. Aurora B kinase (Ipl1 у почкующихся дрожжей) появляется в последних работах как основной регулятор, участвующий в коррекции неправильных соединений кинетохор с микротрубочками. Aurora BIpl1, как полагают, способствует би-ориентации путем рассоединения прикреплений микротрубочек к кинетохорам, которые не находятся под натяжением82-85. Исследования с помощью ингибирующих антител и ингибирования малыми молекулами указывают на то. что эта роль Aurora B законсервирована в клетках позвоночных86-90. Менее ясно, как Aurora BIpl1 распознаёт натяжение, создаваемое, когда достигается собственно би-ориентация, хотя микроманипуляции с кинетохорами сперматоцитов подтверждают идею, что химические свойства кинетохор, такие как фосфорилирование, могут меняться в ответ на натяжение91,92. Биохимический и генетический анализ показывают, что мультибелковый комплекс Dam1, который законсервирован у грибов, но не идентифицирован ещё где-либо, является ключевой мишенью для Aurora BIpl1 [93]. В точности, как Aurora BIpl1-обеспечиваемое фосфорилирование комплекса Dam1 затрагивает прикрепление микротрубочек к кинетохорам и как эта регуляция селективно доставляется к соединениям, которые не находятся под натяжением, остаётся важным не решенным вопросом.
Двойной ориентации хромосом способствует также слипчивый белковый комплекс, который соединяет сестринские хроматиды и поддерживает натяжение между кинетохорами (inter-kinetochore)94,95. Неожиданно у почкующихся дрожжей любой тип соединения между сестринскими хроматидами, которые способны противостоять натяжению, мог способствовать би-ориентации [83]. Сходным образом, в клетках позвоночных дефекты выстраивания хромосом, вызываемые истощением cohesin, устраняются с помощью сопутствующего ингибирования topoisomerase II, чтобы генерировать удаленный тип физического сцепления с помощью catenation нитей сестринских ДНК [96]. Эти находки указывают на прямую связь между механикой и биохимией интерфейса кинетохора-микротрубочки, идея, в дальнейшем подтвержденная недавними данными по идентификации кинетохорного белка Sgo в качестве стабилизирующего микротрубочки белка и защитника слипчивых сил между сестринскими центромерами [97]. Понимание того, как генерируется центромерное натяжение, будет ключом по выяснению того, как Aurora BIpl1p действует на интерфейс kinetochore-microtubule, чтобы способствовать отсоединению (у почкующихся дрожжей, [83]) или деполимеризации кинетохорных волокон (в клетках позвоночных, [90]) как механизма для устранения некорректных присоединений микротрубочек.
У всех эукариот, Aurora B обнаруживатся в комплексе с INCENP и Survivin [98]. Этот очень консервативный комплекс хромосомных пассажиров обнаруживает динамическую локализацию на внутренней части центромеры в раннем митозе и в срединной зоне веретена вследствие перехода от метафазы к анафазе. Идентифицированы новые компоненты этого комплекса у metazoans, названы CSC-2 у C. elegans [99] и Dasra A и Dasra B/Borealin у позвоночных100,101. Недавние работы подтвердили, что помимо своей роли в обеспечении би-ориентации, комплекс хромосомных пассажиров вносит также вклад в сборку веретена89,100,101. У позвоночных потенциальная связь между Aurora B и коррекцией аберрантного прикрепления kinetochore-microtubule и регуляцией морфологии веретена посредством регуляции деполимеризующего микротрубочки kinesin MCAK, члена семейства kinesin-23. Инактивация MCAK ведет к очень сильным аберрантным соединениям кинетохор-микротрубчки [62] и дефектам морфологии веретена [102]. Aurora B фосфорилирует MCAK, способствуя его локализации на центромере и ингибированию его активности по деполимеризации микротрубочек (Рис. 3) 103-105. Кроме того, будучи негативно регулируемой с помощью Aurora B, активность MCAK позитивно регулируется in vitro с помощью ICIS, который может работать в комбинации с MCAK, чтобы деполимеризовать микротрубочки, контактирующие с центромерным доменом между сестринскими кинетохорами [106]. Всё это вместе с недавими открытиями указывает на то, что деполимеризующая активность MCAK является объектом высокой степени локальной регуляции вблизи интерфеса (обращенных др. к др. сторон) кинетохора и микротрубочек (Рис. 3). В дальнейшем необходимо исследовать, как инактивация MCAK с помощью Aurora B и стимуляция MCAK с помощью ICIS динамически используются, чтобы стабилизировать или дестабилизировать кинетохорные микротрубочки во время выстраивания хромосом и коррекции прикреплений.
По иронии, механизм регуляции прикрепления с помощью Aurora B может быть одной из причин, почему трудно определить в точности, как формируются и поддерживаются стабильные соединения kinetochore-microtubule. Эта sjpvj;yjcnm иллюстрируется у мутантов почкующихся дрожжей по законсервированному кинетохорному белку Mis12Mtw1, которые содержит не прикрепленные хромосомы [84]. Этот дефект устраняется, если одновременно ингибируется Aurora BIpl1, это указывает на то, что активная Aurora BIpl1 разъединяет дефектные соединения кинетохора с микротрубочками у мутантов Mis12Mtw1 [84]. Эта находка подтверждает, что ингибирование Aurora BIpl1 может помочь расшифровать молекулярные основы соединений kinetochore-microtubule. Это подчеркивает также сложность регуляторных процессов на кинетохорах, которые необходимо учитывать при анализе различных дефектов расхождения хромосом.
Conclusions and future directions
Dissecting the mechanisms that regulate kinetochore assembly and modulate kinetochore–microtubule attachments is essential to understand chromosome segregation. This will require the combination of precise molecular perturbations with high-resolution assays in living cells. Such efforts will probably be facilitated by recent advances in microscopy [107] and by the emergence of RNA interference and chemical inhibition as new specific methods for disrupting the functions of essential proteins in metazoans. Together, advances in molecular perturbation techniques and the development of increasingly sophisticated assays are gradually bringing the complexities of kinetochore structure and function into focus.
Update
Recent analyses in S. pombe and human cells [108] support work in C. elegans and human cells [21••] indicating the existence of a complex of Mis12Mtw1–interacting proteins required for chromosome segregation. In humans, a complex isolated from interphase nuclear extracts included the heterochromatic proteins HP1? and HP1?, suggesting a molecular link between kinetochore proteins and centromeric heterochromatin [108].
Two recent papers extend analyses of kinetochore-driven kinetochore fiber assembly. Photobleaching and laser-mediated kinetochore fiber cutting experiments in Drosophila tissue culture cells indicate that fiber growth can initiate from ‘naked’ kinetochores and connect the kinetochore to the spindle pole via kinetochore-proximal tubulin addition [109]. Interestingly, the microtubule-associated protein CLASP is not required for the initial formation or elongation of kinetochore fibers but is required for polymerization at kinetochores once the fibers reach the pole and initiate flux [110]. This finding indicates the existence of distinct mechanisms that contribute to tubulin addition at kinetochores, and establish CLASPs as integral players in kinetochore fiber dynamics [110].
Sharsti Sandall and Arshad Desai
