Посещений:
Поздние Митотические События

Координация

Linked for life: temporal and spatial coordination of late mitotic events
Anupama Seshan and Angelika Amon (angelika@mit.edu)
Current Opinion in Cell Biology Volume 16, Issue 1 , February 2004, Pages 41-48




Рис. из статьи "Cdc5 influences phosphorylation of Net1 and disassembly of the RENT complex"  |  Role of Cdc5 in exit from mitosis. Cdc5 may promote Cdc14 early anaphase release (FEAR) in part by phosphorylating Net1 directly (dotted arrow), and by activating an unknown Cdc14 dissociation factor (X). Subsequent activation of the MEN is important to sustain the transient Cdc14 release effected by the FEAR pathway. In the absence of MEN activity, Cdc14 returns to the nucleolus and cells arrest in late anaphase (bottom right). In the presence of MEN activity, Clb/CDK is shut off and cells exit mitosis (top right). The mechanism of action of MEN remains unknown, but activation of MEN correlates with appearance of Cdc14 in the cytoplasm , and mutation of known nuclear transport regulators renders mitotic exit independent of CDC15 function [35]. Together, these observations suggest that the MEN may promote exit by biasing the nucleocytoplasmic distribution of Cdc14. In addition to its role in the FEAR pathway, Cdc5 impinges positively on the MEN by several mechanisms, including: (i) Cdc5 promotes Tem1 activation by promoting chromosome segregation [22], which by enabling optimal spindle elongation and penetration into the bud, helps satisfy the spindle positioning checkpoint [12]; (ii) Cdc5 promotes activation of Tem1 GTP-binding protein by inhibiting its negative regulator, the Bfa1/Bub2 GTPase-activating protein [29], and (iii) Cdc5 promotes activation of Dbf2 by an unknown, BUB2-independent mechanism (dashed line) [18].



A model on cytokinesis in budding yeast.



Protein degradation regulates exit from mitosis. Anaphase is initiated when the securin proteins are targeted for ubiquitination and subsequent degradation by the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome. The cell exits mitosis and returns to interphase when cyclins are destroyed by a similar mechanism. We are using small molecule inhibitors of the ubiquitination reaction to study this pathway in mammalian cells.

Во время митозов начало сегрегации хромосом, выход из митоза и цитокинез находятся под контролем надзирающих механизмов (checkpoints) и связаны др. с др. для достижения временной и пространственной координации. Рассмативаются недавние находки у почкующихся и делящихся дрожжей, а также у Drosophila melanogaster и млекопитающих.

Temporal controls


Coupling chromosome segregation and exit from mitosis


Механизмы инициации сегрегации хромосом во время перехода от метафазы к анафазе законсервированы от дрожжей до человека [1.](Рис. 1). Протеаза, известная как Separase расщепляет компоненты комплекса cohesin (Scc1/Mcd1 у Saccharomyces cerevisiae, Rad21 у S. pombe и D. melanogaster и Scc1 у людей), которые удерживают сестринские хромосомы вместе. В этом процессе Separase помогает киназа Polo. Polo kinase фосфорилирует мишени Separase в комплексе cohesin, и тем самым способствует их расщеплению [2-4].



Figure 1. Components of the FEAR network regulate both the metaphase–anaphase transition and the exit from mitosis in yeast. The metaphase–anaphase transition is triggered by the destruction of cohesin, the glue that holds sister chromatids together. Securin inhibits Separase, which cleaves the cohesin subunit Scc1/Mcd1, thereby allowing sister chromatids to separate. Polo kinase aids in the dissolution of sister chromatid cohesion by phosphorylating Scc1/Mcd1. Separase and Polo also promote exit from mitosis by initiating the release of Cdc14 from the nucleolus during early anaphase as part of the FEAR network. Additional components of the FEAR network are the kinetochore protein Slk19, and Spo12/Bns1, proteins of unknown function. A pathway known as MEN promotes and maintains Cdc14 in the released state during late anaphase. The MEN components Tem1 (a GTPase), Bub2/Bfa1 (a two-component GTPase-activating complex), Cdc15 (a protein kinase), Dbf2 and Dbf20 (homologous protein kinases) and Mob1 (a Dbf2-associated factor) are anchored at the SPB by a scaffold protein Nud1. The putative GEF Lte1 is sequestered in the newly forming daughter cell. Components of the FEAR network are highlighted in blue and MEN pathway components in pink. As some FEAR network components are known to regulate sister-chromatid separation, the FEAR network may ensure that exit from mitosis is not initiated before sister-chromatid separation.

Выход из митоза происходит после завершения расхождения хромосом и связан с разборкой митотического веретена и деконденсацией хромосом. Инактивация митотических cyclin-dependent kinases (CDKs), протеин киназ, которые способствуют вступлению в митоз, по-видимому, необходима для подобного перехода и происходит у всех изученных видов (Рис. 1). Инактивация митотической CDK преимущественно достигается с помощью ubiquitin-зависимой деградации регуляторной субъединицы cyclin.
У почкующихся дрожжей митотическая инактивация CDK , а , следовательно, и выход из митоза, нуждается в двух регуляторных сетях: сеть Cdc14 early anaphase release (FEAR) и сеть mitotic exit network (MEN; Рис. 1). Обе сигнальные сети контролируют активность протеин phosphatase Cdc14, которая инициирует митотическую CDK инактивацию путём реверсии CDK-зависимого фосфорилирования [5.]. Вновь идентифицированная сеть FEAR активирует Cdc14 во время ранней анафазы, тогда как MEN, которая напоминает Ras-подобный сигнальный каскад, стимулирует активность Cdc14 во время поздней стадии анафазы и в телофазе [5-8].
Почкующиеся дрожжи гарантированы, что выход из митоза не произойдет до разделения хромосом за счёт использования тех же самых белков для обоих процессов. Separase (у почкующихся дрожжей Esp1) и polo kinase (Cdc5), обе запускают расхождение хромосом и являются компонентами сети FEAR ([1,6,8,9]; Рис. 1). Участвуют или нет др. компоненты сети FEAR в связывании аспектов расхождения хромосом с выходом из митозов, неизвестно. Однако, м. предполагать, что компонент сети FEAR Slk19, который принадлежит к семейству белков пассажиров [10], м.б. вовлечен в гарантии, что кинетохоры будут задействованы на митотическом веретене до выхода из митоза. Passenger proteins локализуются на кинетохорах во время метафазы и на средней зоне веретена во время анафазы и м. , следовательно, участвовать в передаче сигналов между этими двумя структурами. В клетках млекопитающих хромосомные passenger белки, такие как inner centromere protein (INCENP) и aurora-B kinase, также обладают той же самой динамичной локализацией во время клеточного цикла, а мутанты лишенные этих белков, имеют дефекты как в расхождении хромосом, так в цитокинезе [11]. Т.о., они м. действовать сходным образом с сетью FEAR в координации правильной сегрегации хромосом с поздними митотическими событиями.

Coupling exit from mitosis and cytokinesis


Механизм, который гарантирует клеткам, что митоз не будет закончен до начала цитокинеза, хорошо изучен у делящихся дрожжей. Septation initiation network (SIN), путь гомологичный MEN, обеспечивает цитокинез у S. pombe, а его ингибирование с помощью митотических CDKs гарантирует, что пути не будет активным вплоть до тога, пока митотические CDKs не будут инактивированы [12]. Митотические CDKs ингибируют активацию SIN, предупреждая локализацию SIN киназы Sid1p на spindle pole body (SPB), функциональном эквиваленте у дрожже центросом [13,14]; (Рис. 2a). И как результат, протеин киназа Sid2p, которая функционирует ниже Sid1p, не способна транслоцироваться с SPB в место образования перегородки и цитокинез ингибируется [13,14].



Figure 2. CDK inactivation promotes MEN and SIN function at the site of septation. (a) The SIN in S. pombe regulates septum formation. It is composed of the scaffold protein Cdc11p, the GTPase Spg1p, the two-component GAP Byr4p/Cdc16p, the kinases Cdc7p, Sid1p and Sid2p and the Sid1p- and Sid2p-associated proteins Cdc14p and Mob1p, respectively. SIN components localize to SPBs but shortly before septum formation Sid2p and Mob1p associate with the site of septum formation. Mitotic CDKs inhibit the localization of Sid1p to the SPB, thereby preventing the translocation of Sid2p/Mob1p to the septum site. Mitotic CDKs may also prevent the activation of Spg1p. (b) The MEN regulates mitotic exit in S. cerevisiae, but components of the MEN may also regulate cytokinesis. Mitotic CDK inactivation is a prerequisite for the relocation of the MEN kinases Dbf2 and Dbf20 and perhaps Mob1 from the SPB to the mother–bud neck, the site of septum formation. Homologous MEN and SIN components are presented in similar colors.

Существенной ролью SIN является инициация образования перегородки после инактивации митотических CDK, хотя SIN способна также ингибировать митотические CDKs при некоторых условиях [15,16]. Напротив, MEN существенен как для выхода из митоза. так и для цитокинеза [5,12]. Недавние находки показали, что MEN играет непосредственную и существенную роль в разделении дочерних клеток после завершения митоза. Установлено, что MEN протеин киназы Cdc5, Cdc15, Dbf2 и Dbf20, а также Dbf2-ассоциированный фактор Mob1 локализуются на SPB во время выхода из митоза и в шейке почки во время цитокинеза [17-20]. Наблюдалось, что мутанты mob1-77, которые избыточно экспрессируют CDK ингибитор SIC1, смягчая , следовательно, необходимость в MOB1 при выходе из митоза, по-прежнему имеют нарушения цитокинеза [21]. MEN участвует также в регуляции динамики septin кольца. Dobbelaere et al. [22] наблюдали, что septin кольцо 'жидкое' во время появления почки и телофазы, с подвижностью компонентов внутри структуры кольца. Текучесть кольца появляется во время телофазы, необходима для позднего события в цитокинезе и также нуждается в активности MEN [22]. Эти данные указывают на прямую независимую от выхода из митоза роль MEN в цитокинезе. Т.о., очевидно, что использование одних и тех же белков для завершения последовательных событий является повторяющейся темой в регуляции клеточного цикла у почкующихся дрожжей.
MEN необходимы для инициации цитокинеза, но существуют ли почкующиеся дрожжи, подобные S. pombe, у которых инактивация митотической CDK является предварительным условием цитокинеза? Исследования Lim et al. [23] указывают на то, что это так. Dbf2 и родственный белок Dbf20 (оба гомологи Sid2p) локализуются на шейке между материнской клеткой и почкой, что сопровождается инактивацией mitotic CDK (Рис. 2b). Более того, инактивация митотической киназы необходима для транслокации Dbf2 и Dbf20 в шейку почки. Напротив, эктопическая инактивация CDKs достаточна для обеспечения ассоциации Dbf2 и Dbf20 с шейкой почки [23]. Перемещение Dbf2/Sid2p с SPB на место цитокинеза скорее всего является важной ступенью для совершения цитокинеза и законсервировано у дрожжей. Более того, зависимость этой транслокации от инактивации CDK подтверждает существование элегантного механизма, гарантирующего, что цитокинез будет следовать за выходом из митоза. Но необходим анализ мутантов Dbf2/Sid2p, которые бы были устойчивы к ингибированию CDKs, и мутации, неспособные локализовать место образования перегородки.
У высших эукариот инактивация митотических CDK также, по-видимому, является обязательным условием цитокинеза. У плодовых мушек D. melanogaster, Pebble, RhoA GEF, инициирует образование цитокинетической борозды с помощью активации пути RhoA и индукции реорганизации актина на месте деления. Echard and O'Farrell [24] нашли, что две митотические CDKs, cyclin-B-CDK и cyclin-B3-CDK, д.б. инактивированы, чтобы сделать возможной активацию Pebble и образование борозды. Клетки млекопитающих, которые экспрессируют формы митотических CDKs, которые не м.б. инактивированы, также неспособны к цитокинезу, это подчёркивает возможость того, что этот механизм связи цитокинеза с инактивацией митотических CDKs законсервирован и в царстве эукариот [25.].

Spatial controls


Деление клетки нуждается не только в событиях, которые происходят в точной временной последовательности, но и в точном их расположении в месте деления. Чтобы гарантировать, что дочерние клетки получат одинаковые наборы ДНК, место деления д.б. должно разделять пополам митотическое веретено. У делящихся дрожжей и высших эукариот, место деления предопределяется положением митотического веретена и передачей сигналов между клеточной мембраной и аппаратом митотического веретена, что важно для скоординированного расхождения хромосом и цитокинеза в пространстве. У S. cerevisiae, место деления предетерминируется и , следовательно, собственно ориентация аппарата веретена в шейке между материнской клеткой и почкой до разборки митотического веретена и цитокинеза, является критической для точности сегрегации хромосом

Coupling mitotic exit with nuclear position


Из-за своего необычного паттерна деления (почкования), S. cerevisiae оказывается перед задачей необходимости удерживания ядра в шейке между материнской клеткой и почкой до выхода из митоза. Поэтому неудивительно, что существуют механизмы, которые предупреждают выход из митоза до тех пор, пока почка, будущая дочерняя клетка, не получит понный комплект ДНК. Тот факт, что позиция ядра находится под надзором , впервые установлен на дрожжевых клетках, дефектных по сборке microtubule-capture machinery в кортексе почки, которая ориентирует митотическое веретено вдоль оси мать-дочь. Мутации в компонентах этого комплекса (таких как дрожжевой dynein гомолог DYN1/DHC1) вызывают дефекты в ориентации веретена, обусловливающие удлинение веретена в материнской клетке [26,27.]. Активность надзирающего механизма, называемого 'spindle orientation checkpoint' блокирует выход из митоза до тех пор, пока веретено не установится правильно ( [26,28]; Рис. 3a).



Figure 3. Mechanisms sensing nuclear position in S. cerevisiae. (a) In the absence of dynein (dyn1?), 10% of cells have mispositioned spindles such that spindle elongation takes place entirely within the mother cell. These cells do not exit from mitosis until the spindle has been properly re-oriented due to the activity of the spindle position checkpoint. The spatial segregation of the mitotic exit activators Tem1 and Lte1 until the migration of the Tem1-bearing SPB into the bud, or daughter cell, is important for preventing inappropriate mitotic exit in cell with misaligned spindles. Cells with misoriented spindles that are defective for Lte1 localization (sep7? or overexpression of LTE1 [GAL–LTE1]) exit from mitosis and accumulate anucleate and multi-nucleate cells. (b) Astral microtubules traversing the mother–bud neck may act as a signal for misaligned spindles and activate a checkpoint that blocks inappropriate mitotic exit. This checkpoint, we speculate, could function by activating the Tem1 GAP Bub2/Bfa1 and thereby inhibit MEN activity. The septin CDC10 may act as a scaffold for a sensor of astral microtubules passing through the mother–bud neck as in the absence of CDC10 such cells are able to exit from mitosis inappropriately in an LTE1-independent manner.

Один из механизмов, которые помогает предупредить выход из митоза в клетках с неправильно распложенным веретеном, является пространственная сегрегация компонентов MEN. Lte1, который действует как активатор Tem1 и напоминает guanine exchange factor (GEF), оказывается секвестрированным в кортексе почки одновременно с образованием почки, т.к. Tem1 локализуется специфически в связанном с дочерней клеткой SPB [29,30]. Tem1 и Lte1 только тогда приходят в контакт, когда связанное с дочерней клеткой SPB перемещается в почку во время анафазы [29,30]. Пространственное ограничение Tem1 и Lte1 важно для предупреждения выхода из митоза в клетках с неправильно расположенным веретеном. С этим согласуется то, что избыточная экспрессия LTE1, которая приводит к тому. что белок присутствует как в материнской, так и дочерней клетке, это позволяет клеткам с неправильно ориентированным веретеном выходить из митоза [29]. Недавнее исследование покзало, что модуляция локализации Lte1 также вызывает несоответствующий выход из митоза. Castillon et al. [31] нашли, что разрушение septin кольца с помощью SEP7 делеции, позволяет Lte1 протекать в материнскую клетку. В sep7- клетках с неправильно расположенным веретеном, происходит несоотв. выход из митоза LTE1-зависимым способом [31], это указывает на то, что протекание Lte1 в материнскую клетку позволяет клеткам с неправильно ориентированным веретном, выходить из митоза.
Секвестрация Lte1 в почке не только важна для гарантии, что митотический выход не наступит, пока ядро не будет позиционировано соответствующим образом, но также необходимо для эффективного выхода из митоза. В недавних исследованиях идентифицированы белки клеточной полярности, таке как Rho-подобная GTPase Cdc42 и p21-activated protein kinase (PAK)-подобная киназа Cla4, а также Ras, как необходимый для закрепления Lte1 в кортексе почки [32-36]. Интересно, что в отсутствие этих факторов выход из митоза задержан, это указывает на то, что определенное количество Lte1 в почке важно для своевременного выхода из митоза. Однако, в отсутствие методов определения активности для Lte1, нельзя исключить возможность, что эти факторы важны для функции Lte1.
Может ли Lte1 стимулировать функцию Tem1 остаётся неясным. Генетические эксперименты показывают, что Lte1 действует выше Tem1 [37,38]и что два белка взаимодействуют физически [33]. Однако м. ли Lte1 функционировать как GEF для Tem1 неясно. Недавно были получены противоречивые результаты, связанные с необходимостью Lte1's GEF homology домена для выхода из митоза [33,36]. Важно разрешить это расхождение, чтобы выяснить механизм активности Lte1.
Пространственное ограничение Lte1 и Tem1 является не только механизмом, который предупреждает клетки с неправильно ориентированным веретеном от инактивации митотических CDKs. Adames et al. [39] впервые сообщили, что определенные мутанты с дефектами позиционирования веретена, несоответственно выходят из митоза даже, когда делетирован LTE1. Авт. полагают, что астральные микротрубочки, взаимодействующие с шейкой почки действуют как сенсоры положения веретена, т.к. несоответствующий выход клеток с неправильно ориентированным веретеном коррелирует с потерей цитоплазматических трубочек из шейки почки. Castillon et al. [31] разработали эту гипотезу в связи с находкой, что arp1- мутанты, у которых митотическое веретено часто ориентировано неправильно, несоответственно выходят из митоза, когда функция septin кольца шейки мать-почка нарушена в результате инактивации septin CDC10. Уarp1- cdc10- клеток несоответствующий выход из митоза лишь частично предупреждается делецией LTE1. Т.о., CDC10 играет роль в LTE1--зависимом и независимом мониторинге положения веретена [31]. Присутствие микротрубочек в шейке почки м. действовать как сигнал, чтобы показать, что ядро позиционировано неправильно вдоль оси мать-почка, что в свою очередь предупреждает выход из митоза (Рис. 3b). Природа такого пути передачи сигналов неизвестна, но он м. наталкиваться на Tem1's GTPase-активрующий белковый комплекс Bub2/Bfa1 (Рис. 3b). Делеция BUB2 позволяет клеткам с неправильно ориентированным веретеном выходить из митоза [29,30]. Вообще-то передача сигналов, воспринимаемых индикаторами положения ядра, такими как астральные микротрубочки, способствуют активности Bub2-Bfa1, предупреждая тем самым активацию Tem1.
Spindle-position checkpoint? по-видимому, функционирует также и у делящихся дрожжей. Oliferenko and Balasubramanian [40] установили, что мутанты, дефектные по образованию астральных микротрубочек, mia1-, обнаруживают дефекты в ориентации митотического веретена и останавливаются в метафазе пока веретено не расположится правильно вдоль продольной оси клетки. Доказательства spindle position checkpoint получены и в клетках млекопитающих. Эпителиальные клетки крыс, после микроманипуляций, в результате которых веретно располагалось неправильно, задерживалось начало анафазы до тех пор, пока веретено не переориентировалось вдоль длинной оси клетки [41]. В отсутствии dynein, восстановление положения веретена не происходило и задержка клеточного цикла, навязанная неправильным расположением веретена, также, по-видимому, не происходило [41]. Это указывает на то, что в противоположность почкующимся дрожжам dynein, который выступает в качестве триггера spindle position checkpoint, dynein в клетках млекопитающих функционирует не только для коррекции дефектов в положении веретена, но и также необходим для активации checkpoint.
Spindle position checkpoint, однако, по-видимому, не существует у одноклеточных эмбрионов C. elegans. Одноклеточные эмбрионы делятся асимметрично, продуцируя более крупную переднюю и более мелкую заднюю клетки, для этого необходимо асимметричное расположение митотического веретена [42]. Позиционирование веретена нуждается в цитоплазматическом dynein - RNAi-обусловленная потеря у C. elegans гомолога dynein dhc-1 вызывает дефекты в расположении веретена [43]. Однако, ход клеточного цикла, по-видимому, не задерживается в клетках с неправильно ориентированным веретеном в результате происходит случайное неправильное расхождение хромосом [43]. Вообще-то checkpoint в этом примере является излишним из-за препятствий сил яйцевой оболочки эмбриона восстанавливать позицию веретена в большинстве случаевю [43]. Возможно, что spindle position checkpoint, подобно др. КПП, не активен во время эмбриональных клеточных циклов [44,45].

Conclusions and perspectives


It is clear that the FEAR network, MEN and SIN are essential for ensuring temporal and spatial controls during mitosis. However, whether such signaling pathways exist in metazoans is still unknown. Two components of the FEAR network, Separase and Polo kinase, are conserved across species. A role for Polo kinase in triggering sister chromatid segregation and cytokinesis is well established in multicellular organisms [46,47]. Additionally, there are hints in the literature that Separase may also be needed for cell-cycle steps after cohesin removal. RNAi-mediated knock down of Separase function in C. elegans not only prevents sister chromatid separation but also appears to slow down subsequent cell-cycle events [48].
Mammalian homologs of MEN and SIN components have also been identified. Remarkably, in at least one instance the subcellular localization of the homolog as well as its role in regulating late mitotic events appears to be conserved. Centriolin encodes the mammalian homolog of the S. cerevisiae Nud1 protein and S. pombe Cdc11p protein, which act as scaffolds for MEN and SIN components, respectively, at the SPB. Centriolin localizes specifically to the mother centriole, which displays the unique property of moving towards the midbody at the end of mitosis, triggering abscission of the daughter cells. Centriolin is likely to be important for this abscission event to occur, as reducing centriolin expression using siRNA disables cell separation [49]. Interestingly, one isoform of the human homolog of S. cerevisiae CDC14, hCdc14A, localizes to centrosomes during telophase and cells lacking hCdc14A have cytokinesis defects [50]. An attractive hypothesis is that hCdc14A localizes specifically to the mother centriole and plays a role in regulating the events that lead to cell separation. Further insights into the function of mammalian MEN/SIN homologs will elucidate whether mammalian cells use similar mechanisms to coordinate late mitotic events.
Сайт создан в системе uCoz