Diane S Lidke, Peter Nagy, Rainer Heintzmann, Donna J Arndt-Jovin, Janine N Post, Hernan E Grecco, Elizabeth A Jares-Erijman & Thomas M Jovin Enlightened receptor dynamics , 22, 198–203 (February 2004) |
Gal Gur & Yosef Yarden Enlightened receptor dynamics Nature Biotechnology , 22, 169–170 (February 2004) |
Рис.1. | QDs bind and activate EGFR, and are endocytosed into living cells.
Семейство erbB epidermal growth factor (EGF)-regulated receptor tyrosine kinases (RTKs) регулирует разнообразные клеточные процессы и участвет во многих типах рака. Подобно др. RTKs, члены семейства erbB дают и гомо- и гетеродимеры после связывания лиганда. Активированные рецепторы подвергаются эндоцитозу и затем или деградируют или возвращаются обратно в плазматическую мембрану. Визуализация взаимодействий receptor-ligand в живых клетках м. позволить отслеживать динамику рецепторов. Lidke et al. применили quantum dot technique для получения ясных картин ранних стадий предачи сигналов erbB/HER рецепторами в живых клетках.
Флюоресцентные полупроводящие нанокристаллы или quantum dots, были соединены с (EGF-QD) и использованы в комбинации с visible fluorescent protein (VPF)-нагруженными erbB1/2/3 рецепторами. EGF-QDs продуцирует высокий и униформный сигнал, делающий возможной детекцию даже на одиночном nanoparticle уровне. Они специфически соединяли и активировали до того как он подвегнется эндоцитозу посредством покрытых клатрином ямок. Т.о., QD-ligand не затрагивает биологической функции прикрепленного фактора роста. В клетках, экспрессирующих немеченный erbB1 и mCitrine-меченный EGF-QDs связывались и интернализовались в филоподии, оставляя erbB3 сзади. Авт. делали видмыми эти молекулы в реальном времени с помощью конфокальной микроскопии, показавшей, что они движутся ретроградно вдоль актиновых филамент и/или локалзованных на актине моторных белков. Интренализованные EGF-QDs подвергаются эндосомному переносу, обнаруживающему Броуновыское движение, сопровождаемое линейными пермещениями и слияниями пузырьков.
Использование EGF-QDs делает возможны количественный анализ суммарной (coupled) кинетики связывания и интернализации лигада. Кинетика поверхностного связывания обнауживает экспоненциальный ход, но кинетика интернализации была линейной, указывая тем самым на то, что клточная эндоцитотическая кухня (machinery) - но не связывание лиганда - является скорость-ограничивающей ствпенью в эндоцитозе рецептор-лиганд. Путём анализа скорости и степени эндоцитоза EGF-QD, когда -monomeric yellow fluorescent protein (mYFP) или erbB3-mCitrine ко-экспрессировались с erbB1, авт. установили, что гетеродимеризация с erbB2 снижает эндоцитоз erbB1. Это подтверждает, что erbB2 играет существенную роль в качестве ко-рецептора в нормальном и онкогенном состоянии. Напротив, erbB3 не гетеродимеризуется с erbB1 после EGF стимуляции.
Способность отслеживать движения индивидуальных рецепторов в живых клетках с использованием множественных комбинаций QD-ligands м. оказаться неоценимым инструментом в будущем анализе др. рецепторами обеспечиваемых путей сигнальной трансдукции.